Desarrollo de Metodos PDF

DESARROLLO DE
MTODOS POR HPLC
INTRODUCCIN
Los problemas en Cromatografa Lquida se presentan en dos
categoras. El primer tipo de problema esta asociado con la
instrumentacin. Problemas con las vlvulas checks, la lmpara del
detector, el inyector, las tuberas y otros elementos fsicos que
pueden ser muy irritantes, pero la solucin usualmente es simple
una vez la causa ha sido identificada. Muchos problemas
instrumentales pueden ser prevenidos por medio de una disciplina
de mantenimientos preventivos. El segundo tipo de problemas esta
asociado con la separacin en s, picos poco simtricos, inadecuada
separacin, poca retencin son algunos ejemplos de los problemas
de la separacin. Desafortunadamente, los sntomas en los
problemas de la separacin pueden ser obvios, pero identificar la
fuente del problema es muy difcil y corregirlo es en algunos
casos imposibles.
LC-GC, 12, 1999.
INTRODUCCIN
El desarrollo del mtodo se encara desde
un punto de vista emprico?
INTRODUCCIN
Se intenta la separacin para ver si sale algn pico
Se cambia la columna, el pH, etc.
Se agregan aditivos (ej. TEA) sin ninguna lgica
Recurriendo as a interminables pruebas de ensayo-error
Por lo tanto no es extrao encontrarnos mtodos:

Con el kprximo a t0
Con picos parcialmente solapados
Con FMs muy agresivas para la columna
Con coleo muy pronunciado
INTRODUCCIN
LA FILOSOFIA DE REALIZAR UN COMPLETO DESARROLLO DE
METODOS TIENE VARIAS VENTAJAS:
Un buen desarrollo de mtodo puede no requerir
modificaciones o re-desarrollos durante su uso, obteniendo
un gran ahorro. Un mtodo mal desarrollado genera un gasto
adicional, perdida de productividad.
los Cromatografistas pueden determinar los parmetros de
la separacin (porcentaje de modificador orgnico, pH,
temperatura, reproducibilidad de la columna) asegurando la
robustez y la reproducibilidad del mtodo
INTRODUCCIN
Dado que el desarrollo es costoso y requiere de mucho tiempo,
es preferible emplear caminos sistemticos efectuando
ensayos con buenas probabilidades de xito, evitando ensayos
innecesarios y documentando los resultados
PRINCIPALES PASOS PARA EL DESARROLLO DEL MTODO
PASOS PARA EL DESARROLLO

DE MTODOS POR HPLC
1. INFORMACIN DE LA MUESTRA, DEFINIR LAS METAS DE LA SEPARACIN
2. RECOLECCIN DE DATOS: NECESITA UN PROCEDIMIENTO
ESPECIAL DE HPLC, PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA
3. ELECCIN DEL DETECTOR
4. ELECCIN DEL MTODO LC: CORRIDO PREELIMINAR;
ESTIMAR LA MEJOR CONDICIN DE SEPARACIN
5. OPTIMIZAR LAS CONDICIONES DE LA SEPARACIN
6. CHEQUEO DE PROBLEMAS O REQUERIMIENTOS
PARA PROCEDIMIENTOS ESPECIALES
7a. RECUPERACIN
MATERIAL PURO
DE
7b. MTODO CUANTITATIVO
7b. MTODO CUALITATIVO
8. VALIDACIN DEL MTODO Y TRABAJO DE RUTINA
BASES DE LA SEPARACIN
Separacin hipottica de los productos A, B y C, en equilibrio entre la fase mvil

(m) y la estacionaria (e). S representa las molculas de fase mvil
CONCEPTOS GENERALES
EL CROMATOGRAFO LQUIDO ESTAR CONSTITUIDO POR:
Un reservorio de solvente que alimenta el sistema con la fase mvil
Un sistema que permite la introduccin de la muestra: inyector
Un sistema para forzar el pasaje de la muestra a la fase mvil a travs de la
columna: la bomba
Un sistema de monitoreo de la solucin que emerge de la columna: el
detector
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Segn la ASTM y la IUPAC
CROMATOGRAMA:
Un grafico u otra representacin de la respuesta del detector,

concentracin del efluente u otra cantidad usada como una medida de
la concentracin del efluente, versus el volumen de efluente o tiempo.
Las abscisas corresponden al tiempo durante el cual se efectu el
anlisis. las ordenadas corresponden a la seal analgica proveniente
del detector. La altura de la seal indica en cada momento la
intensidad de la respuesta, en general proporcional a la
concentracin del soluto (rea bajo la curva).
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Volumen de Elucin (Ve):
Es el volumen de fase mvil eluida entre la inyeccin y la
elucin de la concentracin mxima del soluto. A flujo
constante, el tiempo transcurrido entre dichos puntos corresponde al
tiempo de elucin o tiempo de retencin.
Volumen Muerto (V0):
Es el volumen total de solvente entre el punto de inyeccin y el de
deteccin. En RPLC se detecta empleando soluciones diluidas de
nitrato de sodio, dicromato de potasio o tiourea.
Lnea Base:
Es la porcin del cromatograma donde slo se aprecia la elucin de la
fase mvil, sin seal debida al soluto
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Tiempo de Retencin (tR):

Tiempo medido entre la inyeccin y la elucin de la concentracin
mxima del soluto ensimo (mxima seal). La distancia entre este
mximo de la seal y la lnea de base es la altura del pico (hp) en
cuestin
Tiempo de Retencin Neto o Relativo (tR):
Dado que el volumen extracolumnar depende de varios factores ajenos
a la separacin misma, es frecuente expresar el tiempo de retencin
neto de un pico determinado como diferencia entre su tiempo de
retencin y el tiempo muerto en lugar del tiempo de retencin
absoluto.
t = t t
R
Volumen de Retencin:
VR = t R (min).F (mL. min 1 )
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Velocidad Lineal (u):
Si L es la longitud de la columna expresada en cm y t0 el tiempo
muerto medido en segundos, la velocidad lineal medido en
centmetros por segundos puede calcularse como:
L
u=
t0
Factor de Capacidad (k):
moles _ de _ soluto _ en _ la _ fase _ estacionaria

k=
moles _ de _ soluto _ en _ la _ fase _ mvil
(
t R t0 )
k=
t0
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Factor de Capacidad (k):
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Factor de Separacin ()
Cociente entre los factores de capacidad (k) de un par de picos.
k2
k1
Resolucin ( R ):
Expresin cuantitativa de la calidad de la separacin
R=
(t2 t1 )
1 (w + w )
1
2 2
Ancho de pico (w):

Es utilizado para medir la eficiencia de la columna, la resolucin, etc.
w0.5 (a mitad de la altura) y w0.1 (al 10% de su altura)
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Platos tericos:
La eficiencia de una columna cromatogrfica y por lo tanto su poder
separativo se mide en funcin de su numero de platos tericos
2
tR
N = 16
El termino altura equivalente de platos terico se expresa con la

siguiente ecuacin: L es la longitud de la columna
L
H=
N
H y N dependen de el dimetro, morfologa, calidad de las partculas,
la calidad del empaquetamiento, el envejecimiento, deterioramiento de
la columna. Pero adems de muchos factores instrumentales. N puede
expresarse como platos/m de columna, platos/columna, etc.
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Platos tericos:
CONCEPTOS GENERALES
NOMENCLATURA
Asimetra (As) o Factor de tailing (fT):
Mide el grado de alejamiento a la forma gaussiana
RECOLECCIN DE DATOS O
REVISIN BIBLIOGRAFICA
Seria lamentable invertir semanas de

trabajo para llegar a conclusiones que
podran obtenerse en minutos de consulta
en una base de datos o en internet
ALGUNAS FUENTES DE CONSULTA
Bases de datos:
ChromCircle MERCK
Paginas de internet de fabricantes de columnas:
Waters
Supelco
Agilent
Machery Nagel
Merck
Shimadzu
ALGUNAS FUENTES DE CONSULTA
Revistas Cientficas
LC GC North America
LC GC Europe
Journal of Foods and Drug Analysis
Journals of Chromatography A
Journals of Chromatography B
Journal of AOAC
Science direct
Springer
otros
QUE SE DEBE CONOCER

ANTES DE COMENZAR ?
Naturaleza de la muestra
Nmero de compuestos presentes (impurezas, pdtos de
degradacin, etc)
Concentracin del analito en la muestra

forma en la que esta presente el analito en la muestra
(bioanalisis)
Propiedades fsicas y qumicas del(os) analito(s): Estructuras
qumicas, PM de los compuestos de inters, los valores de pKa,
solubilidad, respuesta frente al detector utilizado (espectros
UV)
Naturaleza de la matriz (jarabe, crema, suspensin, orina,
plasma, etc)
QUE SE DEBE CONOCER

ANTES DE COMENZAR ?
Objetivos de la separacin
Mi objetivo principal es el anlisis cuantitativo, la deteccin
de una sustancia (desconocida), la caracterizacin de

compuestos desconocidos, o el aislamiento de material
purificado?
Es necesario resolver todos los componentes de la muestra?
Si es un anlisis cuantitativo, que niveles de exactitud y
precisin se requiere?
Para cuantas matrices diferentes debe ser diseado el

mtodo?
Cuantos compuestos se van a analizar a la vez?
Que equipo HPLC se requiere y que destreza se necesita?
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Requiere dilucin, adicin de un estndar interno u otra
manipulacin volumtrica
Solucin lista para inyeccin
Slidos que deben ser disueltos o extrados
Muestras que requieren pretratamiento para eliminar
interferencias y/o proteger la columna o el equipo de algn
posible dao
LOS OBJETIVOS DE LA PREPARACIN DE LA MUESTRA:
Minimizar la complejidad de la matriz que contiene los
analitos de inters, eliminando el mayor nmero posible de
sustancias que puedan interferir
Recuperar eficiente y reproduciblemente los componentes
que se desean analizar, permitiendo su concentracin o
disolucin en un solvente adecuado
Prevenir
los
posibles
daos
en
cada
uno
de
los
componentes del instrumento y especialmente de la columna.

Disminuir el tiempo de anlisis y de limpieza de la columna.
TIPOS DE MUESTRAS
Orgnicas (incluye biolgicas) e Inorgnicas
Slidas
Semislidas (cremas, geles, suspensiones, emulsiones,
coloides),
Lquidas,
Gaseosas (GC).
PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS LQUIDAS
Extraccin Lquido-Lquido (LLE)
Es una distribucin (particin) de un analito entre dos lquidos
inmiscibles y est representada por el equilibrio.
Co Caq
El mejoramiento de la recuperacin del analito y la
eliminacin de interferencias implican:
Cambio de pH
Apareamiento inico
Complejacin, etc.
Salting out, se utiliza para disminuir la concentracin del
analito en la fase acuosa por la adicin de una sal neutra
inerte (ej. Sulfato de sodio) a la fase acuosa.
Extraccin Lquido-Lquido (LLE)
Los solventes orgnicos utilizados en LLE deben cumplir
las siguientes caractersticas:
Baja solubilidad en agua (< 10%)
Volatilidad para fcil remocin y concentracin despus de
la extraccin
Compatibilidad con la tecnica de deteccin HPLC en caso de
que se utilice en el anlisis (evitar solventes que absorben en
el UV)
Polaridad y propiedades de enlace de hidrogeno que mejoran
la recuperacin de los analitos en la fase orgnica
Alta pureza para minimizar la contaminacin de la muestra
TEORIA
Ley de distribucin de Nernst
Co
KD =
Caq
KD= constante de distribucin

Co= concentracin del analito en la fase orgnica
Caq= concentracin del analito en la fase acuosa
Otra expresin usada es la fraccin de analito extrado (E) en

la fase orgnica:
CoVo
K DV
E=
=
CoVo + CaqVaq 1 + K DV
Vo= volumen de la fase orgnica

Vaq= volumen de la fase acuosa
V= proporcin Vo/Vaq
PRACTICA
El KD aumenta cuando la polaridad (P) del solvente de
extraccin coincide con la del analito.
Una optima polaridad del solvente de extraccin se logra
con la mezcla de dos solventes orgnicos con diferente
polaridad.
Extraccin de analitos inicos, se utilizan los cambios de
pH utilizando el pKa del analito, estos principios son los
mismos utilizados en HPLC.
PRACTICA
Si el KD del analito es desfavorable, pueden ser
requeridas extracciones adicionales para mejorar la
recuperacin.
en algunos casos, la LLE puede aumentar la
concentracin del analito en la fraccin relativa extrada
con pequeos volmenes?
Microextraccin
PROBLEMAS
Formacin de emulsiones
Analitos adsorbidos fuertemente a partculas
Analitos enlazados a compuestos de alto peso molecular
(ej. Frmacos a protenas)
Solubilidad en las dos fases
DESVENTAJAS
Operacin lenta y tediosa
Muy dependiente de la habilidad del operador
Presenta numerosos problemas (ver arriba)
PROBLEMAS
Formacin de emulsiones
Este problema ocurre con cierto tipo de muestras (ej. Matrices

grasas, vegetales), la emulsin se puede romper por:
Adicin de una sal a la fase acuosa

Calentamiento o enfriamiento del vaso de extraccin
Filtracin
Adicin de una pequea cantidad de un solvente orgnico
diferente
centrifugacin
PROBLEMAS
Analitos adsorbidos a partculas
Un lavado de las partculas despus de la filtracin con un

solvente fuerte (puede involucrar un cambio de pH, un
incremento de la fuerza inica, o el uso de un solvente
orgnico ms polar) puede recuperar el analito adsorbido
Solubilidad del analito en ambas fases
Es una buena practica saturar cada fase con la otra para que
el volumen de la fase que contiene el analito sea conocido,
permitiendo exactitud y una recuperacin optima.
PROBLEMAS
Analitos enlazados a protenas
Tcnicas para el rompimiento del enlace a protenas en fluidos
biolgicos DESPROTEINIZACIN incluyen:
Adicin de un detergente, solvente orgnico (AcN, MeOH,
Acetona), un agente chaotropico (cationes Hg2+, Cd2+, Fe3+, Cu2+, y
Zn2+ o mezclas de ellos con Ba2+) , o un cido fuerte entre el 10-20%
(tgstico, tricloroactico TCA, perclrico, metafosfrico, o mezclas
entre ellos, una sal neutra (salting in y salting out)
Diluir con agua
Desplazamiento con un compuestos que genere enlaces ms fuertes.
Extraccin en Fase Slida (SPE)
Es la tcnica ms usada en los anlisis por HPLC y comparada
con la LLE tiene las siguientes ventajas:
Mejor extraccin del analito
Mayor eficiencia en la separacin de impurezas
Reduce el consumo de solventes orgnicos
Fcil recoleccin de la fraccin del analito
Procedimientos ms convenientes
Remocin de partculas
Fcil automatizacin
Desventajas:
Variabilidad entre cartuchos
Adsorcin irreversible de algunos analitos en el cartucho
Las fuerzas intermoleculares de retencin como las de elucin

son del mismo tipo:
Fuerzas de atraccin inica:
Son de tipo electrosttico generadas entre ines de cargas
opuestas. Entre las fuerzas intermoleculares son las ms
fuertes.
Fuerzas de atraccin dipolar:
Se generan entre molculas con un momento dipolar neto.
Fuerzas del tipo puente de hidrgeno:
Se generan entre molculas que contienen tomos de
hidrgeno ligados a heterotomos de electronegatividad alta
como el O, N, F, etc.
Fuerzas dispersivas de tipo Van der Waals:
Estas fuerzas se generan entre molculas o partes de molculas
cuyo momento dipolar neto es cero.
Tamao molecular:
No es una fuerza; se incluye por tratarse de una de las
propiedades de los analitos que les permite migrar
diferencialmente a travs de una fase estacionaria porosa.
TEORIA
La SPE posee tres componentes:
1. La muestra problema que contiene los analitos en una
matriz compleja
2. La fase estacionaria o soporte slido (cartucho)
3. Los solventes de acondicionamiento, lavado y elucin.
SPE de Fase Reversa
Involucra una matriz de la muestra polar o moderadamente

polar (fase mvil) y una fase estacionaria no polar. La
retencin de analtos orgnicos en soluciones polares dentro de
este material SPE debido principalmente a las fuerzas
atractivas entre enlaces de hidrogeno-carbn entre el analito y
los grupos funcionales de la superficie de la slica. Estas fuerzas
atractivas apolar-apolar son comnmente llamadas fuerzas de
van der Waals o fuerzas de dispersin. Para eluir un compuesto
adsorbido en SPE de fase reversa use un solvente apolar para
romper las fuerzas que unen el compuesto con el material de
empaque.
SPE de Fase Normal
Analitos polares, matrices medianamente polares o no
polares (ej. Acetona, solventes clorinados, y hexano), y una
fase estacionaria polar. La retencin de un analito bajo
condiciones de fase normal es principalmente debido a la
interaccin entre grupos funcionales polares del analito y
grupos polares de la superficie adsorbentes. Estas incluyen
enlaces de hidrogeno, interacciones pi-pi, interacciones dipolodipolo, e interacciones dipolo-dipolo inducidas, entre otras. Un
compuesto adsorbido por estos mecanismos es eluido por el
paso de un solvente que rompe el mecanismo de unin
usualmente un compuesto que es ms polar que la matriz de la
muestra
SPE de Intercambio inico
Usado para compuestos que estn cargados en solucin
(usualmente acuosas). Compuestos anonicos (carga negativa)
pueden ser aislados con cartuchos de slica enlazada a LC-SAX o
LC-NH2.. Compuestos catinicos (carga positiva) son aislados
usando cartuchos de slica enlazada a LC-SCX o LC-WCX. El
principal mecanismo de retencin se basa en atracciones
electrostticas de los grupos funcionales cargados con los
grupos enlazados a la superficie de la slica
SPE de intercambio aninico
El material LC-SAX (strong anion exchanger) consta de grupos
alifticos cuaternarios enlazados a slica. Una amina
cuaternaria es una base fuerte y se encuentra como un catin
que atrae especies aninicas de la muestra. El pKa del amino
cuaternario es mayor 14, lo cual hace que se enlace a todos los
grupos funcionales cargados a todos los pHs en solucin acuosa.
El LC-NH2 tambin es usado como un intercambiador aninico
dbil WAX (weak anion exchanger). pKa es de 9.8
SPE de intercambio catinico
El material LC-SCX (strong cation exchanger) consta de grupos
alifticos de cido sulfonico. pKa < 1 y atrae especies
catinicas contenidas en una solucin.
El material SPE LC-WCX es un cido carboxlico aliftico. pKa
4.8
Interacciones Secundarias en SPE
Slica enlazada a fase reversa
Silanoles residuales
Rompimiento de los puentes de hidrgeno entre el analito y
los grupos hidrxilo en la superficie de la slica (ej. Con
metanol)
Slica enlazada a fase normal
Intercambio catinico por los silanoles ionizados
Slica enlazada a intercambio inico
Interacciones no polares con la porcin de los grupos
funcionales
El Rol del pH en SPE
Debido a que el cartucho de SPE se emplea slo una vez se

puede utilizar a pHs extremos para optimizar la retencin o
elucin del analito.
SPE de fase reversa
Si el inters es retener el analito conviene tener la solucin de
acondicionamiento y la muestra a un pH en el cual el analito no
est ionizado y viceversa. Cptos neutros no son afectados por el
pH.
SPE de fase normal
No se utiliza el pH
SPE de intercambio inico
Para retencin del analito se debe presentar que el grupo
funcional del analito y la superficie de la slica tengan cargas
opuestas
COMO USAR LA SPE
Existen tres vas para separar los compuestos de inters de las
impurezas.
DESARROLLO DE MTODOS DE SPE
DESARROLLO DE MTODOS DE SPE
HARDWARE Y ACCESORIOS PARA EL PROCESAMIENTO DE
MUESTRAS POR SPE
MUESTRAS POR SPE
MUESTRAS POR SPE
MUESTRAS POR SPE
MUESTRAS POR SPE
MUESTRAS POR SPE
MUESTRAS POR SPE
EJEMPLO DE SPE
AISLACIN DE TEOFILINA EN SUERO
Cartucho de extraccin
C18 100 mg
Ajuste de la matriz de la muestra
Ninguna
Acondicionamiento de la fase estacionaria
1 mL de MeOH seguido por dos porciones de 1 mL de agua desionizada
Aplicacin de la muestra
100 L de suero se mezclan con 100 L de KH2PO4 0.1M (pH=4.5) que
contenga 2 g de estndar interno (b-hidroxietilteofilina)
Lavado
2 porciones de 1 mL cada una de agua desionizada
Elucin
2 alicuotas de 100 L de MeOH
Separacin por Membrana
Usualmente las membranas son hechas de polmeros orgnicos
sintticos (ej. PTFE, nylon, PVC), celulosas, o fibra de vidrio.
La filtracin y la extraccin en fase slida por disco representan las
principales aplicaciones de preparacin de muestras por membrana.
Otros ejemplos son: ultrafiltracin, smosis inversa, dilisis,
microdialisis, electrodialisis, las cuales funcionan por difusin como
resultado de un gradiente qumico o electroqumico a travs de una
membrana semipermeable.
PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS SLIDAS
Una muestra debe estar lquida antes de ser inyectada en el
HPLC.
El contacto de la muestra con un solvente permite la
extraccin del analito, luego el solvente es separado del
slido por decantacin, filtracin, o centrifugacin.
Un mtodo simple es pulverizar el material y agitar la
muestra con un solvente en el cual el analito es soluble. Para
acelerar la extraccin se recomienda aumentar la
temperatura y sonicacin.
La lixiviacin tambin es utilizada.
Extraccin por soxhlet es el mtodo ms ampliamente
utilizado
Nuevos Mtodos de Extraccin
Extraccin por fluido supercrtico
Extraccin asistida por microondas
Extraccin acelerada con solventes
INTERCAMBIO DE COLUMNAS
En esta metodologa una porcin del cromatograma de la
columna inicial Columna 1 es transferida selectivamente a la
segunda columna (columna 2) y luego se realiza la separacin.
INTERCAMBIO DE COLUMNAS
Esta metodologa se utiliza para:
Remover contaminantes de la columna antes de ingresar a la
columna 2
Remover compuestos retrazados antes de ingresar a la
columna 2
Remover interferencias que pueden solaparse con el analito
en la columna 2
Una elucin alternativa de gradiente
Mejoramiento de la seal
DERIVATIZACIN
Se realiza por medio de una reaccin qumica entre el analito
y un reactivo para cambiar las propiedades qumicas y fsicas
del analto.
Principales usos en HPLC:
Mejorar la deteccin
Cambiar la estructura molecular o polaridad del analito para
mejorar la cromatografa
Cambiar la matriz para que se genere una mejor separacin
Estabilizar la sensibilidad del analito
La derivatizacin debe ser: rpida, cuantitativa, y producir
poco subproducto. El exceso de reactivo no debe interferir
con el anlisis.
DERIVATIZACIN
La derivatizacin es el ultimo recurso en el desarrollo de un mtodo
DETECTABILIDAD
Muchas clases de compuestos pueden ser derivatizados
DERIVATIZACIN
DETECTABILIDAD
Las derivatizaciones ms comunes son; adicin de un cromoforo y
adicin de un fluoroforo.
Las consideraciones generales a tener en cuenta en la eleccin de un
reactivo de derivatizacin son:
El agente derivatizante debe ser estable
El agente derivatizante y los subproductos formados durante la
derivatizacin no deben ser detectables o deben ser separados del
analito
El analito debe reaccionar con el reactivo derivatizante bajo las
condiciones establecidas
Si es posible el reactivo no debe ser toxico
el procedimiento debe ser adaptable a la automatizacin
DERIVATIZACIN
DETECTABILIDAD
Las derivatizaciones ms comunes son; adicin de un cromoforo y
adicin de un fluoroforo.
Las consideraciones generales a tener en cuenta en la eleccin de un
reactivo de derivatizacin son:
El agente derivatizante debe ser estable
El agente derivatizante y los subproductos formados durante la
derivatizacin no deben ser detectables o deben ser separados del
analito
El analito debe reaccionar con el reactivo derivatizante bajo las
condiciones establecidas
Si es posible el reactivo no debe ser toxico
el procedimiento debe ser adaptable a la automatizacin
DERIVATIZACIN
Derivatizacin Pre-columna
Su principal ventaja es que no existen limitacones en la cinetica de la
reaccin
Su principal desventaja es la posible aparicin de picos de
subproductos
Derivatizacin Post-columna
Su principal ventaja es minimizar la formacin de subproductos
(artefactos) y que no requiere una completa reaccin
Su principal desventaja es no poder aplicarse a reacciones lentas y
otra es la falta de compatibilidad de las fases mviles con los
reactivos.
Analisis Quiral por Derivatizacin
Utilizada para mejorar la separacin y no la detectibilidad
PREPARACIN DE LA MUESTRA vs INCERTIDUMBRE
La medicin de la incertidumbre depende de:

La concentracin del analito
Las propiedades de la matriz
La tecnica de preparacin de la muestra
El principio de medicin
PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA
SUGERENCIAS PARA MINIMIZAR EL ERROR EN EL
TRATAMIENTO DE LA MUESTRA
1. Use una tcnica adecuada
2. Usar grandes volmenes (ej. Es preferible pipetear 10 mL
en vez de 1 mL)
3. Minimice el nmero de pasos
4. Realizar la medicin de la muestra y el estandar en un
corto intervalo de tiempo, ademas usar el mismo equipo.
5. Use un extndar interno
6. Prepare un blanco (matriz sin analito)
7. Realizar anlisis mltiple
LC-GC Europe julio 2002 2-5
TENDENCIAS EN LA PREPARACIN DE MUESTRAS
TENDENCIAS EN LA PREPARACIN DE MUESTRAS
PRETRATAMIENTO
DE LA MUESTRA
TENDENCIAS EN LA
PREPARACIN DE
MUESTRAS
DETECCIN Y SELECTIVIDAD
INTRODUCCIN
En la mayora de los casos los detectores usados son UV y DAD.
Por lo tanto se busca otra alternativa cuando:
La muestra tiene baja absorbancia o no tiene
La concentracin del analito es demasiado baja para la
deteccin
La muestra presenta muchas interferencias
Cuando se requiere informacin estructural
El tipo de detector esta relacionado con el anlisis por medio
de la:
Selectividad
Sensibilidad
Ruido de la lnea base
DETECCIN UV
Generalidades
Ley de Beer`s: se basa en la relacin entre cantidad de luz
absorbida y la cantidad de sustancia absorbente
Io
A = log
I
I0: intensidad de la luz incidente

I: intensidad de la luz despus de pasar
a travs del espesor b de la solucin
A = CL fc
A: absorbancia
C: concentracin
: absorptividad molar
Lfc: longitud de la celda
DETECCIN UV
DETECCIN UV
DETECCIN UV
Eleccin de la longitud de onda
La informacin de los espectros UV es muy importante en el
desarrollo de mtodos.
Los espectros UV se pueden encontrar:
-En la literatura
-Estimarse a partir de la estructura qumica de los componentes de la muestra.
-Medirse directamente (si cuento con el compuesto puro) en un espectrofotmetro, u
obtenerse durante la separacin por medio de un detector UV con DAD.
-Cuando no se obtiene una buena respuesta con el detector UV otros detectores pueden
necesitados o utilizar derivatizacin.
DETECCIN UV
Absorbancia de la muestra en funcin de su estructura
molecular
La siguiente figura muestra los espectros de una solucin
diluida de dos compuestos.
Si ambos compuestos son de inters 210 nm mejor opcin
Si la muestra posee interferencias que complican la
separacin 240 250 nm
Si IMI es el analto y AMI la interferencia (y no es un anlisis de
trazas) 290 300 nm es preferida
Figura 3.5
DETECCIN UV
Absorbancia de la muestra en funcin de su estructura
molecular
A es proporcional a la absorptividad molar del compuesto de
inters. menores de 100 en anlisis de trazas posiblemente
no se pueden analizar por UV.
Hidrocarburos saturados y sus derivados amino o nitrilo no son
detectables por UV
DETECCIN UV
Absorbancia de la fase mvil en funcin de su compocisin
DETECCIN UV
Seal, Ruido
Seal (S) es la absorbancia corregida del pico del analto.
Ruido (N)ancho de la lnea base
DETECCIN UV
La seal puede aumentarse:
Incrementando la concentracin del analto
Incrementando el volumen de inyeccin
Incrementando la eficiencia de la columna
Disminuyendo el factor de capacidad del analito
Linealidad del detector
La ley de Beer se cumple para un amplio rango de medidas de
absorbancias, bsicamente para valores menores 1 UA, pero lo
ideal es que la respuesta sea no mayor a 0.5 UA, para trabajar
en un rango lineal, pero esto debe ser comprobado en la
validacin. OJO con la concentracin y el volumen de
inyeccin que mandan las Farmacopeas!!!
DETECCIN UV
Acercamiento Sistemtico para la Maximizacin de la
sensibilidad de la deteccin UV (S/N)
1. Seleccin de la longitud de onda en el mximo de (S)
2. Inyecte el mayor volumen de muestra posible (S).
3. Concentre la muestra para incrementar la masa inyectada
(S)
4. Reducir el K al mnimo posible (S)
5. Considerar detectores alternativos (no UV) (S)
6. Incrementar la constante de tiempo del detector (N)
7. Reemplace la lmpara por una nueva (S, N)
8. Usar un amortiguador de pulso para eliminar el ruido de la
bomba si es necesario (N)
DETECCIN UV
Detectores UV con Arreglo de Diodos
Permiten cromatografiar simultneamente
longitudes de onda durante el mismo corrido.
diferentes
Se obtiene el espectro UV de cada pico lo cual sirve para

seleccionar la longitud de onda optima para el corrido final.
La comparacin de los espectros permite evaluar la identidad
y la pureza del pico de interes.
DETECCIN UV
Detectores UV con Arreglo de Diodos
Ejemplo
SELECCIN DEL SISTEMA PRELIMINAR
INSTRUMENTACIN
INTERFASE
DETECTOR
BOMBA
AUTOINYECTOR
INSTRUMENTACIN
INSTRUMENTACIN
PUNTO DE PARTIDA
HPLC-RP o CROMATOGRAFIA LQUIDA DE FASE REVERSA
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DE LA COLUMNA
LA COLUMNA ES EL CORAZN DEL PROCESO DE SEPARACN
Para realizar esta seleccin
informacin acerca de:
es
importante
recolectar
- Caracteristicas qumicas de la fase estacionaria

- Caracteristicas fisicas de la prticula
Cromatografistas deben conocer las caracteristicas qumicas
de la muestra, esto representa una inversin de tiempo
inicial, pero asi es ms probable obtener una columna optima
para el desarrollo del mtodo.
PUNTO DE PARTIDA
Visin global de la seleccin de la columna
1. Conocer la estructura molecular de los componentes de la
muestra, para as seleccionar las caracteristicas qumicas de
la fase estacionaria, tipo de enlace, endcapping y la carga
de carbono.
2. Analisis del objetivo de la separacin para elegir la columna
y las caracteristicas fisicas de la particula, dimensiones de
la columna, la forma de la prticula, tamao de particula,
area superficial, y tamao de poro.
PUNTO DE PARTIDA
Visin global de la seleccin de la columna
Columnas modernas no basadas en silica (zirconio, carbon
grafitizado, o polimericas) se pueden trabajar a pH de 1.0
10.0
pHs entre 2.0 7.5 son los recomendados para columnas
enlazadasa silica, debido a que la expocisin a pHs extremos
cidos produce la hidrlisis de la fase enlazada y a pHs basicos
extremos se presenta degradacin de la silica.
EL PRECIO NO ES LO MS IMPORTANTE A LA HORA DE ELEGIR
UNA COLUMNA, ES MEJOR CERSIORARNOS SI REALMENTE NOS
VA A SERVIR PARA EL TRABAJO PROPUESTO
PUNTO DE PARTIDA
Planificacin
Cuantos componentes estan presentes en la muestra?
Cual es la matriz de la muestra?
Cuales son las estructuras de los componentes de la muestra?
Cuales son los valores de pKa de los componentes de la muestra?
Se tiene disponible la informacin espectral UV?
Cual es el rango de concentracin de los componentes en la muestra?
Cuales son los pesos moleculares?
Cual es la solubilidad de la muestra y los componentes?
Se necesita una completa resolucin de todos los componentes de la
muestra?
Es necesario un analisis rapido?
Es importante el uso de poco solvente?
Es importante la estabilidad y la vida util de la columna?
Es importante la maxima sensibilidad del detector?
PUNTO DE PARTIDA
Eleccin de la Fase Enlazada
Fase 1
Dibujar la estructura molecular de
todos los componentes de la
muestra.
Identificar
las
dos
estructuras ms similares.
Fase 2
Determinar
las
diferencias
estructurales para predecir que fase
estacionaria puede separar las dos
moleculas. La retencin del analito se produce
por la interaccin entre los grupos funcionales en

cuestin con la fase estacionaria y la fase mvil.
La separacin se presenta por un proceso de
migracin diferencial.
PUNTO DE PARTIDA
Fase 3
El uso de los resultados que arroja la comparacin de las estructuras
brinda la informacin necesaria para elegir la fase enlazada (o no
enlazada).
En este ejemplo un analista puede considerar la utilizacin de
columnas de silica (fase no enlazada) fase normal por la capacidad
de retener y diferenciar la prednisolona y la prednisona a traves de la
interaccin con los puentes de hidrogeno.
Una revisin de las fases enlazadas alternativas es indispensable
para la comprensin de las interacciones entre el soluto y la fase
estacionaria.
PUNTO DE PARTIDA
Fase 3
PUNTO DE PARTIDA
Fase 3
C18, C8, C4: Fases no polares, retencin basadas en interacciones van
der Waals con los radicales hidrofobicos de las moleculas.
PUNTO DE PARTIDA
Fase 3
Fenilo: no polares, la retencin es una mezcla de mecanismos de
interacciones hidrofobicas y - . Su retencin es similar a la fase C8.
PUNTO DE PARTIDA
Fase 3
Ciano: poseen polaridad intermedia, la retencin es una mezcla de
mecanismos de interacciones hidrofobicas, dipolo dipolo y - . Estas
fases son usadas en el analisis de compuestos organicos polares. Se
puede usar como fase normal o fase reversa.
PUNTO DE PARTIDA
Fase 3
Amino: es una fase polar que puede ser usada como fase normal o de
intercambio, la retencin es debido a interacciones dipolo dipolo o
cido base. Comunmente es usada para el analisis de carbohidratos,
pero tambien a sido usada en el analisis de iones inorganicos y
organicos.
PUNTO DE PARTIDA
Fase 3
Silica: es una fase muy polar y es usada como cromatografia de fase
normal. Su retencin es un resultado de sus interacciones de puentes
de hidrogeno con los solutos.
PUNTO DE PARTIDA
Eleccin de las Caracteristicas Fsicas de la particula
La siguiente tabla (tabla 1)es usada para elegir el formato de la
columna y las caracteristicas fsicas de la partcula. La carta
presenta una columna predeterminada para el punto de
partida.
Perfil de una columna analitica buena para muchas aplicacines:
150 mm x 4.6 mm, 5 m dp, 200 m2/g area superficial, 10% de
carga de carbono, enlace monomerico, y particulas esfericas.
Esto puede cambiar deacuerdo a los objetivos del metodo:
-Rapida equilibracin columnas cortas 30 50 mm
-Alta resolucin menor tamao de particula, diametro
menor, etc.
PUNTO DE PARTIDA
Dimensiones de la columna
Longitud y diametro interno del material de relleno, rango de
longitud 30 300 mm y rango de diametro 2.1 22 mm.
Forma de la partcula
Esfericas (reduce la presin, alarga la vida de la columna) o
irregulares (alta area superficial y alta carga de carbono, mejor
resolucin)
Tamao de partcula dp
El rango es de 1.5 20 m, pequeas partculas ofrecen alta
eficiencia
PUNTO DE PARTIDA
Area superficial
Es la suma de la superficie exterior partcular y la superficie de
poro interna, en m2/g. Altas areas superficiales proveen mayor
retencin, capacidad, y resolucin para separacones
complejas.
Tamao de poro
Tamao promedio de las cavidades presentes entre partculas,
rango entre 60 10000 . Su eleccin depende del MW del
sluto.
PUNTO DE PARTIDA
Tipo de enlaces
Es el tipo de enlace entre la fase enlazada (radical) y la base
de silica
Monomerico: un solo punto de enlace. provee rapida equilibracin y alta

eficiencia.
Polimerico: multiple puntos de enlace. Provee mayor estabilidad de la
columna, aceptan altas cargas de muestra
PUNTO DE PARTIDA
Carga de carbono
Es la cantidad de fase enlazada al material de base, expresado
como porcentaje de carbono.
Altas cargas de carbono mayor resolucin y largos tiempo de
corrido en muestras hidrofobicas
Bajas cargas de carbono bajos tiempos de corrido y a
menudo presenta diferente selectividad
endcapping
Es una cubierta de cadenas cortas de hidrocarburos despues del
enlace primario para inactivar los silanoles. Reduce el pico de
los tailing de las bases con grupos nitrogenados.
PUNTO DE PARTIDA
Un Ejemplo Real
En este ejemplo, el objetivo es obtener un analisis rapido con
alta resolucin.
Muestra: mezcla de flavonoides naturales
PUNTO DE PARTIDA
Un Ejemplo Real
Basandonos en el analisis de los grupos funcionales elejimos la
pareja de flavonoides estructuralmente ms parecidas.
Estas estructuras sugieren que fases
enlazadas tales como fenil o ciano son
la mejor opcin, debido a que ofrecen
una mezcla de mecanismos de
retencin (hidrofobico y - ). La nuve
del grupo funcional de la fase enlazada

interactua de diferente grado entre
naringenina y apigenina.
PUNTO DE PARTIDA
Un Ejemplo Real
Analisis rapido columnas cortas, baja area superficial, y baja
carga de carbono.
Alta resolucin columna larga, pequeo tamao de partcula,
y alta carga de carbono.
Unificando criterios. Columna 53 mm x 7 mm, 3 m dp, 350
m2/g, 16% de carga de carbono.
Se realizaron tres ensayos ver figura
PUNTO DE PARTIDA
La superficie de la silica puede contener muchas clases de
grupos silanoles, los cuales pueden causar fuertes enlaces con
solutos bsicos debido a sus caractersticas cidas.
La pureza de la silica de soporte es de mucho interes en la
separacin de muchos compuestos polares. Algunas silicas estan
contaminadas por diferentes metales M+ (Fe, Al, Ni, Zn, etc.).
Estos metales se pueden complejar con solutos quelantes,
provocando
picos
asimtricos,
tailing
o
reteniendo
irreversiblemente algunos compuestos
OH
Si
Silanol libre
HO OH
Si
OH OH
Silanoles geminales
Silanoles asociados
Si
Si
M+
------Metal superficie
OH
M Si
Metal interno
(activa silanol)
PUNTO DE PARTIDA
silica tipo A: menos pura y ms cida,
puede ser usada para el anlisis de
compuestos neutros y no ionizables
Silica tipo B: pura y menos cida,

especial para el anlisis de compuestos
ionicos y principalmente bases aminas.
PUNTO DE PARTIDA
Especificaciones:
Nmero de platos tericos
Factor de asimetra del pico (As)
Selectividad () entre dos solutos diferentes
Presin de la columna
Reproducibilidad de la retencin (k)
Concentracin de la fase enlazada (si es aplicable)
estabilidad de la columna
Los fabricantes suministran en el certificado de la columna las
primeras cuatro especificaciones. Las ultimas a veces no se
consiguen pero pueden encontrarse en artculos cientficos.
PUNTO DE PARTIDA
Especificaciones:
expresar la idea de inicializacin de columnas segn formatos
LIMPIEZA Y REGENERACIN
DE COLUMNAS HPLC DE FASE
REVERSA
LC/GC 21, 1, 19-26 (2003)
RP-HPLC Tcnica ms usada en LC. Su

popularidad se debe a que es aplicable a muchos
analitos no polares, ionizables y polares neutros.
Como la F.E. de RP-HPLC es de naturaleza
hidrofbica la separacin ocurre por este tipo de
interaccin.
Ojo con los componentes hidrfobos de las

matrices !
Existen muchos tipos de F.E. en R.P.HPLC, pero las ms populares son las
basadas en silica Tabla I.
Otros materiales utilizados diferentes a la
silica son:
Polmeros, silica y alumina con recubierta

polimrica, hbridos orgnico-inorgnico,
zirconio, carbono grafitizado
Las columnas RP-HPLC utilizan amplia variedad de F.M. Y aditivos,

estos ltimos pueden modificar y contaminar la superficie del material
de empaque.
Silanoles residuales Figura 1, pueden
interactuar con sustancias de carcter
bsico de la matriz.
[ ] de iones metlicos (silica tipo A >
100 ppm) dan mayor acidez a la
superficie y tambin actan como
quelantes o scavenging
FJOR
Los usuarios deben ser conocedores

de las caractersticas de la superficie
de su fase estacionaria y de posibles
interacciones analito-superficie.
Despus que una columna esta
contaminada
su
desempeo
cromatogrfico cambia
Que Causa el Aumento de Contaminantes en Columnas RP

Matrices con:
sales eluyen con el V0 pico, manchas o problema de lnea base
Cptos hidrofbicos son absorbidos o adsorbidos acumulacin en
la cabeza de la columna
Cptos de retencin intermedia eluyen lentamente picos anchos,
picos fantasmas, problemas de lnea base o deriva
Lavado de Columnas Enlazadas a Silica

La clave es conocer la naturaleza de los
contaminantes y encontrar un solvente
apropiado que los remueva
Se deben tener en cuenta los volmenes
de columna
Ej: los lpidos se pueden remover con 20
volmenes de columna de solvente orgnico
No pasar inmediatamente solvente orgnico si se esta usando FM

buffereada. En cambio pasar la FM reemplazando el buffer por agua,
despus de 10 volmenes de columna se puede pasar el solvente fuerte

A veces, los solventes fuertes no son suficiente para
remover los contaminantes. Visite sitios web de fabricantes
de columnas para ver recomendaciones.
Importante: Cada solvente en la serie debe ser miscible

con el siguiente y va desde el ms polar al menos polar o
ms apolar
Un sistema de lavado recomendado es:
1100% MeOH
1100% AcN
775% AcN 25% IPA
1100% IPA
1100% CH3Cl
1100% Hexano
FJOR
Pasar 10 volmenes de
columna de c/ solvente
IPA buen solvente intermedio,
pero muy viscoso

Si se sospecha de fallas severas, se puede mezclar dimetil
sulfoxido (DMSO) o dimetil formamida con agua 50:50 a un flujo
de 0.5 mL/min.
Se puede invertir la columna?

Recomendaciones:
PProgramar el lavado de las columnas en la noche
DDesconectar la columna del detector durante el lavado
Lavado de Columnas Enlazadas a Silica Contaminadas de Residuos

Proteicos
Inicialmente se debe pasar por la columna fase mvil con un
porcentaje mayor de solvente fuerte.
Gradientes de cido trifluoroacetico acuoso y cido trifluoroacetico
propanol
Despus de limpiar la columna con guanidina o

urea, usar un mnimo de 40 50 volmenes de
columna de agua grado HPLC.
Lavado de Columnas Enlazadas a Silica Contaminadas de Residuos

Proteicos
Enjuague con 20 volmenes de la columna de fase mvil
con buffer.
Gradiente:
A) 0.1% aqueous TFA in water
B) 0.1% TFA in Acetonitrile/Isopropanol (1:2)
25% B 100% B for 30 minutes
No usar detergentes
Tambin se debe consultar las recomendaciones de los
fabricantes
Tecnicas Especiales para el Lavado de Columnas RP Enlazadas a Silica

Si iones metlicos son adsorbidos por la silica utilizar EDTA
y luego pasar agua 20, pasar 50 volmenes de columna y
luego 50 volmenes.
En caso de matrices bsicas, se remueven ajustando el pH
a menos de 3 y matrices cidas con pH por encima del pKa
8 o 9.
En caso de crecimiento bacteriano; utilizar blanqueador
casero diluido 1:10 o 1:de columna de agua HPLC.
Par inico, 20 volmenes de columna con la misma fase
mvil cambiando el par inico por agua
PUNTO DE PARTIDA
Retencin de Compuestos Polares:
Cuando los tiempos de retencin se encuentran muy cercanos a
t0, k < 2, el proceso cromatogrfico se realiza en su mnima
expresin. Para esto existen tcnicas para incrementar la
retencin de los compuestos polares.
Ajustar el pH
Suprimir la ionizacin de compuestos cidos con bajos pHs,
una buena alternativa es buffer fosfato de 10 20 mM a pH de
2.5.
Compuestos bsicos requieren de pHs por encima de 8.0 para
suprimir la ionizacin. Para esto se requiere de columnas
especiales desarrolladas por diferentes firmas.
PUNTO DE PARTIDA
Columnas con mayor poder de retencin
Preferir columnas C18 en cambio de C8
Elegir columnas con alta carga de carbono especialmente en
empaques basados en silica polimrica
Usar poca agua
Si el compuesto eluye a t0 con un 5% de fase orgnica, puede
ser posible mejorar la retencin disminuyendo el % de fase
orgnica, pero, esto puede colapsar la fase enlazada
cambiando as la retencin de la columna. Por lo tanto esto se
debe hacer muy cuidadosamente.
Existen columnas diseadas para este propsito (embedded
polar phase), las cuales toleran hasta el 100 % de agua.
PUNTO DE PARTIDA
Apareamiento inico
Si el problema contina utilice
reactivos de par ionico en la fase mvil
Cromatografa de fase normal
Es una herramienta que no podemos
olvidar, pero debemos tener en cuenta
que es muy fuerte la retencin de los
compuestos polares en este tipo de
cromatografa
PUNTO DE PARTIDA
Caracterizacin de la
Selectividad:
La
selectividad
vara
diferentes
columnas
y
diferentes lotes de la
columna.
entre
entre
misma
Columna A
Columna B
Columna C
PUNTO DE PARTIDA
Problemas y Remedios:
Retencin y Resolucin Irreproducible
Si la retencin de los analitos no se repite corrido ha corrido, es

imposible obtener conclusiones exactas las cuales ayuden a realizar
cambios para mejorar la separacin. Valores de K y no deben
cambiar ms de 2 a 3 %
TABLA 5.11
PUNTO DE PARTIDA
Retencin y Resolucin Irreproducible
Solucin de problemas de irreproducibilidad ocasionados
por la columna en un desarrollo de mtodos.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Seleccionar una buena columna de soporte purificado y menos cidos y

mantener la misma fase estacionaria, tamao de partcula y dimensiones
de la columna a traves del desarrollo
Elimine efectos qumicos o silanoles usando condiciones favorables
de fase mvil (pH, tipo y concentracin de buffer, aditivos, etc.)
Asegurece que la columna esta totalmente equilibrada con la fase mvil.
Use tcnicas apropiadas que aseguren operaciones reproducibles da
da.
Use grficos de retencin para proveer una accin correctiva cuando es
requerida
Califique las columnas.
PUNTO DE PARTIDA
Tailing
Una columna defectuosa de fbrica (mal empacada) es una
fuente de asimetra. Esto se puede evidenciar en la calificacin
con un compuesto neutro, en caso que este compuesto
presente tailing es mejor solicitar al proveedor un cambio de
columna.
Luego de un uso inadecuado o
prolongado de la columna
puede presentarsen picos pocos
simtricos por taponamiento
de la frita, vacios internos de
la columna o columnas mal
lavadas.
PUNTO DE PARTIDA
Porque se Daan las Columnas?
Empaquetamiento o frita parcialmente bloqueado
Impurezas de la muestra parcialmente adsorbidas
Columnas mal ampaquetadas
Cambios bruscos mecnicos o trmicos crean espacios vacios
Cambios bruscos qumicos (solventes, buffers)
Ataque qumico al soporte o a la fase estaconaria
SINTOMAS:
Incremento de la presin de la columna

Tailing
Poca reproducibilidad corrido corrido
Prdida de platos teoricos
Disminucin de selectividad
Disminucin de la retencin (k)
PUNTO DE PARTIDA
Fig 5.13
PUNTO DE PARTIDA
Problemas con la frita de la columna
Principalmente se debe al taponamiento de la frita, si se sospecha
este problema, lo puedes confirmar corriendo un estndar con unas
condiciones de operacin conocidas.
Solucin: cambie la frita, al cambiarla chequee si hay espacios
vacios, si los hay rellenarlos.
Si no podemos cambiar la frita, la columna puede ser invertida y
lavada con un solvente fuerte para liberar el material que gener la
obstruccin.
Ojo desconectarla del detector!
PUNTO DE PARTIDA
Componentes de la muestra fuertemente unidos
Los compuestos no eluidos son un problema especialmente de
muestras complejas tales como extractos de tejidos o fluidos
biologicos, formulaciones con compuestos grasos, etc. Seales de
este problema son picos anchos y con tailing.
Este problema puede ser prevenido usando precolumnas
Hacer un buen lavado de la columna
PUNTO DE PARTIDA
Columnas mal empaquetadas
La compactacin de la columna a menudo puede ser poca, lo cual en
muy poco tiempo genera epacios vacios en la columna. Dificil de
detectar.
Efectos de la presin
Ojo con los cambios bruscos de presin y de temperatura
PUNTO DE PARTIDA
Ataque qumico
Eliminar fases moviles que producen la perdida de la fase enlazada
(seguir las recomendaciones del fabricante). Temperatura y pHs .
Otros factores
Contaminacin microbiana
PUNTO DE PARTIDA
Problemas con la frita de la columna
Principalmente se debe al taponamiento de la frita, si se sospecha
este problema, lo puedes confirmar corriendo un estandar con unas
condiciones de operacin conocidas.
Solucin: cambie la frita, al cambiarla chequee si hay espacios
vacios, si los hay rellenarlos.
Si no podemos cambiar la frita, la columna puede ser invertida y
lavada con un solvente fuerte para liberar el material que genero la
obstruccin. Ojo desconectarla del detector!
PUNTO DE PARTIDA
Como proteger la Columna y Prolongar su Vida
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Use columnas bien enpacadas

Evite cambios bruscos mecanicos y termicos
Use guardacolumna y/o filtro en linea
Lave la columna frecuantemente con solvente fuerte
Realice un buen pretratamiento de la muestra para evitar
particulas y componentes fuertemente retenidos
Use fases estacionarias estables
Use buffers organicos a pHs de (6-8) ej: citrato
Trabaje la columna a temperaturas < 40C
Trabaje dentro del rango de pH recomendado por el fabricante
Cambie el agua y los buffers diariamente o adicione 200 ppm de
azida
Almacene las columnas en solvente organico 100 %
Realice un seguimiento de las columnas (hoja de vida)
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DEL FLUJO
Para una columna de 125 o 250 mm x 4.6 mm, 5 m, C8 o C18,
flujos de 0.5 a 2.0 mL/min (preferiblemente 1.0) son
recomendados debido a:
Tiempos de corrido < 15 min para k < 20
Genera presiones < 2500 psi para cualquier fase mvil
compuestas por mezclas de agua, AcN y/o MeOH.
A estos flujos se presenta buen nmero de platos teoricos
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DE LA TEMPERATURA
En el punto de partida la temperatura ideal de trabajo esta
entre 30 40 C.
Algunos laboratorios poseen variaciones de 5C o ms, lo cual
genera problemas en la separacin.
Como regla general: la retencin varia de 1-3% por cada C
PUNTO DE PARTIDA
Temperatura vs Tiempo de Retencin
PUNTO DE PARTIDA
Temperatura vs Selectividad
PUNTO DE PARTIDA
Temperatura vs Forma del Pico
PUNTO DE PARTIDA
Temperatura vs Efectos Combinados
Precalentamiento de la FM a 56C
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DE LA FASE MVIL
FM EL VERDADERO M OTOR DE
LA SEP ARACI N
FASE MVIL
MEZCLAS AGUA:MODIFICADOR ORGNICO (MeOH, AcN O THF) +
ADITIVOS SI ES NECESARIO.
SELECCIN DEL SOLVENTE ORGNICO
Muchos CROMATOGRAFISTAS descuidan la eleccin del solvente
orgnico en el desarrollo del mtodo.
Para obtener un buen resultado, debemos considerar las
caractersticas qumicas y fsicas, adems la pureza del
solvente. Por todo esto se debe tener en cuenta las
propiedades de estos solventes.
PUNTO DE PARTIDA
PODER SOLUBILIZANTE DE LA MUESTRA
La muestra a inyectar debe ser completamente disuelta, se
recomienda que el solvente diluyente sea la misma FM. Evitar
la precipitacin de las muestras al entrar en contacto con la FM
REACTIVIDAD
Evitar toda reactividad entre la muestra y la fase mvil
UV CUTOFF Y COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR
Define la longitud de onda en la cual la absorbancia del
solvente en una celda de 1 cm es igual a 1 UA, usando agua en
la celda de referencia. ELEGIR SOLVENTES TRANSPARENTES AL
UV.
PUNTO DE PARTIDA
UV CUTOFF Y COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR
Figura 3 articulo seleccin de solventes parte 1
PUNTO DE PARTIDA
PUNTO DE EBULLICIN
No bajo punto de ebullicin por problemas de volatilidad y
burbujas en la bomba. Si puntos de ebullicin intermedio.
punto ebullicin : viscosidad.
VISCOSIDAD
Relacionada con la presin del sistema y con la separacin del
sistema. Se desean solventes de baja viscosidad.
SEGURIDAD
Se debe evitar el empleo de solventes que, por sus
caractersticas (inflamabilidad y toxicidad), representan un
riesgo para el cromatografistas.
PUNTO DE PARTIDA
PUREZA
Trabajar con solventes grado HPLC
PROPIEDADES QUMICAS
Indice de polaridad: fuerza de interaccin de solventes frente a

solutos polares
Fuerzas dispersivas: indican la polarizabilidad de una molcula y
aumentan con el nmero de electrones de la misma y con la distancia
de estos al ncleo.
Capacidad aceptora y donadora de protones: medida de capacidad
de las mleculas para intercambiar protones
Momento dipolar: se refiere a la capacidad de una molcula para
formar dipolos permanentes y est estrechamente relacionado con la
constante dielctrica del solvente
PUNTO DE PARTIDA
En RP-HPLC poseemos tres opciones: THF, AcN y MeOH, cada
solvente tiene una selectividad diferente
SOLVENTE
UV CUTOFF
VISCOSIDAD
(Cp)
PUNTO DE
EBULLICIN (C)
POLARIDAD
(P)
VALOR
ELEUTROPICO
AcN
MeOH
THF
190
205
212
0.38
0.55
0.55
81.60
64.70
66.00
5.8
5.1
4.0
3.1
1.0
3.7
Debido a su baja viscosidad, poca absorbancia al UV, poca

reactividad es conveniente comenzar con AcN, pero tambien es
vlido comenzar con MeOH.
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DE LA FASE ACUOSA
AGUA:
Solvente ms utilizado en HPLC, el agua destilada no es
suficiente debido a la presencia de sustancias orgnicas
disueltas (aftalotos, cloraminas, etc) pudiendo modificar la
selectividad de la columna.
Ojo con el crecimiento bacteriano. Cambiar diariamente el
agua.
Compuestos neutros H2O
Compuestos ionicos requiere control del pH para obtener
mtodos reproducibles, por lo tanto se requiere que los
compuestos esten totalmente protonados o totalmente
ionizados. Esto se consigue si el pH de la fase mvil esta por
lo menos 1.5 unidades por encima o por debajo del pKa
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DEL BUFFER
Un buffer es una solucin que resiste cambios de pH cuando hay
pequeos incrementos de acido o base.
Compuestos inicos requieren control de pH para:
-Lograr un grado determinado de ionizacin del compuesto y la
columna
-Mejorar la forma del pico
-Controlar la selectividad
-Lograr reproducibilidad de la separacin
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DEL BUFFER
Se debe conocer el pKa de la muestra y del buffer. Ademas la
estabilidad de la muestra y la columna con respecto al pH.
El pH de la fase mvil debe controlarse por la adicin de buffer.
La medicin del pH en una FM que contenga solvente orgnico
es imprecisa.
Consideraciones a tener en cuenta:
Capacidad bufferante
Es determinada por; el pH, el pKa y la concentracin del
buffer.
Solo a un rango de pH de pKa 1.0 el buffer es efectivo
La concentracin de 10 a 50 mM es adecuada
ELECCIN DEL BUFFER
Buffer
Fosfato
Citrato
Formato
Acetato
Carbonato
Pka
2.1
7.2
12.3
3.1
4.7
5.4
Rango Bufferante
1.1 3.1
6.2 8.2
11.3 13.3
2.1 4.1
3.7 5.7
4.4 6.4
3.8
4.8
6.4
2.8 4.8
3.8 5.8
5.4 7.4
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DEL BUFFER
Por qu el pH de la fase mvil cambia al adicionar metanol?
cul pH es el correcto?
qu pH necesito usar?
Medicin del pH acuoso
pH=-log[H+]
Sorensen 1909
pH=-log aH
nueva definicin (actividad de hidrogeno)
PUNTO DE PARTIDA
SELECCIN DEL BUFFER
Opciones para preparar un buffer
Programa buffer calculator
http://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/Makebuf.asp
Aproximacin empirica
Por medio de la ecuacin de disociacin
Solubilidad de los buffer en los solventes organicos (MeOH,
AcN, THF)
todos los buffers son ms solubles en MeOH y menos solubles
en THF
la solubilidad de los cationes en agua se comporta NH4 > K >
Na
PUNTO DE PARTIDA
ADITIVOS
Sales de alkil amonio, sulfonatos
Ej: tetrabutilamonio, hexano sulfonato de sodio
alkilaminas
Ej: trietilamina, dietilamina
miscelaneos
Ej: compuestos para cambar la selectividad, para complejar
(edta), etc
PUNTO DE PARTIDA
HPLC-RP o CROMATOGRAFIA LQUIDA DE FASE REVERSA
OPTIMIZACIN DEL MTODO

AJUSTE DE LOS PARMETROS CROMATOGRFICOS
Son herramientas cuantitativas que miden la calidad de la separacin
Tiempo de retencin tR
Factor de capacidad k
Asimetra o Factor de tailing As o fT
Platos tericos N
Selectividad

LA RETENCIN
tR : Medida del tiempo transcurrido entre la inyeccin y la
parte ms alta del pico
Ayuda a caracterizar los compuestos.
EL FACTOR DE RETENCIN O DE CAPACIDAD
k: Este parmetro es ms usado que el tR
Si k es pequeo; la retencin es muy poca y el pico tiende a
tener problemas con interferencias en el frente del solvente.
Si k es grande; el pico es ancho y difcil de detectar.

FACTOR DE RETENCIN O DE CAPACIDAD
El tR es afectado por los cambios de flujo y de tamao de la
columna, mientras que k permanece constante. Pero el tR y k
varian con cambios en la fase mvil o de la temperatura.
H2O - k
MeOH o AcN - k
en el pH - k
T - k
Rangos Apropiados de k
1 pico 2<k<6
2 a 3 picos 2<k<10
> Picos 0.5<k<20

ASIMETRIA O TAILING (COLA) DEL PICO
Forma Gaussiana ideal, pero en la prctica la gran mayora
de los picos se presentan con tailing
Relacin entre la Asimetra y el
factor de tailing del pico
Factor de tailing
10 %
Factor de
asimetra
5%
1.0
1.3
1.6
1.9
2.2
2.5
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
El tailing se minimiza con columnas de slica tipo B, con fases

mviles con bajo pH y con aditivos tales como la TEA 30 mM

Picos con poca asimetra generan:
nmero de platos tericos y resolucin con poca exactitud
imprecisin en la cuantificacin
poca reproducibilidad en la retencin
pequeos picos solapados en la cola del pico anterior



PLATOS TERICOS
La eficiencia aumenta al aumentar el valor de N

PLATOS TEORICOS
Una columna nueva que contenga partculas de 5 m generan
80,000 platos tericos/m usando las condiciones de prueba del
fabricante, aunque esto depende tambin de otros parmetros.
sin embargo es ms conveniente probar la columna durante
cada anlisis con el analito de inters usando el SST.
Para este propsito, N puede ser estimado de la siguiente
manera.
Donde L es la longitud de la columna en cm y dp es el dimetro

de partcula en micrmetros.

PLATOS TERICOS
As, una columna de 150 mm con partculas de 5 m debe tener
un N de 9000 bajo condiciones prcticas
Como puede aumentar N:
disminuyendo el flujo
empleando columnas largas
usando partculas pequeas
acoplando columnas
aaumentando la temperatura
empleando columnas nuevas
optimizando el equipo
Mminimizando los efectos extracolumna

PLATOS TERICOS
Efectos Extracolumna
Detector
Tamao de la celda, constante de tiempo () a menor mayor velocidad de
respuesta pero aumenta el ruido.
Tuberias
Acotarlas y disminuir el dimetro
Volumen de inyeccin
Disolver las muestras en fase mvil o en un solvente de menor fuerza

RESOLUCIN
Mide la calidad de la separacin entre dos picos
Aunque estas ecuaciones son una buena herramienta la

ecuacin ms completa para medir la resolucin es:

REGULACIN DE LA SELECTIVIDAD
si no existe separacin es igual a 1 y su valor aumenta con el
aumento de la separacin.
Habitualmente las modificaciones de se consiguen cambiando

las propiedades qumicas de los solventes de elucin.
AJUSTE DE LA FUERZA DEL SOLVENTE
Comenzar con 90% a 100% de solvente orgnico e ir
reducindolo en concentraciones del 10% hasta que los tiempos
de retencin se encuentren entre un k de 1 a 20.

AJUSTE DE LA FUERZA DEL SOLVENTE

TIPO DEL SOLVENTE
Pasos:
Ajuste la concentracin de solvente orgnico hasta que los picos se encuentren en la

regin de 1<k<20
Cambiar el tipo de solvente para cambiar la selectividad
Mezclar solventes, si es necesario

pH DE LA FASE MVIL
Como se dijo anteriormente el pH afecta solo a los compuestos
inicos.
Se recomienda trabajar a pH 2.5 inicialmente, teniendo en
cuenta trabajar a pH 1.5 unidades por encima o por debajo
del pKa del compuesto de inters.
Para ajustar el pH se recomienda hacer pequeos cambios de
(0.5 unidades)
Se sugiere fases mviles de pH bajo (2.0-3.0) para as suprimir
la ionizacin de los compuestos cidos y de los grupos silanoles
residuales implicados en el tailing de bases nitrogenadas.

pH DE LA FASE MVIL

pH DE LA FASE MVIL

pH DE LA FASE MVIL

ELECCIN DEL BUFFER
Absorbancia en el UV
Solubilidad, Estabilidad, interaccin con la muestra o columna,
volatilidad, corrosin.

TEMPERATURA DE LA COLUMNA
Como regla general en LC-RP se esperan cambios en la
selectividad del 1-3% por cada C de temperatura que se cambie.
El control de la temperatura es importante para tener tiempos de
retencin reproducibles.
SELECTIVIDAD DE LA COLUMNA
AMINAS

TEMPERATURA DE LA COLUMNA
CROMATOGRAFIA DE PAR IONICO

Antes de explorar la cromatografa de par inico IPC debe
explorarse la cromatografa de fase reversa
BASES DE LA RETENCIN
El reactivo de par inico es atrado por la fase estacionaria
debido a los grupos hidrofbicos.
Utilizado para sustancias altamente hidroflicas, cidos o bases
ionizados

pH y Apareamiento Inico
Figura 7.9 b y c

Concentracin de Reactivo de Par Ionico

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DESARROLLO DE

MTODOS POR HPLC

Por lo tanto no es extrao encontrarnos mtodos:

PASOS PARA EL DESARROLLO

7b. MTODO CUANTITATIVO

7b. MTODO CUALITATIVO

8. VALIDACIN DEL MTODO Y TRABAJO DE RUTINA

Separacin hipottica de los productos A, B y C, en equilibrio entre la fase mvil

Un grafico u otra representacin de la respuesta del detector,

Tiempo de Retencin (tR):

VR = t R (min).F (mL. min 1 )

moles _ de _ soluto _ en _ la _ fase _ estacionaria

Ancho de pico (w):

El termino altura equivalente de platos terico se expresa con la

Seria lamentable invertir semanas de

QUE SE DEBE CONOCER

Concentracin del analito en la muestra

QUE SE DEBE CONOCER

de una sustancia (desconocida), la caracterizacin de

Para cuantas matrices diferentes debe ser diseado el

componentes del instrumento y especialmente de la columna.

KD= constante de distribucin

Otra expresin usada es la fraccin de analito extrado (E) en

Vo= volumen de la fase orgnica

Este problema ocurre con cierto tipo de muestras (ej. Matrices

Adicin de una sal a la fase acuosa

Un lavado de las partculas despus de la filtracin con un

Solubilidad del analito en ambas fases

Las fuerzas intermoleculares de retencin como las de elucin

Involucra una matriz de la muestra polar o moderadamente

Debido a que el cartucho de SPE se emplea slo una vez se

La medicin de la incertidumbre depende de:

LC-GC Europe julio 2002 2-5

I0: intensidad de la luz incidente

Se obtiene el espectro UV de cada pico lo cual sirve para

SELECCIN DEL SISTEMA PRELIMINAR

- Caracteristicas qumicas de la fase estacionaria

por la interaccin entre los grupos funcionales en

Monomerico: un solo punto de enlace. provee rapida equilibracin y alta

del grupo funcional de la fase enlazada

Silica tipo B: pura y menos cida,

LC/GC 21, 1, 19-26 (2003)

RP-HPLC Tcnica ms usada en LC. Su

Ojo con los componentes hidrfobos de las

Polmeros, silica y alumina con recubierta

Las columnas RP-HPLC utilizan amplia variedad de F.M. Y aditivos,

Los usuarios deben ser conocedores

Que Causa el Aumento de Contaminantes en Columnas RP

Lavado de Columnas Enlazadas a Silica

No pasar inmediatamente solvente orgnico si se esta usando FM

Lavado de Columnas Enlazadas a Silica

Importante: Cada solvente en la serie debe ser miscible

Lavado de Columnas Enlazadas a Silica

Se puede invertir la columna?

Lavado de Columnas Enlazadas a Silica Contaminadas de Residuos

Despus de limpiar la columna con guanidina o

Lavado de Columnas Enlazadas a Silica Contaminadas de Residuos

Tecnicas Especiales para el Lavado de Columnas RP Enlazadas a Silica

Si la retencin de los analitos no se repite corrido ha corrido, es

Seleccionar una buena columna de soporte purificado y menos cidos y

Incremento de la presin de la columna

Use columnas bien enpacadas

Figura 3 articulo seleccin de solventes parte 1