Liofilizaçao

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Tecnologia Bioqumico-Farmacutica
rea de Tecnologia da Fermentao
EFEITO DA LIOFILIZAO SOBRE A ESTRUTURA E MUDANAS DE FASE

DA ALBUMINA BOVINA MODIFICADA POR REAO COM METOXI POLIETILENOGLICOL
VIRGILIO TATTINI JUNIOR
Dissertao
para
obteno
do
ttulo
de
MESTRE
Orientador:
Prof. Dr. Ronaldo Nogueira de Moraes Pitombo
So Paulo
2004
UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
Programa de Ps-Graduao em Tecnologia Bioqumico-Farmacutica
rea de Tecnologia da Fermentao
EFEITO DA LIOFILIZAO SOBRE A ESTRUTURA E MUDANAS DE FASE

DA ALBUMINA BOVINA MODIFICADA POR REAO COM METOXI POLIETILENOGLICOL
Dissertao
para
obteno
do
ttulo
de
MESTRE
Orientador:
So Paulo
2004

Efeito da liofilizao sobre a estrutura e mudanas de fase da albumina bovina modificada
por reao com metoxi-polietilenoglicol
Comisso Julgadora
Dissertao para obteno do ttulo de MESTRE
_________________________________________
Orientador/Presidente
_________________________________________
Prof. Dr. Valdir Augusto Neves
Examinador 1
_________________________________________
Prof. Dr. Bronislaw Polakiewicz
Examinador 2
So Paulo, 02 de Abril de 2004.
Dedico este trabalho

aos meus pais
e as minhas irms
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Ronaldo N. M. Pitombo, que como cientista, orientador e
amigo, tornou possvel a realizao deste trabalho.
Ao
Departamento
de
Tecnologia
Bioqumico-Farmacutica
da
Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo.

Aos Professores: Dr. Bronislaw Polakiewicz e Dr. Jos Abraho Neto,
pelo apoio e colaborao nas reaes de PEGuilao da albumina bovina.
A Prof. Dra. Duclerc Fernandes Parra e ao qumico e amigo Edson
Ghilardi, pelo apoio e colaborao nas analise trmicas durante a realizao da
parte experimental do meu trabalho.
Ao Prof. Dr. Reinaldo Guidici e ao Dr. Marlon Martins dos Reis, pelo
valioso auxlio nas anlises de espectroscopia Raman.
Aos professores, funcionrios e colegas do Departamento de
Tecnologia Bioqumico-Farmacutica, pela constante demonstrao de carinho e
amizade.
Dra. Kati Vannucci Chaim pelo constante apoio e incentivo no campo
da liofilizao na indstria farmacutica.
Aos funcionrios do setor de liofilizao da Eurofarma Laboratrios:
Nilson, Andr, Joo, Aparecido, Francisco e Luis, pelo valioso ensino prtico sobre
liofilizao.
Aos meus familiares pela constante motivao nestes anos.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contriburam para a
realizao deste trabalho.
Na medida em que a gua to comumente encontrada e utilizada em

diversas situaes, os homens se tornaram aptos a imaginar que eles entendem
por completo a sua natureza. Porm todos aqueles que cuidadosamente se
aplicaram em compreend-la, depararam-se com um dos assuntos mais difceis
de serem entendidos, dentre as filosofias naturais
Herman Boerhave (sculo XVIII)
SUMRIO
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUO
1.1. Modificao qumica de protenas
1.1.1. Propriedades do polietilenoglicol (PEG)
1.1.2. Succinimidil PEG
1.2. Estabilidade protica
1.2.1. A albumina bovina
1.3. Liofilizao
1.3.1. Congelamento: a primeira etapa na liofilizao
1.4. DSC, temperatura de transio vtrea e estabilidade da protena
12
1.5. Espectroscopia Raman
15
1.6. Umidade residual
20
2. OBJETIVO
23
3. MATERIAIS E MTODOS
23
3.1 Materiais
23
3.2. Mtodos
23
3.2.1. Soluo de BSA
23
3.2.2. Determinao da temperatura de transio vtrea
24
3.2.3. Anlise estrutural
24
3.2.4. Determinao do teor de umidade residual
24
3.2.5. Liofilizao da albumina bovina nativa
24
3.2.6 Sntese do metoxi-poietilenoglicol 5000
25
3.2.7. Preparao da soluo de albumina bovina modificada com metoxi-PEG 26

3.2.8. Liofilizao da albumina bovina modificada com metoxi-polietilenoglicol
27
3.2.9. Anlise colorimtrica
27
4. RESULTADOS E DISCUSSO
28
5. CONCLUSO
52
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
53
RESUMO
A conjugao por polietilenoglicol (PEG) mascara a superfcie das
protenas e aumenta o tamanho molecular do polipeptdio, reduzindo assim sua
ultrafiltragem renal, impedindo a aproximao de clulas processadoras de
antgenos ou anticorpos e reduzindo a degradao por enzimas proteolticas. O
PEG transfere para as molculas suas propriedades fsico-qumicas e,
conseqentemente, modifica tambm a biodistribuio e a solubilidade de drogas
peptdicas e no peptdicas. As solues de protenas so facilmente
desnaturadas (muitas vezes irreversivelmente) pelo aparecimento de numerosos
eventos que podem afetar a estabilidade das solues, tais como: aquecimento,
agitao, congelamento, mudanas no pH e exposio a interfaces ou agentes
desnaturantes, resultando geralmente na perda da eficcia clnica e aumento do
risco de efeitos colaterais adversos. A soluo prtica para o dilema da
estabilidade da protena a remoo da gua. A liofilizao o mtodo mais
comumente utilizado para a preparao de protenas desidratadas, as quais,
teoricamente, devem apresentar uma estabilidade adequada por um longo perodo
de armazenagem em temperaturas ambientes. A protena utilizada neste estudo
foi a albumina srica bovina (BSA), amplamente estudada no campo da
bioqumica. Atravs da espectroscopia Raman associada com anlise trmica por
DSC, anlise colorimtrica, e a determinao do teor de umidade, verificou-se que
o congelamento rpido (30
C/min.) favoreceu a manuteno da estrutura
conformacional da protena aps a liofilizao, porm aumentou o tempo de

secagem primria em sete horas em relao ao congelamento lento (2,5 0C/min.).
Aps a modificao da albumina bovina por reao com o metoxi-PEG verificou-se
que a BSA-PEG (1:0,25) apresentou um menor grau de alterao estrutural e
conseqentemente uma menor variao das caractersticas fsico-qumicas, alm
de otimizar as condies de liofilizao e armazenamento da protena quando
comparada com a BSA-PEG (1:0,5) .
Palavras chaves: liofilizao, modificao de protenas, espectroscopia Raman,
anlise trmica, albumina bovina.
ABSTRACT
PEG conjugation masks the proteins surface and increases the

molecular size of the polypeptide, thus reducing its renal ultrafiltration, preventing
the approach of antibodies or antigen processing cells and reducing the
degradation by proteolytic enzymes. The PEG conveys to molecules its physicochemical properties and therefore modifies also biodistribution and solubility of
peptide and non-peptide drugs. This property opens new techniques in biocatalysis
and in pharmaceutical technology where many insoluble drugs are solubilized by
PEG conjugation and thus more easily administered. Aqueous protein solutions are
readily denatured (often irreversibly) by numerous stresses arising in solution, e.g.,
heating, agitation, freezing, pH changes, and exposure to interfaces or
denaturants, usually resulting in lost of clinical efficacy and increase the risk of
adverse side effects. Even if its physical stability is maintained, a protein can be
degraded by chemical reactions (e.g., hydrolysis and deamidation), many of which
are mediated by water. The practical solution to the protein stability dilemma is to
remove the water. Lyophilization is most commonly used to prepare dehydrated
proteins, which, theorecally, should have the desired long-term stability at ambient
temperatures. The protein used in this study was the bovine serum albumin (BSA),
largely studied in the biochemical field. Through Raman spectroscopy associated
with thermal analysis using DSC, Colorimetric analysis and the determination of
water content It was observed that the fast freezing (30 0C/min.) favored the
maintenance of the conformational structure in the protein after lyophilization,
however increased the primary drying in seven hours with regard to the slow
freezing (2,5
C/min.). After the modification of bovine serum albumin with
methoxy-PEG it was observed that the BSA-PEG (1:0,25) showed a lower degree
of structural alterations and consequently a lower variation on the physicalchemical
characteristics,
moreover
optimized
the
conditions
during
the
lyophilization process and storage of the protein when it was compared to BSAPEG (1:0,5).
10
1. INTRODUO
1.1. Modificao qumica de protenas
No final dos anos 50, a modificao qumica de protenas tornou-se
uma prtica comum e foram desenvolvidas tcnicas para facilitar a anlise das
relaes entre estrutura e atividade das molculas de protena. Existem resduos
de aminocidos com diferentes reatividades em uma protena, dependendo de sua
localizao na estrutura da protena nativa. Alguns esto ocultos no interior da
molcula de protena e outros esto expostos na superfcie. Outras condies
locais, tais como ligao com hidrognio e ligao inica entre cadeias laterais de
aminocidos, diferenciam seus estados mais adiante. Para testar os diferentes
estados dos resduos de aminocidos em protenas, foram explorados reagentes
de modificao qumica. A finalidade de tais modificaes era investigar os
estados fsico-qumicos de vrios resduos de aminocidos e identificar os
aminocidos envolvidos na funo de uma protena especfica (Kodera et. al.,
1998).
Desde 1970 foram publicados diversos artigos referentes modificao
qumica das protenas pela conjugao com macromolculas sintticas, que so
derivadas do polietilenoglicol (PEG) (Kodera et.al.,1998). Os objetivos destas
modificaes proticas incluram a reduo da imunoreatividade ou da
imunogenicidade e a supresso da produo de imunoglobulina E. Em 1977,
Davis e seus colegas demonstraram que a ligao covalente do PEG com a
albumina srica e a catalase promoveu a reduo da imunoreatividade para os
respectivos anticorpos (Kodera et. al., 1998).
A relao entre imunoreatividade e grau de modificao obtido pela
conjugao da BSA e da asparaginase com o PEG pode ser observada na tabela
1 (Inada et. al., 1995). Caractersticas no-imunognicas e aumento do tempo de
circulao da droga modificada com o PEG foram demostradas pelos mesmo
pesquisadores, que conjugando o PEG com a L-asparaginase (P.M. 136,000 Da)
proveniente da E.coli, usada como enzima na terapia anticncer (leucemia e
linfosarcoma). Esta mesma enzima foi desenvolvida clinicamente e passou a ser
comercializada pela empresa ENZON, pelo nome comercial de OncasparR
(Greenwald, 2001).
11
Tabela 1. Relao entre atividade, imunoreatividade e grau de modificao obtido

pela conjugao da BSA e da asparaginase com derivados de PEG
Reagente
modificado
Albumina bovina
(BSA) sem
modificao
Conjugada com
PEG 1
Conjugada com
PEG 2
Conjugada com
PM 13
Conjugada com
PM 100
Peso molecular Grau de modificao

(Da)
(%)
Asparaginase
sem modificao
Conjugada com
PEG 1
Conjugada com
PEG 2
Conjugada com
PM 13
Conjugada com
PM 100
Imunoreatividade
(%)
66,210
0 (0) a
100
5000
42 (25)
10,000
25 (15)
13,000
30 (18)
100,000
20 (12)
136,000
0 (0)
100
5000
79 (73)
10,000
57 (73)
13,000
50 (46)
100,000
34 (31)
Parnteses: nmero de grupos aminas ligadas a cada reagente modificado.

Nmeros totais de grupos aminas na molcula de BSA e da asparaginase so de
60 e 92, respectivamente.
PM: copolmero do PEG (polietilenoglicol) (Kodera et al.,1998).
Provavelmente,
uma
das
caractersticas
mais
marcantes
da
modificao molecular usando o PEG o aumento da meia-vida (T1/2) e da

concentrao
das
protenas
teraputicas
no
plasma
sanguneo.
Estas
caractersticas podem ser atribudas, em parte, pelo aumento do peso molecular

da molcula conjugada com o PEG, alterando o sistema de filtrao renal e
tambm pela reduo da protelise enzimtica (Greenwald, 2001).
A adenosina-deaminase (ADA) conjugada com o PEG (PEG-ADA)
(Levy,Y,et al., 1988) foi em 1991 a primeira conjugao PEG-protena a ser
aprovada pelo FDA (Food and Drugs Administration). Esta droga usada no
12
tratamento de crianas que apresentam severa deficincia de ADA combinada

com imunodeficincia.
Mais de 40 protenas foram modificadas com o PEG ou derivados de
PEG para uso teraputico.
Sehon e colaboradores (1991) relataram que a formao dos anticorpos
classe IgE causada pelo plen alergnico da erva-de-santiago suprimida pela
administrao do PEG alergnico.
Uma abordagem nos processos biotecnolgicos preparar enzimas
modificadas com PEG que possuam tanto propriedades hidroflicas como
hidrofbicas (Inada et. al., 1986). As enzimas modificadas, tais como a peroxidase,
catalase, lpase e quimiotripsina, so todas solveis e ativas em solventes
orgnicos. Enzimas hidrolticas modificadas catalisaram a reao reversa da
hidrlise nos solventes orgnicos (Kodera et. al., 1998). Estes achados abriram um
novo caminho no desenvolvimento dos processos biomdicos e biotecnolgicos.
Este conceito foi aplicado no somente em protenas e enzimas, mas tambm s
substncias bioativas tais como hemina, melanina e clorofila.
1.1.1. Propriedades do polietilenoglicol (PEG)
Os polietilenoglicis apresentam comportamento anfiptico, solveis em
gua, tolueno, 1,1,1- tricloroetano e benzeno, e insolveis em ter etlico e
hidrocarbonetos alifticos. No apresentam toxicidade (P.M. >1.000). O polietileno
glicol (P.M. = 4.000) pode ser administrado com segurana, por via endovenosa,
em solues a 10% em ratos, cobaias, coelhos e macacos e em uma dose de 16
g/kg de peso corporal (a aprovao do FDA foi concedida para uso interno)
(Kodera et. al., 1998). Possuem baixa imunogenicidade, causam fuso celular (em
altas concentraes), formam sistemas bifsicos com uma soluo aquosa de
outras macromolculas tais como o dextran ou solues salinas concentradas e
podem ser usados para precipitar protenas e cidos nuclicos.
Se o PEG ligado covalentemente com protenas, a conjugao pode
exibir as seguintes propriedades:
solubilizao de enzimas e substncias bioativas em solventes orgnicos ou

em solues aquosas;
tornar protenas no imunognicas;

13
prolongar o tempo de liberao da droga protena PEG in vivo;
estabilizar a funo fisiolgica de protenas e substncias bioativas;
modificar a farmacocintica de vrias drogas;
separar macromolculas biolgicas, membranas, partculas celulares e clulas.

O polietilenoglicol (PEG), cuja frmula geral :
HO (CH2 CH2O2)n CH2 CH2OH
com pesos moleculares caractersticos que variam de 500 a 20.000 Daltons

apresentam-se no-imunognicos e solveis em solues aquosas, assim como
na maioria dos solventes orgnicos. O polmero no txico e no danifica
protenas ativas ou clulas. Apesar de sua aparente simplicidade, esta molcula
desperta muito interesse nas reas da biomedicina e da biotecnologia (Kodera et.
al., 1998).
Quando o PEG adequadamente ligado a um polipeptdio, ele modifica
muitas de suas caractersticas, enquanto suas principais funes biolgicas, tais
como atividade enzimtica ou reconhecimento do receptor, so mantidas. A
conjugao por PEG mascara a superfcie das protenas e aumenta o tamanho
molecular do composto, reduzindo assim sua ultrafiltragem renal, impedindo a
aproximao de antgenos ou anticorpos e reduzindo a degradao da mesma por
enzimas proteolticas. Finalmente, o PEG transfere para as molculas suas
propriedades
fsico-qumicas
e,
conseqentemente,
modifica
tambm
biodistribuio e a solubilidade de drogas peptdicas e no peptdicas. Estas

propriedades abrem novas tcnicas na biocatlise e na tecnologia farmacutica,
onde muitas drogas insolveis so solubilizadas atravs da conjugao do PEG e,
dessa forma, mais facilmente administradas (Veronese et. al. 2001).
1.1.2. Succinimidil PEG (mPEG)
O mPEG com um grupo carboxila terminal um derivado verstil. Pode
ser usado para o preparo de steres ativos do polmero, assim como para ligao
direta a molculas com importncia biolgica. O ster N-hidroxisuccinimidil (NHS)
de PEG reagir diretamente com um grupo amina nas molculas de protena com
o pH variando de 7.0 a 9,0. Um dos mtodos mais prticos para introduzir grupos
de carboxila ao grupo hidroxila de PEG pode ser a reao com anidrido succnico,
14
que
ativado
como
succinato
de
succinimidil
de
PEG
[SS-(PEG)].
Alternativamente, o carboximetil ou o PEG de carboxietil tambm esto

disponveis (Kodera et. al., 1998).
1.2. Estabilidade protica
Existem numerosas aplicaes exclusivas e importantes para as
protenas nos cuidados com a sade humana (Carpenter et. al., 1999). Entretanto,
mesmo a mais promissora e efetiva protena teraputica no ser benfica se sua
estabilidade no for mantida durante o seu acondicionamento, transporte,
armazenamento e administrao. Devido a facilidade na preparao, conteno
de custos e simplicidade no manuseio do produto final, as protenas so
preferencialmente preparadas na forma farmacutica de soluo aquosa.
Entretanto, as solues de protenas so facilmente desnaturadas (muitas vezes
irreversivelmente) pelo aparecimento de numerosos eventos que podem afetar a
estabilidade das solues, tais como: aquecimento, agitao, congelamento,
mudanas no pH e exposio a interfaces ou agentes desnaturantes, resultando
geralmente na perda da eficcia clnica e aumento do risco de efeitos colaterais
adversos. Mesmo se a estabilidade fsica for mantida, uma protena pode ser
degradada por reaes qumicas, como por exemplo, hidrlise e deamidao,
muitas das quais so mediadas pela gua. Assim, a instabilidade inerente da
protena e/ou a logstica do manuseio do produto geralmente impedem o
desenvolvimento das frmulas lquidas. Alm disso, a mera preparao de
produtos congelados estveis, o que relativamente simples, no uma
alternativa prtica, devido ao fato de que as condies necessrias de transporte e
armazenamento no so tecnicamente e/ou economicamente viveis em muitos
mercados (Carpenter et. al., 1999) .
A soluo prtica para o dilema da estabilidade da protena a
remoo da gua.
15
1.2.1. A albumina bovina

A protena utilizada neste estudo foi a albumina srica bovina (BSA),
amplamente estudada no campo da bioqumica. A BSA a protena mais
abundante no plasma sanguneo e serve como depsito, assim como transporte
de protena para numerosos componentes, como cadeia longa de cidos graxos
ou bilirrubina, ligados a uma alta afinidade protena. A estrutura secundria da
albumina bovina contm muitos resduos de cistina e so helicoidais em grande
parte da cadeia. Apresenta fcil isolamento em grandes quantidades favorecendo
sua alta estabilidade e solubilidade. a principal protena que contribui para a
presso coloidal osmtica do sangue e tambm para o transporte de protena para
numerosos compostos endgenos e exgenos. Com uma massa molecular de
66kDa, consiste em uma nica cadeia polipeptdica, contendo cerca de 580
aminocidos (Nakamura et. al., 1997). A albumina bovina (BSA) passa por
notveis mudanas reversveis na conformao, usualmente sob condies no
fisiolgicas.
1.3. Liofilizao
A liofilizao o mtodo mais comumente utilizado para a preparao
de protenas desidratadas, as quais, teoricamente, devem apresentar uma
estabilidade adequada por um longo perodo de armazenagem em temperaturas
ambientes. A liofilizao um processo de secagem constitudo de trs etapas :
congelamento, secagem primria e secagem secundria. O material, previamente
congelado, desidratado por sublimao, utilizando-se baixas temperaturas de
secagem a presses reduzidas. A liofilizao o mtodo de primeira escolha para
produtos termolbeis. Entretanto, estudos recentes com espectroscopia por
infravermelho tm documentado que os problemas relacionados com o
congelamento e a desidratao induzidos pela liofilizao podem levar ao
desdobramento molecular da protena. O desdobramento no somente pode levar
desnaturao irreversvel da protena, mesmo se a amostra reidratada
imediatamente,
mas
tambm
pode
reduzir
estabilidade
durante
armazenamento da protena liofilizada (Carpenter et. al., 1999).

16
Alm do mais, a simples obteno de uma protena com

conformao estrutural nativa em amostras reidratadas imediatamente aps a
liofilizao no necessariamente indicativo de estabilizao adequada durante a
liofilizao ou armazenamento. Muitas protenas apresentam desdobramento
estrutural durante a liofilizao, mas logo so restauradas se hidratadas
imediatamente (Carpenter et. al., 1999) .
As protenas raramente podem ser liofilizadas sem perda da
atividade, geralmente associadas alteraes em sua conformao. Portanto, um
agente estabilizante, por exemplo, um acar ou um poli-lcool, normalmente
exigido. A adio de um estabilizador, normalmente em uma concentrao muito
mais alta que a da prpria protena, resulta em uma transio vtrea
predominantemente observada durante o resfriamento ou desidratao (Wang,
2000).
1.3.1. Congelamento : a primeira etapa na liofilizao
A finalidade do congelamento dentro do processo de liofilizao
consiste na imobilizao do produto a ser liofilizado, interrompendo reaes
qumicas e atividades biolgicas.
A estrutura do produto, o tamanho e forma so determinados aps o
congelamento, assim como a sublimao e as caractersticas do produto final.
Esta estrutura no pode ser alterada durante o processo de liofilizao, porm
quando se faz, ocorrem danos ou a perda do produto. O congelamento uma das
etapas mais crticas do processo de liofilizao (Murgatroyd, et. al., 1997).
Uma soluo verdadeira pode-se congelar por meio de dois
mecanismos: com formao de euttico, solidificao no estado amorfo ou uma
mistura de ambos. Ao resfriar-se uma soluo diluda, inicialmente ocorre o superresfriamento da gua pura seguido da nucleao e cristalizao. A concentrao
do soluto aumentar para uma concentrao crtica. A esta concentrao e sob
temperatura pertinente, a soluo concentrada sofrer um congelamento euttico
ou uma transio vtrea (figura 1). O congelamento euttico uma cristalizao.
Uma transio vtrea um grande aumento na viscosidade do material, um slido
amorfo, que na verdade uma soluo super-congelada que conserva
propriedades visco-elsticas.
17
Soluo
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a
Soluo
super
saturada
Gelo + soluo
Gelo + soluo supersaturada
Gelo + soluto + vidro
Estado vtreo
Concentrao
Fig.1. Diagrama de fases da gua em uma soluo verdadeira.
A temperatura de transio vtrea caracterizada pelo aumento da

viscosidade, onde a mobilidade molecular diminui bruscamente, impedindo a
cristalizao. Antes de alcanar a temperatura de transio vtrea, a mistura
congelada passa por um ponto chamado temperatura de colapso, onde a
viscosidade da mistura soluto / solvente tal que ela conservar sua estrutura e
forma ao longo do processo de sublimao, at mesmo quando esta no
sustentada pelo gelo dendrtico adjacente. Esta temperatura de colapso de
grande importncia durante o processo de liofilizao (Murgatroyd, et. al., 1997).
A estabilidade das protenas influenciada pelas mudanas de pH.
Durante o congelamento de solues tamponadas, a concentrao dos sais do
tampo ir elevar-se, aumentando sua concentrao inica e possivelmente
alterando seu pH. Isto vai alterar o ambiente e, provavelmente, a estrutura e o
nvel de atividade da protena (Wang, 2000). Muitas protenas so estveis apenas
em uma estreita faixa de variao de pH, como a uroquinase de baixo peso
molecular (LMW-UK) em pH de 67. Em pHs extremos, o aumento da repulso
eletrosttica
entre
cargas
semelhantes
nas
protenas
tende
causar
desdobramento ou desnaturao da protena. Assim, a taxa de agregao protica

18
fortemente afetada pelo pH, tal como a aglutinao de interleucina 1 (IL-1),

relaxina humana, e a Rnase A pancretica bovina. Alm disso, o pH da soluo
pode afetar significativamente a taxa de muitas degradaes qumicas em
protenas (Li et al., 1995).
Os agentes tamponantes podem cristalizar seletivamente e causar
mudanas de pH durante o congelamento. Alm disso, prefervel manter todos
os sais tamponantes na forma amorfa durante o congelamento das protenas
sensveis alteraes de pH. Uma taxa de congelamento mais rpida pode
impedir a nucleao e a subseqente cristalizao. Cada sal de tampo tem sua
prpria taxa crtica de resfriamento, a qual definida como a taxa mnima de
resfriamento suficientemente rpido para impedir a cristalizao de um soluto. A
cristalizao no ir ocorrer quando a taxa de congelamento superar a taxa crtica
de resfriamento. Se uma soluo protica resfriada rapidamente com nitrognio
lquido, provvel que os sais de tampo permaneam amorfos. Por outro lado, a
cristalizao seletiva e a uma subseqente mudana do pH podem ocorrer (Chang
et al., 1996).
O congelamento de uma soluo de protena tamponada pode
cristalizar seletivamente um tampo, causando mudanas no pH. O fosfato
disdico (Na2HPO4) cristaliza-se mais prontamente que o fosfato monosdico
(NaH2PO4) porque a solubilidade da forma disdica consideravelmente mais
baixa que a da forma monosdica. Por causa disso, um tampo fosfato de sdio
em pH 7 tem uma proporo molar [NaH2PO4]/[Na2HPO4] de 0,72, mas esta
proporo aumenta para 57 na temperatura euttica ternria durante o
congelamento. Isso pode levar a uma significativa queda de pH durante o
congelamento, que ento desnatura as protenas pH-sensveis (Franks, 1993). Por
exemplo, o congelamento de uma soluo da enzima Lactato Desidrogenase
(LDH) causou a desnaturao da protena devido a uma queda do pH de 7,5 para
4,5 pela cristalizao seletiva de Na2HPO4. A LDH uma protena pH-sensvel e
uma pequena queda no pH durante o congelamento pode desnaturar parcialmente
a protena, mesmo na presena de estabilizadores tais como a sacarose e a
trealose. A queda de pH durante o congelamento pode tambm explicar por que o
congelamento de da IgG bovina e humana em um tampo fosfato de sdio causou
a formao de mais agregados do que no tampo de fosfato de potssio, pois o
19
tampo de fosfato de potssio no apresenta alteraes significativas de pH

durante o congelamento (Anchordoquy et al., 1996).
A queda de pH durante o congelamento pode afetar potencialmente a
estabilidade de armazenamento das protenas liofilizadas. O receptor antagonista
da interleucina-1 humana recombinante liofilizada (rhIL-1ra) em uma frmula
contendo tampo fosfato em pH 6,5 apresentou sinais de agregao mais
rapidamente do que aquela contendo tampo de citrato no mesmo pH durante a
armazenagem em 8, 30 e 50 C. Similarmente, a queda de pH de uma frmula
que continha succinato, de 5 para 3,5 durante o congelamento pareceu ser a
causa da baixa estabilidade de armazenamento para o Interferon- (IFN-) do que
aquela contendo tampo de glicolato no mesmo pH (Lam et al., 1996).
O colapso estrutural de uma matriz liofilizada ocorre quando a
viscosidade do material decresce em funo do aumento da temperatura,
consequentemente o material no pode se sustentar uma vez que o gelo
dendrtico adjacente foi sublimado. O colapso ocorrer, ento, na interface da
liofilizao.
A etapa de congelamento durante a liofilizao considerada to
importante quanto etapa de secagem, devido ao seu efeito potencial sobre as
protenas. Um parmetro importante que precisa ser definido durante o
congelamento a taxa de resfriamento. A taxa de resfriamento pode ser definida
como:
v = _ T (r,t)_,
t
onde v a taxa de resfriamento, T(r,t) o campo da temperatura, uma
funo tanto do tempo, t, como da localizao, r. Assim, a taxa varia temporal e
espacialmente. Em geral, um congelamento mais rpido gera pequenos cristais de
gelo. Isso ocorre porque a gua super resfriada e a cristalizao do gelo ocorre
rapidamente, produzindo pequenos cristais de gelo. De modo oposto, uma taxa de
resfriamento mais lenta gera cristais de gelo maiores. O tamanho dos cristais
determina o tamanho do poro a ser criado durante a secagem subseqente.
Grandes cristais de gelo criam grandes poros, conduzindo a uma rpida
sublimao da gua durante a secagem primria, mas a secagem secundria
20
pode ir mais devagar devido a superfcies de rea menores, limitando a desoro

da gua durante a secagem secundria. Para manter um equilbrio, tem sido
recomendado um grau moderado de super-congelamento (1015 C) (Wang,
2000).
O grau de desnaturao protica induzida pelo congelamento uma
funo complexa, tanto da taxa de resfriamento como da temperatura final. O
efeito das taxas de resfriamento na estabilidade das protenas varia de forma
significativa. Por exemplo, o aumento da taxa de congelamento de 0,5 para 50 C
min-1 no afetou significativamente a formao de agregados solveis de hormnio
do crescimento recombinante (rGH) em 2 mg ml-1 e em 5 mM de tampo fosfato
(pH 7,4 ou 7,8), mas a formao de agregados insolveis (particulados) aumentou
severamente com o aumento das taxas de congelamento, mesmo na presena de
mais de 250 mM de manitol (Eckhardt et al., 1991). O congelamento rpido
tambm causou a formao de mais agregados para a IgG bovino e humano do
que o congelamento lento. Isto pode ser resultado da formao de cristais de gelo
menores e de maiores interfaces de gelo/gua em taxas de congelamento mais
altas, levando a uma maior extenso de desnaturao da protena induzida pela
superfcie. Ao contrrio, o congelamento mais rpido causou menos perda da
atividade da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) e menor mudana na estrutura
secundria da hemoglobina em uma soluo de PEG / dextran. A perda menor da
atividade protica ocorre provavelmente porque o congelamento mais rpido pode
impedir o crescimento abrangente do cristal, retardando substancialmente a
desnaturao protica frente a crioconcentrao induzida da soluo. Alm disso,
a estabilidade das protenas pode ser afetada em diferentes taxas de
congelamento, dependendo dos mecanismos de desnaturao da protena (Wang,
2000).
Deve-se notar que a taxa de congelamento pode ter um impacto
potencial na estabilidade durante o armazenamento das protenas liofilizadas. Hsu
et al. (1995) demonstraram que o resfriamento mais rpido durante a liofilizao
do plasminognio ativador tecidual (tPA) resultou em um produto slido com uma
rea de superfcie interna maior, conduzindo formao de mais partculas
opalescentes (insolveis) no armazenamento por um longo perodo, a 50 C. A
taxa de formao de partculas opalescentes durante o armazenamento
21
correlacionou bem (r = 0,995) com a rea da superfcie interna do produto slido

de tPA liofilizada.
A taxa de congelamento influencia a extenso da cristalizao do
excipiente da formulao, tal como o manitol. Consequentemente a durao do
tratamento trmico subseqente ao congelamento pode ser afetada. Alm disso,
diferentes taxas de congelamento podem favorecer a formao de determinadas
formas cristalinas de um excipiente, as quais podem afetar potencialmente a
estabilidade e reconstituio da protena. Tem sido observado que uma taxa de
cristalizao mais lenta tende a favorecer a formao de -glicina, enquanto que a
cristalizao rpida parece favorecer a formao do -polimorfo. Diferentes
polimorfos de manitol foram tambm obtidos em diferentes concentraes durante
o congelamento. Recentemente, Kim et al. (1998) demonstraram que o
congelamento lento (por volta de 0,2 C min-1) de manitol a 10% (w/v) produziu
uma mistura de polimorfos e e o congelamento rpido (com nitrognio lquido)
da mesma soluo produziu a forma . O tempo de reconstituio (com gua) foi
de 36 e 78 s para o congelamento rpido e o congelamento lento,
respectivamente, para as amostras de manitol liofilizado.
1.4. DSC, temperatura de transio vtrea e estabilidade da protena
A liofilizao freqentemente usada para estabilizar os produtos
proticos com baixa estabilidade em soluo. No surpresa, ento, que mais de
um quarto dos produtos proticos teraputicos no mercado sejam liofilizados. O
mecanismo de uma liofilizao, congelamento seguido de secagem, induz a
obteno de produtos que em sua maioria esto no estado amorfo. Devido
natureza amorfa da protena e
dos agentes estabilizantes (mais comumente
acares ou poliis), as formulaes liofilizadas exibem freqentemente uma

transio vidro-borracha que um importante parmetro para o desenvolvimento
do ciclo de liofilizao. Ento, a transio vtrea de um produto liofilizado pode ser
estudada e aplicada para melhorar o processamento, a qualidade e estabilidade
do produto (Chen, et al., 1995).
A teoria da transio vtrea origina-se da cincia dos polmeros. As
protenas, sendo polimricas, podem exibir uma transio vtrea especfica Tg,
geralmente ao redor de 10 C. Por exemplo, a Tg para a ovoalbumina de 11
22
C, 13 C para a lisozima, 9 C para a lactato desidrogenase e 11 C para o

soro da albumina bovina (Chang et al., 1992)
Sob temperaturas abaixo da transio vtrea, a matriz do soluto
assemelha-se um vidro, comportando-se como um slido amorfo. Em uma
liofilizao, se a temperatura de congelamento ultrapassar a Tg, a soluo amorfa
concentrada ficar menos viscosa, ocorrendo o colapso do produto. Durante a
liofilizao, a concentrao do soluto da matriz aumenta progressivamente devido
perda de gua. A matriz torna-se mais rgida e a Tg aumenta. O produto pode
ento tolerar o aumento da temperatura sem sofrer o colapso (Chen et al., 1995).
A Tg uma transio de segunda ordem e caracterizada por uma
interrupo na relao entre temperatura e capacidade calorfica.
Para definir Tg usando DSC, devem ser seguidos trs critrios:
O mapeamento trmico tem de mostrar uma clara descontinuidade do fluxo de

calor;
Deve ser possvel mapear antes e depois da transio, de forma reversvel

entre os estados vtreo e borrachoso;
Ao manter uma amostra isotermicamente acima de Tg, a cristalizao deve

ocorrer (Wolanezyk et. al., 1989).
O terceiro critrio , s vezes, difcil de ser encontrado, porque a
cristalizao pode levar menos de 10 min para a lactose e sacarose amorfas

(Ross et. al., 1991), 24 h para o fenobarbital, ou mais de 2 anos para indometacina
( Pikal et. al., 1991). Porm, a sacarose liofilizada cristalizou-se aps o
armazenamento por apenas um ms a 60 C (te Booy, et al., 1992)
A Tg tambm depende da composio da soluo protica. Como
previamente mencionado, a Tg independente da concentrao para solues
diludas, mas dependente da proporo dos componentes. Uma tcnica para
aumentar a sensibilidade da deteco aumentar a concentrao de cada
componente enquanto se mantm uma relao constante entre as taxas dos
componentes. A Tg aumenta proporcionalmente com o peso molecular de uma
srie homloga de materiais polimricos. Alm disso, um aumento no contedo de
umidade diminui a Tg de um slido amorfo. Os mesmos pesquisadores relataram
que um aumento de 1% na umidade reduziu a Tg em 5 C na maioria das
amostras. A histria trmica de uma amostra importante e afetar a Tg medida.
Portanto, recomendado que as amostras sejam aquecidas a uma alta
23
temperatura para apagar qualquer estrutura residual vtrea, que permanea de

algum tratamento trmico prvio. Certamente, a estabilidade da amostra a esta
temperatura deve ser levada em considerao. provvel que a possibilidade de
haver ainda uma estrutura residual na amostra que ser analisada seja a razo
pela qual alguns autores sugerem que um segundo mapeamento deva ser usado
como a Tg representativa do material (Chen, et al., 1995).
Outros fatores importantes que podem influenciar a Tg so: a taxa de
resfriamento, a taxa de aquecimento, a temperatura e o tempo utilizados durante o
tratamento trmico. Estes fenmenos esto bem documentados. O controle
adequado dos fatores acima citados evita problemas associados sobreposio
de picos, eliminam a desvitrificao e a micro-heterogeneidade que ocorre durante
o resfriamento. Para evitar a sobreposio do pico endotrmico com a transio
vtrea, utiliza-se uma rpida taxa de aquecimento, pelo menos 1040 C min-1. O
tratamento trmico, baseado no congelamento da amostra abaixo da Tg especfica
do material, seguido do aquecimento da amostra at temperatura de superresfriamento da soluo e em seguida, o congelamento do material at
temperatura abaixo da Tg, necessrio para algumas amostras para atingir uma
concentrao mxima de congelamento e eliminar a desvitrificao que tpica
das solues de carboidrato sem tratamento trmico. Sugere-se que o tratamento
trmico elimine os diferentes estados polimrficos dos cristais que ocorre durante
o resfriamento (Chen et. al., 1995).
O colapso uma caracterstica de um material que sofreu uma
transio vtrea. Ocorre na interface de sublimao, quando o gelo dendrtico
sublimado a uma temperatura acima da temperatura de colapso (Tc). A soluo
concentrada no tem viscosidade suficiente para suportar sua prpria estrutura,
sem o suporte adicional do gelo puro que havia sido previamente imobilizado.
Quando o gelo puro sublimado, o lquido viscoso flui para dentro das cavidades
da interface e colapsa-se. Em seguida, devido ebulio, a matriz expandi-se. Isto
deixa uma camada que normalmente atua como uma barreira, reduzindo o
resfriamento evaporativo. O produto ganha calor sensvel, promovendo uma
reao em cadeia. O colapso sempre ocorre na mesma temperatura de
solidificao do material. No h efeito de histerese como no caso do
congelamento e fuso. Embora o mecanismo de colapso seja diferente do da
24
fuso, os agentes causadores e as solues remediativas so similares

(Murgatroyd et. al., 1997)
Valores de Tg obtidos por DSC foram relacionados a valores da
temperatura de colapso (Tc), medidos por criomicroscopia (Chang et. al., 1992,
Ross, 1993). Chang e Randall (1992) observaram uma estreita relao entre a Tg.
e o fenmeno do colapso. Entretanto, Pikal e Shah (1990) sustentaram que a
diferena entre Tg. e Tc sutil mas possivelmente importante. Eles relataram que a
Tg. ligeiramente menor que a Tc quando medida sob baixas taxas de
aquecimento. Mais tarde, Pikal concordou que a Tg. e a Tc so idnticas para a
maioria dos propsitos prticos ( Pikal, 1990).
Em resumo, a escolha das condies de liofilizao dependente da
formulao e o DSC um mtodo conveniente para avaliar estes efeitos (Chen et.
al., 1995).
1.5. Espectroscopia Raman
As protenas e seus componentes so exemplos da aplicao da
espectroscopia Raman a biomolculas. O primeiro espetro Raman de uma
protena, a lisozima, foi obtido em 1958, por Garfinkel e Edsall, utilizando lmpada
de mercrio como fonte de excitao. O uso intensivo da tcnica Raman foi
iniciado na dcada de 70, com a utilizao do laser contnuo a gs e o
aperfeioamento global da instrumentao.
No Raman temos um processo fsico denominado espalhamento de luz.
Sua atividade depende da variao do momento de dipolo induzido (pelo campo
eletromagntico incidente) com a vibrao.
No espalhamento Raman Stokes um fton de energia h 0 interage
com uma molcula no estado vibracional fundamental E1 levando-a a um estado
intermedirio Ei (no necessariamente um nvel energtico da molcula) e
espalhado com energia h ( 0
- v ), onde v
a frequncia vibracional
correspondente transio E2 E1 = h v . Caso o fton incidente interaja com a

molcula no nvel vibracional excitado E2 o fton espalhado pode, por decaimento
do nvel intermedirio Ei ao estado fundamental E1, ter energia h ( 0 + v ), maior
do que a do fton incidente, dando origem ao espalhamento Raman anti-Stokes.
25
Se o fton incidente sofre uma coliso puramente elstica ser espalhado com a
mesma frequncia, originando a radiao Rayleigh (Chase et. al., 1994).
A frequncia vibracional obtida da diferena entre a frequncia da
radiao incidente e a frequncia da radiao espalhada. uma maneira de
transpor para a regio do visvel, informaes que seriam obtidas na regio do
infravermelho.
No efeito Raman no se d a absoro de energia da radiao
incidente. Na realidade usa-se luz visvel, de comprimento de onda arbitrrio, cuja
frequncia est distante daquelas das vibraes moleculares.
O que ocorre no efeito Raman um espalhamento da luz incidente, que
aps o processo, se apresenta com frequncia menor do que a original. A grosso
modo poderamos interpretar o fenmeno como uma coliso inelstica entre um
fton e a molcula (Chase et. al., 1994).
As diferenas de frequncias entre a radiao incidente e a espalhada
constituem o espectro Raman. Essas diferenas correspondem s frequncias de
vibrao da molcula.
Como o mecanismo do espalhamento Raman fisicamente diferente
daquele de absoro, as regras de seleo para os dois tipos de espectroscopia
vibracional molecular so em geral diferentes. Essa diferena que torna os dois
efeitos complementares, pois uma frequncia proibida na absoro pode ser
emitida no Raman e vice-versa (Chase et. al., 1994).
No efeito Raman no o momento de dipolo intrnsico da molcula ( )
que est em jogo, mas um momento de dipolo induzido na molcula pelo campo
eltrico da radiao incidente ( P ).
Para campos eltricos no muito intensos existe uma relao linear
entre o momento de dipolo induzido e o campo eltrico incidente :
P=E
a polarizabilidade da molcula. Em geral P e E no so paralelos;
consequentemente no uma quantidade escalar comum (Chase et. al., 1994).
O espectro Raman normal de uma protena consiste das contribuies
dos modos vibracionais de vrias cadeias laterais dos resduos de aminocidos
26
juntamente com os modos do esqueleto peptdico. Estes modos vibracionais

fornecem informaes estruturais, como conformao mdia do esqueleto
polipeptdico, a microvizinhana de algumas cadeias laterais (particularmente
aquelas da tirosina, do triptofano e da metionina) e a conformao das pontes
dissulfetos existentes na protena (Stuart, 1997).
A espectroscopia por infravermelho tem sido utilizada para quantificar a
estrutura secundria da protena e para estudos das alteraes induzidas na
conformao da protena. A informao estrutural obtida pela anlise da faixa na
regio da amida I conformacionalmente sensvel que situa-se entre 1.600 e 1.700
cm-1. Esta banda sensvel ao estiramento vibracional das ligaes C=O,
fracamente ligadas ao estiramento C-N e N-H. Cada tipo de estrutura secundria
(-hlice, folhas- e estruturas desordenadas) causam o aumento de uma
freqncia de estiramento de C=O diferente e, portanto, apresentam uma posio
de faixa caracterstica, a qual designada pelo nmero da onda em cm-1. As
posies das faixas so usadas para determinar os tipos estruturais secundrios
presentes em uma protena. As reas de faixa relativa podem ento ser utilizadas
para quantificar cada componente estrutural. Conseqentemente, uma anlise das
faixas por espectroscopia infravermelho na regio da amida I pode fornecer
informao tanto quantitativa como qualitativa sobre a estrutura secundria da
protena.
Para obter essa informao estrutural detalhada, necessrio
aumentar a resoluo da faixa de amida I da protena, que geralmente aparece
como um nico amplo contorno de absorbncia.
Para os estudos de alteraes estruturais induzidas pela liofilizao
recomenda-se o clculo do segundo espectro derivativo. Este mtodo muito
objetivo e as alteraes nas larguras das faixas componentes, as quais so
devidas ao desdobramento da protena so preservadas no segundo espectro
derivativo (Carpenter et al., 1999).
Para a maioria das protenas no protegidas, (liofilizadas na presena
apenas de tampo), o segundo espectro derivativo para o slido seco bastante
alterado, correspondendo ao respectivo espectro das protenas originais em
solues aquosas. A liofilizao induz a diferentes nveis de deslocamento nas
posies de faixas, perda e alargamento de faixas.
27
As
alteraes
espectrais
induzidas
pela
liofilizao
na
regio
conformacionalmente sensvel da amida I ocorrem devido o desdobramento da

protena e no simplesmente perda de gua pela mesma. Os efeitos intrnsecos
da remoo da gua nas propriedades de oscilao da ligao de peptdeo e, por
conseguinte, no espectro infravermelho da protena, foram tidos como
insignificantes por Prestrelski e outros. Se os efeitos diretos de oscilao da
remoo da gua foram responsveis pelas alteraes espectrais induzidas pela
secagem, ento o espectro infravermelho de todas as protenas deveria ser
alterado para o mesmo grau no slido seco, o que no o caso (Carpenter et. al.,
1999).
A liofilizao pode causar diversas mudanas potenciais no espectro IR
das protenas. A perda das ligaes de hidrognio nas protenas durante a
liofilizao geralmente leva a um aumento na freqncia e uma diminuio na
intensidade das faixas de expanso da hidroxila. O desdobramento das protenas
durante a liofilizao amplia e modifica (para nmeros de ondas maiores) os picos
dos componentes da amida I. A liofilizao freqentemente conduz a um aumento
no contedo de folhas- com uma reduo concomitante no contedo de -hlice.
A converso da -hlice para folhas- durante a liofilizao tem sido observada
em muitas protenas, tais como o toxide tetnico (TT) 10mM de tampo de
fosfato de sdio (pH 7,3), albumina humana recombinante (AHr) em solues com
diferentes tampes e em diferentes pHs, Hormnio do crescimento humano (GHh)
em pH 7,8 e sete protenas modelos em soluo, incluindo o inibidor tripsina
pancretica bovina (ITPB), a quimiotripsinognio, a mioglobina do cavalo (Mb), o
citocromo c cardaco eqino (Cytc), a AHr, a insulina suna e a Ribonuclease A
(RNase A) (Griebenow et al., 1995).
Um aumento no contedo de
folhas- durante a liofilizao
freqentemente uma indicao de agregao protica e/ou aumento da interao

intermolecular. Tal transio tem sido tambm observada nas protenas durante a
liofilizao, assim como a insulina humana em soluo (pH 7,1). As estruturas de
folhas- aps a liofilizao apresenta um grau maior de ligao intermolecular de
hidrognio porque os grupos polares precisam satisfazer suas necessidades de
ligao H - H pela interao intra ou intermolecular pela remoo da gua. A folha intermolecular caracterizada por duas principais faixas de IR de
aproximadamente 1617 e 1697 cm-1 no estado slido, que pode ser usadas para
28
monitorar a desnaturao da protena. Similarmente, a intensidade relativa da

faixa -hlice pode ser usada nesta observao (Heller et al., 1999).
Como a maioria das protenas teraputicas so administradas
parenteralmente, mesmo se apenas uma pequena frao do total da quantidade
das
molculas
de
uma
protena
(uma
pequena
porcentagem)
estiver
irreversivelmente desnaturada e agregada, ento o produto no ser aceitvel. At

recentemente, eram desconhecidas as alteraes na estrutura da protena
surgidas durante a liofilizao, os quais eram usualmente manifestadas como
agregao protica aps a reidratao. Entretanto, com a espectroscopia por
infravermelho, agora possvel examinar-se diretamente a estrutura secundria
de uma protena na soluo aquosa inicial, tanto no estado lquido como no slido
final desidratado. O desdobramento no s pode levar desnaturao irreversvel
da protena, se a amostra reidratada imediatamente, mas talvez com maior
importncia para o desenvolvimento industrial de protenas liofilizadas, pode
tambm reduzir a estabilidade durante o armazenamento no slido seco
(Carpenter et al., 1998).
Alm do mais, a simples obteno de uma protena nativa em amostras
reidratadas imediatamente aps a liofilizao no necessariamente indicativo de
adequada estabilizao durante as etapas de processamento, nem de previso de
estabilidade de armazenamento. Por exemplo, muitas protenas so desdobradas
durante a liofilizao, mas so prontamente restauradas se reidratadas
imediatamente.
A informao estrutural obtida pela anlise da faixa de amida I
conformacionalmente sensvel, a qual est localizada entre 1.600 e 1.700 cm-1. As
alteraes espectrais na regio sensvel da amida I induzidas pela liofilizao so
devido ao desdobramento da protena e no simplesmente perda de gua do
sistema. Os efeitos intrnsecos da remoo de gua nas propriedades vibracionais
da ligao peptdica e, conseqentemente, os espectros infravermelhos da
protena, foram tidos como insignificante por Prestrelski e colaboradores
(Carpenter et. al., 1998).
So
mostrados
dois
comportamentos
diferentes
das
protenas
desdobradas no slido seco durante a reidratao :
a protena recupera a conformao original pela reidratao (desdobramento

reversvel),
como
observado
para
-lactoalbumina,
lisozima,
29
quimiotripsinognio, ribonuclease, -lactoglobulinas A e B, -quimiotripsina e

subtilisina ;
uma frao significativa das molculas de protena agregam-se com a

reidratao (desdobramento irreversvel), como notado para a Lactato
desidrogenase
(LDH),
Fosfofrutoquinase
(PFK),
Interferon-,
fator
de
crescimento de fibroblasto bsico e interleucina-2 ( Prestrelski et al., 1993)

Tem sido documentado com vrias protenas, que a preveno da
agregao e o restabelecimento da atividade aps a reidratao correlaciona-se
diretamente com a reteno da estrutura original no slido seco (Carpenter et. al.,
1999). .
A extenso das alteraes em todo o espectro IR de uma protena pela
liofilizao reflete o grau de desnaturao da protena. As mudanas relativas a
uma referncia do espectro podem ser medidas usando-se um coeficiente de
correlao (r), como definido por Prestrelski et al., (1993), ou a extenso da
cobertura da rea do espectro. Utilizando o coeficiente de correlao, Prestrelski
et al. (1993) foram capazes de medir a estabilidade da liofilizao de diversas
protenas modelo, incluindo o fator de crescimento do fibroblasto bsico (bFGF), a
-lactoalbumina bovina, a -casena bovina, o Interferon-, e o fator estimulante
da colnia recombinante de granulcito (rG-CSF) na presena de diferentes
acares. Todavia, Griebenow e Klibanov (1995), aps analisarem as estruturas
secundrias de sete protenas modelo na liofilizao, concluram que o coeficiente
de correlao no era altamente sensvel s alteraes estruturais nas protenas.
1.6. Umidade residual
O contedo de umidade residual aps a liofilizao freqentemente
controla a estabilidade da protena por um longo perodo, tanto fsica como
quimicamente. O contedo de umidade de uma frmula de protena liofilizada
pode mudar significativamente durante o armazenamento, devido a uma variedade
de fatores, tais como: liberao de umidade pela rolha butlica e entrada de ar
para o interior do frasco contendo o produto liofilizado, cristalizao de um
excipiente amorfo, ou liberao de umidade de um excipiente hidratado. A gua
pode afetar a estabilidade da protena tanto indiretamente (agindo como um
30
plasticizante, ou como meio de reao), como diretamente (como um reagente ou

um produto de reao) (Wang, 2000).
O mtodo de titulao por Karl Fischer, originalmente descrito em 1935,
a abordagem mais utilizada na determinao do contedo de gua residual. O
mtodo Karl Fischer fornece uma melhor estimativa da umidade residual total,
bastante reprodutvel e pode ser automatizado. A titulao pode ser feita em meio
prtico ou aprtico, porm quando realizada em meio prtico, a anlise torna-se
mais ampla devido maior sensibilidade do agente titulante da amostra e
composio do solvente (Towns, 1995).
A habilidade do mtodo de Karl Fischer de medir a umidade residual em
aproximadamente 10 mg de uma amostra biolgica liofilizada faz dele o mtodo
mais prtico para a determinao da umidade residual em produtos biolgicos
liofilizados em uma dose nica. Os produtos liofilizados no podem ser analisados
pela metodologia de Karl Fischer quando :
Os materiais presentes na matriz do produto interferem nos reagentes de Karl

Fischer;
A amostra no se dissolve adequadamente no reagente de Karl Fischer;
A umidade da amostra no extrai adequadamente nestes solventes (Towns,

1995).
Um importante ponto a ser considerado na titulao de Karl Fischer a
possibilidade de resultados falsos devido contaminao da gua durante o

manuseio da amostra. Indiretamente como um plasticizante, a gua diminui
drasticamente a temperatura de transio vtrea das protenas, polmeros ou
excipientes da formulao. O efeito quantitativo da gua na temperatura de
transio vtrea pode ser facilmente estimado pela equao de GordonTaylor. A
queda da Tg pela gua pode atingir 10 ou mais para cada percentagem de
umidade retida, especialmente em contedos com baixo nvel de umidade. Alm
disso, uma protena liofilizada pode absorver facilmente quantidades suficientes de
umidade durante o armazenamento para reduzir sua Tg abaixo da temperatura de
armazenamento, acelerar sua instabilidade e causar um possvel colapso do
produto.
Por
exemplo,
dimerizao
da
insulina
liofilizada
aumenta
significativamente quando o contedo de gua alto o suficiente para causar a

diminuio significativa da temperatura de transio vtrea e o colapso do slido. O
31
alto contedo de umidade tambm facilita a cristalizao dos excipientes da

frmula, tais como os acares (Wang, 2000).
Geralmente, o aumento do contedo de umidade de uma protena
liofilizada aumenta a taxa de degradao das protenas. A gua absorvida
aumenta o volume livre de uma protena liofilizada, promovendo a mobilidade
molecular.
A perda da atividade da RNase pancretica bovina induzida pela
aglutinao foi mais rpida a 9,8% de umidade do que a 1,9%. O aumento da
umidade foi tambm a causa da conformao -helicoidal reduzida e a estrutura
aumentada (um tema comum da aglutinao da protena) do fator estimulante de
colnias de granulcitos humano recombinante (rhGCSF) desidratado por spraydrying (French et al., 1995).
O processo de liofilizao remove a gua de um sistema, baseado no
princpio da sublimao do gelo sob presso reduzida. Quando uma soluo
protica liofilizada, o volume de gua que reside nas matrizes de gelo da
soluo congelada sublima primeiro. As multicamadas da gua que envolvem a
molcula de protena ento removida, deixando uma monocamada residual de
gua na superfcie da protena. Esta operao permite a secagem dos materiais
termolbeis para diminuir o contedo de umidade residual sob moderadas
condies de temperatura. Se o produto cujo fim o uso parenteral, ento a
protena geralmente liofilizada em um recipiente final tal como a ampola de vidro
lacrada ou um recipiente de vidro com fecho de borracha, que usualmente
fechado a vcuo ou nitrognio. O contedo de gua do material liofilizado no
recipiente final pode variar dependendo dos parmetros da liofilizao e pode
aumentar durante o armazenamento (Towns, 1995).
A quantidade de gua presente na protena tem um significativo
impacto na estabilidade e uma preocupao tanto para o volume do slido como
para as formulaes liofilizadas. A umidade residual refere-se ao baixo nvel da
gua da superfcie, variando desde menos de 1% at 5%, permanecendo em um
produto biolgico liofilizado aps a remoo do volume do solvente. A umidade
residual no deveria comprometer a potncia e integridade do produto. O nvel
apropriado de umidade residual para otimizar a estabilidade de uma protena
liofilizada muito dependente dos caminhos especficos para a decomposio da
mesma. A viso geralmente aceita quanto mais seco melhor. Porm, os nveis
32
de umidade residual de certos produtos no deveriam ser to baixos a ponto do

excesso de secagem afetar adversamente a estabilidade do produto. A reteno
de gua varia de acordo com o tipo de gua presente, tipo de ligao, superfcie
e/ou gua retida, e diferente para cada produto. Como pode existir mais de um
tipo de gua em um produto biolgico liofilizado, podem ser encontrados
diferentes resultados de umidade quando so empregados diferentes mtodos na
determinao do contedo de umidade da amostra (Towns, 1995).
2. OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho foi:
Analisar a influncia da taxa de congelamento no comportamento fsicoqumico e estrutural durante a liofilizao da albumina bovina;
Avaliar o efeito da liofilizao sobre a estrutura e mudanas de fase da

albumina bovina modificada por reao com o metoxi-polietilenoglicol.
3. MATERIAIS E MTODOS
3.1 Materiais.
Albumina bovina frao V (fracionamento por metodologia Cohn) p
cristalizado da marca INLAB.
Metoxipolietilenoglicol (P.M. 5000 Da), p cristalizado da marca Aldrich.
3.2. Mtodos
3.2.1. Soluo de BSA
Preparou-se uma soluo de albumina bovina (100 mg/ml) em tampo
Fosfato (pH 7,3) 0,1M em temperatura controlada de aproximadamente 2 0C .
33
3.2.2. Determinao da temperatura de transio vtrea

A temperatura de transio vtrea da soluo e do p liofilizado da
albumina bovina foi determinada utilizando-se DSC 822 da METTLER TOLEDO,
com taxa de resfriamento de 5C/min, taxa de Nz de 50 ml/min.
3.2.3. Anlise estrutural
A estrutura secundria da albumina bovina (soluo e p liofilizado) foi
determinada por espectroscopia RAMAN da marca BRUKER, IFS 28/N com
acessrio FRA 106/S. Utilizou-se resoluo espectral de 4 cm-1 e 128 nos de
aquisies.
3.2.4. Determinao do teor de umidade residual
A umidade residual do p liofilizado da albumina bovina foi determinada
por metodologia Karl Fisher em equipamento da METTLER TOLEDO DL 31 KARL
FISHER TITRATOR.
3.2.5. Liofilizao da albumina bovina nativa
A liofilizao foi conduzida em um liofilizador da marca FTS Systems,
modelo TDS-00209-A e micro processado pelo programa Liphoware.
O congelamento com taxa de resfriamento de 2,5C/min foi realizado
em um Ultrafreezer com temperatura final de 70C. O congelamento com taxa de
resfriamento de 30C/min foi realizado com a imerso das amostras em Nitrognio
lquido.
A secagem primria foi realizada com temperatura de placa de 22C,
presso interna na cmara de 250 mTorr e temperatura do condensador de
90C. A secagem secundria foi realizada com temperatura de placa de 25C,
presso interna na cmara de 5 mTorr e temperatura do condensador de 90C.O
final da liofilizao foi determinado por um higrmetro acoplado ao liofilizador. Os
34
frascos foram fechados por rolhas butlicas ainda dentro da cmara sob presso
reduzida de 5 mTorr.
3.2.6 Sntese do metoxi-poietilenoglicol 5000
Esquema reacional :
Para a obteno do succinimidil derivado foi necessrio fazer a seguinte reao:
O
O
O
OH
O
OH
O
PEG 5000
anidrido succnico
succinimidil derivado
Para obteno do complexo ativado do metoxi-PEG realizou-se a reao abaixo :
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
O
N
O
Complexo Ativado
PM = 5000
35
As quantidades empregadas na reao de ativao do metoxipolietilenoglicol esto descritas na tabela 2 :

Table 1. Amount spent in the methoxy-polyethyleneglycol activation reaction.
Methoxy PEG 5000
15 g
Ethyl Acetate
150 ml
NHS n-hydroxysuccinimide
0.86 g
DCC diciclohexylcarbodiimide
1.55 g
Dentro de um reator de vidro com agitao magntica e aquecimento

controlado, foram colocados o acetado de etila devidamente desidratado (tal
procedimento dispensvel usando-se acetato de etila grau analtico) e o metoxi
PEG j na forma de succinimidil derivado. A mistura foi aquecida ligeiramente at
a completa dissoluo dos reagentes. Aps a conservao a 30 C por 24 horas,
adicionou-se NHS seguido do DCC. Ao termino das 24 horas a massa reacional
foi filtrada e em seguida foi posta para resfriar por 24 horas a 5C, quando ento
foi filtrada para isolar o produto slido que foi lavado com acetado de etila gelado e
em seguida posto para secar a vcuo at peso constante. Em seguida o material
foi dissolvido em 3 vezes a sua massa em benzeno, e em seguida adicionado do
mesmo volume de ter de petrleo, em seguida foi resfriado e filtrado e tal
operao foi repetida por mais duas vezes. O rendimento final em metoxi PEG
succinimida obtido da maneira descrita acima foi de 74,73g de base seca.
Este material foi guardado em frascos com nitrognio e utilizado na
reao de PEGuilao com a albumina bovina.
3.2.7. Preparao da soluo de albumina bovina modificada com metoxi-PEG

Foram adicionados em 3 recipientes: 150 ml de tampo Fosfato alcalino
+ 100 ml de soluo de albumina bovina 40 mg/ml tampo fosfato 0,1 M.
Em cada recipiente adicionou-se respectivamente 1,0 g (BSA-PEG
1:0,25), 2,0 g (BSA-PEG 1:0,5) e 4,0 g (BSA-PEG 1:1) de PEG 5000 ativado.
36
As solues foram mantidas a 30 0C e depois foram transferidas para

uma cmara resfriada a 8 0C, aonde as solues permaneceram em repouso at o
dia seguinte.
As trs amostras foram purificadas em uma coluna de purificao da
marca Sephadex G150 calibrada com tampo Tris 100mM, pH 8,6 e eludas com o
mesmo tampo. Aps este procedimento a soluo de albumina bovina
modificada com PEG 5000 foi fracionada em frascos com volume de enchimento
de 2,0 ml e liofilizadas.
3.2.8. Liofilizao da albumina bovina modificada com metoxi-polietilenoglicol

A liofilizao foi conduzida em um liofilizador da marca FTS Systems,
modelo TDS-00209-A, micro processado pelo programa Liphoware.
O congelamento com taxa de resfriamento de 2,5C/min foi realizado
em um Ultrafreezer com temperatura final de 70C.
A secagem primria foi realizada com temperatura de placa de 16C e
presso interna na cmara de 140 mTorr e temperatura do condensador de
90C. O tempo de secagem primria foi de 20 horas. A secagem secundria foi
realizada com temperatura de placa de 25C, presso interna da cmara de 5
mTorr e temperatura do condensador de 90C. O tempo de secagem secundria
foi de 5 horas. O final da liofilizao foi determinado por um higrmetro acoplado
ao liofilizador. Os frascos foram fechados por rolhas butlicas ainda dentro da
cmara sob presso reduzida de 5 mTorr.
3.2.9. Anlise colorimtrica
A transmitncia da soluo de albumina bovina modificada com metoxipoletilenoglicol foi medida atravs de um colormetro da marca Color Quest XE da
Hunterlab, com raio duplo de xennio e comprimento de onda de 400 a 700
nanmetros.
37
4. RESULTADOS E DISCUSSO
A figura 2 mostra a curva de DSC referente a amostra de albumina
bovina (100 mg/ml) em tampo fosfato (pH = 7,3) durante a anlise trmica da
soluo congelada.
50
Re-cristalizao
Tg
0
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
10
15
20
25
30
-50
He a t flow (m W )
-15
-30
-29
-28
-27
-26
-25
-24
-23
-22
-21
-20
-15.5
-25,56 0C
-100
He a t flow (m W )
-16
-16.5
-150
-17
-200
-17.5
Fuso
-18
T e m p e ra tu ra (C)
-250
Te m pe ra tura (C)
Fig 2. Comportamento trmico da soluo de albumina bovina (100 mg/ml) Tampo Fosfato (pH 7,3 / 0,1 M).
Analisando-se a curva, observou-se um declive referente a uma

transio de segunda ordem na faixa de 25 0C correspondente a temperatura de
transio vtrea (Tg). Alguns autores consideram o valor de Tg como sendo o
ponto mdio na curva medida pelas extenses da linha de base antes e depois da
transio.
Aps a Tg, observou-se um pico exotrmico na faixa dos -15C
possivelmente referente cristalizao dos sais do tampo. temperatura de 8C
observou-se um pico endotrmico atribudo temperatura de fuso da
composio.
38
Em uma liofilizao, durante a secagem primria, quando o gelo

sublimado, o produto deve ser mantido abaixo da temperatura de colapso que,
normalmente, coincide com a transio termotrpica que foi referente
temperatura de transio vtrea da amostra (Tg) ou como a temperatura de
relaxamento da fase amorfa (Ts). Alm disso, necessrio manter a temperatura
da soluo abaixo da temperatura de fuso euttica de qualquer componente
cristalino. Portanto, estas temperaturas foram determinadas utilizando-se o
mapeamento diferencial por varredura (DSC). A secagem de um produto abaixo
da temperatura de colapso tem um custo. Quanto mais baixa a temperatura da
amostra, mais lento e mais caro o ciclo de liofilizao se torna. Em geral, a
liofilizao de um produto abaixo de 40C no vivel. Alm disso, h limites
fsicos nas temperaturas nas quais as amostras podem ser reduzidas, limites
esses que dependem do liofilizador e das caractersticas da amostra (Carpenter
et. al., 1997).
Analisando a figura 3, referente curva de liofilizao da albumina em
relao s diferentes taxas de congelamento empregadas, podemos observar uma
diferena de sete horas na secagem primria, que esta diretamente relacionada
com o tamanho, forma e a distribuio dos cristais de gelo formados durante o
congelamento.
A liofilizao foi conduzida at secagem completa de ambas as
amostras, tendo como base, o controle de umidade residual do prprio
equipamento. As amostras foram congeladas com duas diferentes taxas de
congelamento. Foram liofilizadas sob as mesmas condies: temperatura de placa
e presso, onde, a diferena entre a temperatura de placa e a temperatura de
colapso do material, (Tp Tc), foram constantes para ambas as amostras. A taxa
de congelamento de 2,5C (Ultrafreezer) induziu a formao de cristais de gelo
relativamente maiores do que os cristais de gelo formados durante o
congelamento utilizando-se N2 (30C/min). Por esta razo observou-se uma
diferena de sete horas e meia na secagem primria das amostras.
39
100
3500
80
3000
60
40
2500
1666
1621
1576
1531
1486
1441
1396
1351
1306
1261
1216
1171
1126
1081
991
1036
946
901
856
811
766
721
676
631
586
541
496
451
406
361
316
271
226
181
91
136
1
-20
1500
P re ss o (m Torr)
2000
0
46
Te m pe ra tu ra (C)
20
-40
1000
-60
-80
500
-100
-120
0
T e m p o (m in )
A lbum ina (c ongelam ento lento)
Condens ador
A lbum ina (c ongelam ento rpido)
V c uo Cm ara
Fig.3. Curvas de liofilizao da albumina bovina (100 mg/mL) Tampo Fosfato (pH 7.3 / 0,1 M)
utilizando-se taxa de congelamento de 2,5 0C/min (azul) e taxa de congelamento rpido (vermelho).
Os cristais de gelo, formados durante o congelamento da amostra,

quando sublimados durante a secagem primria deixam espaos intersticiais, que
facilitam e aceleram a sublimao na interface de gelo da soluo.
Alm disso, para assegurar a estabilidade da protena liofilizada por um
longo perodo, a temperatura de transio vtrea (Tg) da fase amorfa no produto, o
qual contm a protena, no deve exceder a temperatura de armazenamento
planejada. Desde que a gua um plasticizante da fase amorfa, preciso baixa
umidade residual para assegurar que a Tg do produto liofilizado seja menor do que
a temperatura mais alta encontrada durante o transporte e o armazenamento
(geralmente maior que 40o C) (Carpenter et. al., 1997).
Aps liofilizao, a albumina bovina p liofilizado foi submetida
anlise trmica por DSC.
Na figura 4 constatou-se um declive na linha de base horizontal na faixa
0
de 48 C durante o aquecimento da albumina bovina p liofilizado com taxa de

40
congelamento de 2,5 oC/min e de 37 oC para a albumina bovina p liofilizado com

taxa de congelamento de 30 0C/min. (figura 5).
0.5
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
-1.4
45
-0.5
46
47
48
49
50
-1.45
-1.5
48,97 0C
-1.55
mW
-1
mW
Tg
-1.6
-1.65
-1.7
-1.5
-1.75
Temperatura (C)
-2
-2.5
-3
Te m pe ra tura (C)
Fig 4. Transio vtrea do p liofilizado da albumina bovina (100 mg/ml) Tampo Fosfato (pH 7,3 /
0,1 M), taxa de congelamento (2,5 0C/min.), umidade residual : 4,6 %.
41
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
mW
Tg
-2
-1 . 5
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
-1 . 5 2
-1 . 5 4
-1 . 5 6
37,47 0C
-1 . 5 8
-1 . 6
-1 . 6 2
-1 . 6 4
-1 . 6 6
-4
T e m p e ra tu ra (C )
Fig 5. Transio vtrea do p liofilizado da albumina bovina (100 mg/ml) Tampo Fosfato (pH 7,3
/ 0,1 M), taxa de congelamento ( 30 0C/min.), umidade residual : 11 %.
Estes decaimentos nas linhas horizontais de base referem-se Tg do

p liofilizado com umidade residual mdia de 4,6% e 11 % respectivamente.
Os valores de pH da albumina reidratada aps a liofilizao no
apresentaram diferenas significantes (desvio padro: 0,004).
A mdia dos valores de pH das amostras de albumina bovina liofilizada
com taxa de congelamento de 2,5 0C/min foi de 7,2 e para as amostras de
albumina bovina liofilizada com taxa de congelamento de 30 0C/min. foi de 7,1.
A albumina bovina foi liofilizada nas mesmas condies de secagem
(temperatura e presso), porm variando-se a taxa de congelamento. Observouse que o tempo de secagem primria foi maior para a albumina liofilizada com taxa
de congelamento de 30 0C/min. resultando em um maior valor de umidade residual
(11%), o que permite supor que o congelamento lento, com umidade residual de
4,6 % pode ter causado danos estruturais liberando a gua estrutural que foi
removida durante a liofilizao.
42
100
O congelamento utilizando-se a taxa de 30C/min induziu a formao

de pequenos cristais de gelo, os quais dificultam a sada do vapor de gua durante
a secagem primria.
Devido este fator, supe-se que a umidade residual da albumina
bovina
liofilizada
utilizando-se
taxa
de
congelamento
de
30C/min
foi
significantemente maior em virtude do tipo de congelamento empregado.

A figura 6 representa a determinao das regies da Amida I, II e III por
espectroscopia Raman da soluo de albumina bovina Tampo Fosfato (pH 7,3,
0,1 M) largamente usadas para caracterizar a estrutura secundria da cadeia
polipeptdica de uma protena.
0.0035
Amida I
-hlice
0.003
Amida III
-hlice
-hlice
C-C-N
U nidade R aman (v alor arbitrrio)
0.0025
0.002
0.0015
0.001
Folhas
Amida III
Pontes de dissulfeto
S-S
0.0005
0
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
comprime nto de onda (cm-1)
Fig.6. Espectro Raman das regies da Amida I, II e III da soluo de albumina bovina (100
mg/mL) Tampo Fosfato (pH 7.3) (0,1 M).
A amida I caracterizada pelo estiramento C=O, enquanto que a amida

III apresenta grande contribuio na vibrao de deformao N-H no plano e
pequena contribuio do estiramento C-N.
43
Na tabela 3 mostrado o intervalo em que aparecem as freqncias

Raman dos modos (C=O) da amida I e (NH) da amida III, para as protenas
contendo estruturas secundrias em -hlice, folhas- e ao acaso.
Tabela 3. Intervalo entre as freqncias Raman dos modos (C=O) da amida I e (NH)
da amida III, para as protenas contendo estruturas secundrias em -hlice, folhas- e
ao acaso (Grdadolnik,2001).
Conformao
Amida I (cm-1)
Amida III (cm-1)
-Hlice
1645 1660
1265 1300
Folhas
1665 1680
1230 1240
Ao acaso
1660 1670
1240 1260
Estes valores esto bem prximos aos valores encontrados no espectro

Raman da soluo de albumina bovina.
Estes intervalos espectrais caractersticos das amidas I e III resultaram
de estudos Raman detalhados sobre polipeptdeos modelos, homopolipeptdeos e
protenas de conformao bem conhecida, onde se verificou a correlao entre
freqncia e estrutura.
Uma banda intensa na regio de 900-1000 cm-1, atribuda ao
estiramento C - C N, tambm sensvel conformao.
Protenas contendo ligao dissulfeto, CCSSCC, apresentam banda
Raman caracterstica, relativamente intensa, na regio 500 - 800 cm-1, atribuda ao
modo de estiramento S-S-. Existe uma correlao entre esta freqncia e a
conformao. Assim, freqncias de (S - S) em 510, 525 e 540 cm-1 so
esperadas quando os dois stios trans em relao aos tomos de enxofre so
ocupados, respectivamente, por: 2 tomos de hidrognio, um hidrognio e um
carbono, ou 2 tomos de carbono.
Os grupos cistina e metionina, em protenas, do origem a vibraes de
estiramento C-S na regio de 600-750 cm-1 (Sturat, 1997).
A albumina nativa contm predominantemente estruturas -hlice,
caracterizada por fortes picos de abundncia em 1654 cm
e 1000 cm-1 . Estes
resultados esto de acordo com o trabalho realizado por Chen et. al., 1975.
44
A variao na intensidade destes picos est relacionada com o

contedo das estruturas de -hlice.
Analisando a figura 7, observou-se que aps a liofilizao da albumina
bovina ocorreram alteraes significativas nas estruturas de -hlice e tambm
nas estruturas folhas , atribudas faixa espectral entre 1620 a 1640 cm-1.
0.012
Intensidade Raman (unidade arbitrria)
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
1600
1610
1620
1630
1640
1650
1660
1670
1680
1690
1700
Com prim e nto de onda (cm -1)
Albumina nativa
Albumina reidratada (2,5 C/min)
Albumina Reidratada (30 C/min)
Albumina p liofilizado (30 C/min)
Albumina p liofilizado (2,5 C/min)
Fig.7. Espectro Raman da albumina bovina (liofilizada e reidratada) na regio Amida I (contedo e
posio das estruturas -hlice).
A freqncia destas bandas depende da fora de ligao das pontes de

hidrognio na estrutura das folhas e tambm do tipo de ligao dos dipolos de
transio.
Analisando a figura 8, a diferena na intensidade das estruturas hlice (1654 cm-1 e 1000 cm-1) est diretamente relacionada com o nvel de
desdobramento protico e agregao.
45
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
800
850
900
950
1000 1050 1100 1150
1200 1250 1300 1350
1400 1450 1500 1550 1600
1650 1700 1750
comprimento de onda (cm-1)

Albumina nativa
Fig.8. Espectro Raman da albumina bovina (liofilizada e reidratada).
A agregao protica induzida pela temperatura tambm est

associada com a formao de estruturas folhas antiparalelas representadas pela
banda 1623 cm-1.
A albumina liofilizada com taxa de congelamento de 2,5C/min
apresentou maior alterao estrutural quando comparada albumina liofilizada
com taxa de congelamento de 30C/min.
Nota-se bruscas diferenas nas intensidades das estruturas de -hlice
principalmente nas bandas 1654 e 1000 cm-1.
Entretanto, aps a reidratao a albumina volta a apresentar a
conformao estrutural original.
Quando
comparada
com
albumina
liofilizada
com
taxa
de
congelamento de 2,5C/min, a albumina congelada em nitrognio lquido

46
apresentou uma melhor recuperao do estado nativo. Provavelmente, o

congelamento rpido impediu o crescimento abrangente dos cristais de gelo na
crioconcentrao da protena, retardando substancialmente as alteraes
estruturais da albumina bovina.
A figura 9 mostra o estiramento das pontes de dissulfeto caracterizadas
pelas bandas compreendidas entre 500 a 800 cm-1.
0.0055
0.005
0.0045
0.004
0.0035
0.003
0.0025
0.002
0.0015
0.001
500
550
600
650
700
750
800
comprimento de onda (cm-1)

Albumina nativa
Fig.9. Espectro Raman da albumina bovina (liofilizada e reidratada) na regio das pontes de dissulfeto.
A espectroscopia Raman vem sendo empregada extensivamente para a

determinao da conformao das pontes de dissulfeto (S-S) em protenas e
polipeptdeos, pois a freqncia atribuda ao estiramento do modo S-S sensvel
a esta conformao (Nakamura et. al., 1997).
47
Podemos
observar
que
albumina
liofilizada
com
taxa
de
congelamento de 2,5C/min apresentou um maior grau de estiramento e desordem

estrutural relacionados s pontes de dissulfeto quando comparada com a
albumina congelada por nitrognio lquido.
Mesmo aps a reidratao a albumina no foi capaz de adquirir sua
conformao estrutural original.
Em uma viso geral dos resultados, observou-se uma aparente
discrepncia entre os teores de umidade das amostras liofilizadas, a qual pode ser
explicada pelas alteraes estruturais observadas nas amostras liofilizadas aps o
congelamento lento sugerindo portanto que o congelamento lento favoreceu a
eliminao da gua estrutural da albumina bovina alterando seu estado
conformacional.
Aps o estudo realizado com a albumina nativa prosseguiu-se com as
anlises da albumina bovina modificada com o metoxi-polietilenoglicol.
As figuras 10,11 e 12 representam o mapeamento trmico da albumina
bovina com taxas de PEGuilao 1:0,25, 1:0,5 e 1: 1 respectivamente.
0
-5 0
-4 5
-4 0
-3 5
-3 0
-2 5
-2 0
-1 5
-1 0
-5
10
15
20
25
30
-1 0
Tg
cristalizao
3.7
-2 0
3.65
-3 0
3.6
mW
Mw
3.55
-4 0
3.5
-5 0
3.45
- 28,27 0 C
3.4
-6 0
3.35
-7 0
3.3
-30
-29.5
-29
-28.5
-28
-27.5
-27
-26.5
-26
-25.5
-25
Temperatura (C)
-8 0
Fuso
T e m p e r a tu r a (C)
Fig.10. Anlise trm ica por DSC da soluo BSA-PEG (1:0,25). O grfico ilustra os eventos ocorridos
durante o aquecimento da soluo congelada.
48
cristaliza o
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
10
15
20
25
30
35
-10
Tg
-3
-20
-19
-18
-17
-16
-15
-14
-13
-12
-11
-10
-20
-3.5
-30
-4
mW
mW
-15,61 0 C
-40
-4.5
-50
-5
-60
-5.5
Te m pe ra tura (C)
F u so
-70
T e m p e ra tu ra (C )
Fig.11. A nlise trm ica por D S C da soluo B S A -P E G (1:0,5). O grfico ilustra os eventos ocorridos
durante o aquecim ento da soluo congelada.
0
-5 0
-4 5
-4 0
-3 5
-3 0
-2 5
-2 0
-1 5
-1 0
-5
10
15
20
25
30
cristalizao
-5
Tg
-1 0
-3 . 5
-2 0
-1 9
-1 8
-1 7
-1 6
-1 5
-1 4
-1 3
-1 2
Mw
-4
-1 5
Mw
-4 . 5
- 14,46 0 C
-2 0
-5
-5 . 5
-2 5
Fuso
-6
T e m p e r a tu r a (C )
-3 0
T e m p e r a tu r a (C )
Fig.12. Anlise trmica por DSC da soluo BSA-PEG (1:1). O grfico ilustra os eventos ocorridos
durante o aquecimento da soluo congelada.
49
Todas as amostras apresentaram um declive endotmico referente a

uma transio de segunda ordem denominada Tg. Aps a Tg observou-se um
pico exotrmico referente cristalizao de alguns componentes da soluo de
BSA-PEG, como por exemplo, os sais do tampo da soluo e a cristalizao
parcial do prprio polietilenoglicol. As amostras de BSA-PEG em diferentes taxas
de PEGuilao apresentaram um pico endotrmico de fuso entre 3 e 6 0C.
As liofilizaes da BSA-PEG 1:0,25 e 1:0,5 foram conduzidas sob as
mesmas condies de processo (temperatura, presso e tempo).
Na figura 13, no observou-se nenhuma diferena relacionada ao
comportamento do material durante a liofilizao.
2500
40
20
2000
1483
1444
1405
1366
1327
1288
1249
1210
1171
1132
1093
1054
976
1015
937
898
859
820
781
742
703
664
625
586
547
508
469
430
391
352
313
274
235
196
157
79
118
40
-20
Pre ss o (m Torr)
Te m pe ra tura (C)
1500
-40
1000
-60
-80
500
-100
-120
0
Te m po (m inutos)
Temperatura Condensador (C)
Temperatura BSA-PEG 1:0,25
Temperatura BSA-PEG 1:0,5
Presso Cmara (mT)
Fig.13. Comparao entre as curvas de liofilizao das solues BSA-PEG (1:0,25) e (1:0,5).
As solues apresentaram comportamento semelhante durante a secagem.
50
As figuras 14 e 15 representam o mapeamento trmico por DSC do p

liofilizado da BSA-PEG 1:0,25 e 1:0,5 respectivamente. Observou-se um aumento
no valor da Tg do material. A BSA-PEG 1:0,25 apresentou um pico na faixa de
57 0C relacionado decomposio do material durante o aquecimento da amostra.
O mesmo evento no foi observado durante o aquecimento da BSA-PEG 1:0,5. A
BSA-PEG aps a PEGuilao na taxa 1:1 comportou-se como um material
gelatinoso, impedindo a sublimao da gua durante a secagem, provocando o
colapso do material. No foi possvel a continuidade dos estudos da BSA-PEG 1:1
devido s dificuldades encontradas durante a liofilizao do material.
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
-1
5
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Tg
14,11 0C
-1.2
-1
mW
mW
-1.1
-1.3
-1.4
-1.5
-2
-1.6
Temperatura (C)
Decomposio
-3
Temperatura (C)
Fig.14. Anlise trmica por DSC da BSA-PEG (1:0,25) p liofilizado. O grfico ilustra o evento da Tg
durante o aquecimento da amostra. Observou-se um pico (57 0C) referente decomposio da amostra.
Umidade residual ( 6,4 %).
51
0.5
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
-1.4
45
-0.5
46
47
48
49
50
-1.45
-1.5
47,65 0C
mW
-1.55
-1
-1.6
mW
Tg
-1.65
-1.7
-1.5
-1.75
Temperatura (C)
-2
-2.5
-3
Temperatura (C)
Fig.15. Anlise trmica por DSC da BSA-PEG (1:0, 5) p liofilizado. O grfico ilustra o evento da Tg
durante o aquecimento da amostra. Umidade residual ( 5,3 %).
Aps a secagem do material, realizou-se a determinao do teor de

umidade residual das amostras.
Na figura 16 podemos observar uma diferena no contedo de umidade
residual em relao s diferentes taxas de PEGuilao. Quanto maior a taxa de
PEGuilao utilizada, maior a quantidade de stios hidroflicos ocupados,
consequentemente menor a reteno de gua pelo sistema.
52
Umidade (%)
6,5
6
5,5
5
4,5
4
BSA-PEG (1:0,25)
BSA-PEG (1:0,5)
Fig.16. Comparao dos valores de umidade residual da BSA-PEG p liofilizado em

diferentes taxas de PEGuilao.
A figura 17 mostra que os valores de pH da BSA-PEG 1:0,25 e 1:0,5

no apresentaram diferenas significativas aps a liofilizao e reidratao (desvio
padro : 0,016). Entretanto observou-se uma diferena nos valores de pH entre as
amostras com diferentes taxas de PEGuilao.
53
7.2
6.8
6.6
pH
6.4
6.2
5.8
B S A -P E G
(1:0,25)
s olu o
B S A -P E G
(1:0,25)
reidratada
B S A -P E G
(1:0,5)
s olu o
B S A -P E G
(1:0,5)
reidratada
B S A -P E G
(1:1)
s olu o
Fig.17. Comparao dos valores de pH das solues de BSA-PEG em diferentes taxas de

PEGuilao.
Analisando a figura 18 podemos observar que a modificao da

albumina bovina com o metoxi-polietilenoglicol provocou alteraes estruturais na
protena devido s diferentes intensidades e localizaes dos picos de
absorbncia no espectro Raman.
Notou-se uma perda na estrutura -hlice indicado pela diminuio de
intensidade na banda 1654 cm-1.
A BSA-PEG 1:0,25 apresentou uma menor variao nas estruturas hlice (1654 cm-1) em relao BSA-PEG. 1:0,5 e 1:1.
Ainda na regio da Amida III, as bandas entre 1230 e 1240 cm-1,
atribudas s estruturas folhas- tambm apresentaram alteraes espectrais,
tanto na posio quanto na intensidade, aps a modificao com o PEG.
54
In t e n s id a d e R a m a n ( v a lo
0 .0 0 3 5
B S A - P E G (1 : 0 , 2 5 ) n a t iv a
0 .0 0 3
-hlice
0 .0 0 2 5
C-C-N
B S A n a t iv a
Folha-
AmidaIII
-hlice
AmidaI
0 .0 0 2
0 .0 0 1 5
0 .0 0 1
0 .0 0 0 5
9 00
1 00 0
1 1 00
1 2 00
1 30 0
14 0 0
1 5 00
1 60 0
1 70 0
c o m p r im e n t o d e o n d a ( c m - 1 )
0 .0 0 3 5
( 1 :0 , 5 ) n a ti v a
B S A n a t iv a
I n t e n s id a d e R a m a n
B S A -P E G
0 .0 0 3
0 .0 0 2 5
0 .0 0 2
0 .0 0 1 5
0 .0 0 1
0 .0 0 0 5
9 0 0
1 0 0 0
1 1 0 0
I n t e n s id a d e R a m a n ( v
0 .0 0 3 5
1 2 0 0
1 3 0 0
c o m p r im e n to
B S A n a t iv a
1 4 0 0
d e o n d a
1 5 0 0
1 6 0 0
1 7 0 0
1 60 0
17 0 0
(c m -1 )
B S A -P E G 1 :1
0 .0 0 3
0 .0 0 2 5
0 .0 0 2
0 .0 0 1 5
0 .0 0 1
0 .0 0 0 5
90 0
10 0 0
1 1 00
1 20 0
1 30 0
14 0 0
1 5 00
c o m p r i m e n to d e o n d a (c m -1 )
Fig.18. Comparao do espectro Raman entre as solues de BSA nativa (vermelho) e a

BSA-PEG (azul) em diferentes taxas de PEGuilao.
55
O aumento de intensidade nas bandas relacionadas s estruturas de

folhas um sinal caracterstico de agregao protica, induzida pelo aumento
das interaes moleculares entre o grupo H+, pois estes grupos polares precisam
satisfazer as necessidades de ligaes de pontes de hidrognio atravs das
interaes intra ou intermoleculares ocasionadas pela remoo da gua.
A albumina bovina na forma nativa contm em sua estrutura uma maior
quantidade de grupos hidroflicos no disponveis em relao albumina
Peguilada.
Podemos observar que quanto maior a quantidade de PEG ligada
albumina, menor a manuteno da estrutura secundria, ocasionada pela baixa
reteno de gua pelos grupos hidroflicos.
Na figura 19 podemos observar que o p liofilizado da albumina bovina
modificada com o PEG na proporo 1:0,25 apresentou uma melhor manuteno
da estrutura secundria da protena.
0.03
-hlice
Amida I
In te n sid a d e Ra m a n (va lo r a rb itr ri
0.025
-hlice
Amida III
0.02
-hlice
C-C-N
folha-
Amida III
0.015
0.01
0.005
0
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
1250
1300
1350
1400
1450
1500
1550
1600
1650
c o m p rim e n to d e o n d a (cm -1 )
B S A -P E G (1:0,25) p liofiliz ado
B S A -P E G (1:0,5) p liofiliz ado
B S A p liofiliz ado
Fig.19. Comparao do espectro Raman do p liofilizado entre a BSA nativa e a BSA-PEG em

diferentes taxas de PEGuilao
.
56
1700
Este resultado pode estar relacionado com uma menor taxa de

alterao e/ou quebras das pontes de hidrognio e foras de Van der Walls.
As figuras 20 e 21 mostram que a BSA-PEG (1:0,25) apresentou
melhores resultados de manuteno estrutural, aps a liofilizao e reidratao
quando comparada com a BSA-PEG (1:0,5).
0.0025
In te n sid ad e R aman (v alo r ar b itr r
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
c o m p r im e n to d e o n d a (c m -1 )
B S A -P E G (1: 0, 25 ) na tiva
B S A -P E G (1: 0, 25 ) re idrat ada
Fig.20 Comparao do espectro Raman entre as solues de BSA-PEG (1:0,25) nativa e a BSAPEG (1:0,25) reidratada
57
0.0025
Inte n sid a de Ra m a n (va lo r a rb itr rio
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
co m p rim e n to d e o n d a (cm -1)
B S A -P E G (1:0,5) nativa
B S A -P E G (1:0,5) reidratada
Fig.21. Comparao do espectro Raman entre as solues de BSA-PEG (1:0,5) nativa e a BSAPEG (1:0,5) reidratada.
Trs bandas 1620, 1630 e 1690 cm-1 atribudas vibrao das folhas-
antiparalelas sofreram diferentes nveis de alteraes.
As regies da amida I e III apresentaram alteraes estruturais em
diferentes nveis em relao s diferentes taxas de PEGuilao.
A manuteno da conformao estrutural da albumina bovina est
diretamente relacionada com a reteno de gua pelos grupos NH2 ligados
lisina.
A banda com comprimento de onda de 1000 cm-1 relacionada com
estruturas -hlice (C-C-N) praticamente desapareceu aps a modificao da BSA
com o PEG na proporo 1: 0, 5.
Aps a reidratao do p liofilizado, a distribuio de intensidade na
banda entre 1320-1340 cm-1 relacionadas s cadeias laterais alifticas foi maior
para a BSA-PEG (1:0,25).
As alteraes espectrais induzidas pela liofilizao na regio da amida I
so devidas ao desdobramento da protena pela perda de gua estrutural durante
a liofilizao. Os efeitos intrnsecos da remoo da gua nas propriedades de
58
oscilao nas ligaes peptdicas, e, por conseguinte, no espectro infravermelho

da protena, foram tidos insignificantes por Prestrelski e outros (1998). Se os
efeitos diretos de oscilao da remoo da gua foram responsveis pelas
alteraes espectrais induzidas pela secagem, ento o espectro infravermelho de
todas as protenas deveria ser alterado para o mesmo grau no estado liofilizado, o
que no o caso.
Observou-se dois comportamentos diferentes da BSA-PEG com
desdobramento estrutural no estado liofilizado:
A BSA-PEG 1:0,25 recuperou boa parte da conformao original aps

reidratao (desdobramento reversvel) ;
Uma frao significativa das molculas de BSA-PEG 1:0,5 agregaram-se com

a reidratao (desdobramento irreversvel).
Tem sido documentado com vrias protenas, que a preveno da
agregao e o restabelecimento da atividade aps a reidratao correlaciona-se

diretamente com a reteno da estrutura original no slido seco ( Carpenter et. al.,
1999).
Analisando as figuras 22 e 23 referentes aos resultados de
transmitncia das solues de BSA e BSA-PEG pode-se observar que a
conjugao BSA-PEG alterou a translucidez da soluo em relao s diferentes
taxas de PEGuilao. Quanto maior a concentrao de PEG utilizada na
modificao, menor a transmitncia da soluo. Porm no observou-se
diferenas de transmitncia aps a reidratao
das amostras. No foram
realizadas anlises de viscosidade, porm observou-se um aumento de

viscosidade da soluo conforme o aumento de PEG utilizado para a modificao
da protena.
Na figura 24 observou-se que no houve diferena de cor no p
liofilizado entre as amostras modificadas com diferentes taxas de metoxipolietilenoglicol.
59
120
I n te n si d a d e T r a n sm i t n
100
80
60
40
20
0
400
450
500
550
600
650
700
C o m p r i m e n to d e O n d a (n M )
B S A -P E G (1 : 0 , 5 ) n a t iva
B S A -P E G (1 : 0 , 5 ) re id ra t a d a
T R A N S M IT H 2 O D E S T IL A D A
B S A 1 0 % R e id ra t a d a
B S A -P E G (1 : 0 , 2 5 ) n a t iva
B S A -P E G (1 : 0 , 2 5 ) R e id ra t a d a
B S A 1 0 % n a t iva
Fig.22. Comparao entre os comprimentos de ondas na transmitncia da luz da BSA nativa e

BSA-PEG soluo em diferentes taxas de PEGuilao.
BSA
1 0 0 m g/m L
B S A -P E G
1 :0 ,2 5
B S A -P E G
1 :0 ,5
B S A -P E G
1 :1
F ig .2 3 . A lte ra o n a tra n s lu c id e z d a s o lu o d e a lb u m in a b ov in a a p s a m o d ific a o c o m o m e to x ip o lie tile n o g lic o l.
60
BSA
100 mg/mL
BSA-PEG
1:0,25
BSA-PEG
1:0,5
Fig.24. P liofilizado da albumina bovina modificada com diferentes taxas de metoxi-polietilenoglicol.
61
5. CONCLUSES
O presente trabalho permitiu estabelecer as seguintes concluses:
A liofilizao com taxa de congelamento de 30C/min apresentou
menores oscilaes espectrais nas regies da amida I, III e pontes de dissulfeto
favorecendo a manuteno da conformao estrutural da protena;
A albumina bovina liofilizada com taxa de congelamento de 30
0
C/min. apresentou desdobramento estrutural durante a liofilizao, mas
recuperou a conformao original aps a reidratao (desdobramento reversvel);

A albumina bovina liofilizada com taxa de congelamento de 2,5
0
C/min. apresentou desdobramento estrutural durante a liofilizao e agregao
aps a reidratao (desdobramento irreversvel), caracterstica desfavorvel em

relao manuteno da estrutura secundria da protena ;
O congelamento lento favoreceu a eliminao da gua estrutural da
albumina bovina nativa diminuindo o tempo de secagem durante a liofilizao
porm alterando a estrutura conformacional da molcula ;
Aps a modificao da albumina bovina com metoxi-polietilenoglicol,
a BSA-PEG 1:0,25 apresentou um menor grau de alterao estrutural e
conseqentemente uma menor variao das caractersticas fsicos-qumicas da
protena quando comparada com a BSA-PEG 1:0,5.
A modificao da albumina bovina com o metoxi-polietilenoglicol
aumentou a temperatura de transio vtrea para a soluo protica e para o p
liofilizado otimizando as condies de liofilizao e de armazenamento abaixo da
temperatura de colapso do material;
A liofilizao no alterou a cor do p liofilizado, independente da taxa
de modificao com o PEG utilizada favorecendo as caractersticas relacionadas
elegncia farmacutica em um produto.
Todas as temperaturas crticas para a liofilizao da albumina bovina
modificada com o PEG para as taxas de 1:0,25, 1:0,5 e 1:1 foram determinadas;
O controle do teor de umidade residual do p liofilizado importante
para a manuteno da estrutura secundria da protena;
A regenerao da estrutura nativa da protena, aps a reidratao,
depende da manuteno de boa parte de sua gua estrutural.
62
Com o objetivo de se manter o efeito teraputico (reduo da

imonogenicidade, aumento da T//2 (meia vida da droga no organismo) associado a
manuteno das propriedades fsico-qumicas e estruturais da protena,
recomenda-se um estudo mais aprofundado, para a determinao da taxa ideal de
modificao molecular com o PEG, visto que a modificao molecular da BSA
resultou em diferentes nveis de alteraes estruturais.
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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

EFEITO DA LIOFILIZAO SOBRE A ESTRUTURA E MUDANAS DE FASE

VIRGILIO TATTINI JUNIOR

EFEITO DA LIOFILIZAO SOBRE A ESTRUTURA E MUDANAS DE FASE

VIRGILIO TATTINI JUNIOR

VIRGILIO TATTINI JUNIOR

So Paulo, 02 de Abril de 2004.

Dedico este trabalho

Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo.

Na medida em que a gua to comumente encontrada e utilizada em

1.1. Modificao qumica de protenas

1.1.1. Propriedades do polietilenoglicol (PEG)

1.1.2. Succinimidil PEG

1.2. Estabilidade protica

1.2.1. A albumina bovina

1.3.1. Congelamento: a primeira etapa na liofilizao

1.4. DSC, temperatura de transio vtrea e estabilidade da protena

1.5. Espectroscopia Raman

1.6. Umidade residual

3.2.1. Soluo de BSA

3.2.2. Determinao da temperatura de transio vtrea

3.2.3. Anlise estrutural

3.2.4. Determinao do teor de umidade residual

3.2.5. Liofilizao da albumina bovina nativa

3.2.6 Sntese do metoxi-poietilenoglicol 5000

3.2.7. Preparao da soluo de albumina bovina modificada com metoxi-PEG 26

3.2.9. Anlise colorimtrica

C/min.) favoreceu a manuteno da estrutura

conformacional da protena aps a liofilizao, porm aumentou o tempo de

PEG conjugation masks the proteins surface and increases the

C/min.). After the modification of bovine serum albumin with

Tabela 1. Relao entre atividade, imunoreatividade e grau de modificao obtido

Peso molecular Grau de modificao

Parnteses: nmero de grupos aminas ligadas a cada reagente modificado.

modificao molecular usando o PEG o aumento da meia-vida (T1/2) e da

caractersticas podem ser atribudas, em parte, pelo aumento do peso molecular

tratamento de crianas que apresentam severa deficincia de ADA combinada

solubilizao de enzimas e substncias bioativas em solventes orgnicos ou

tornar protenas no imunognicas;

prolongar o tempo de liberao da droga protena PEG in vivo;

estabilizar a funo fisiolgica de protenas e substncias bioativas;

modificar a farmacocintica de vrias drogas;

separar macromolculas biolgicas, membranas, partculas celulares e clulas.

com pesos moleculares caractersticos que variam de 500 a 20.000 Daltons

biodistribuio e a solubilidade de drogas peptdicas e no peptdicas. Estas

Alternativamente, o carboximetil ou o PEG de carboxietil tambm esto

1.2.1. A albumina bovina

armazenamento da protena liofilizada (Carpenter et. al., 1999).

Alm do mais, a simples obteno de uma protena com

A temperatura de transio vtrea caracterizada pelo aumento da

desdobramento ou desnaturao da protena. Assim, a taxa de agregao protica

fortemente afetada pelo pH, tal como a aglutinao de interleucina 1 (IL-1),

tampo de fosfato de potssio no apresenta alteraes significativas de pH

pode ir mais devagar devido a superfcies de rea menores, limitando a desoro

correlacionou bem (r = 0,995) com a rea da superfcie interna do produto slido

dos agentes estabilizantes (mais comumente

acares ou poliis), as formulaes liofilizadas exibem freqentemente uma

C, 13 C para a lisozima, 9 C para a lactato desidrogenase e 11 C para o

O mapeamento trmico tem de mostrar uma clara descontinuidade do fluxo de

Deve ser possvel mapear antes e depois da transio, de forma reversvel

Ao manter uma amostra isotermicamente acima de Tg, a cristalizao deve

cristalizao pode levar menos de 10 min para a lactose e sacarose amorfas

temperatura para apagar qualquer estrutura residual vtrea, que permanea de