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Biofar, Rev. Biol. Farm. Campina Grande/PB, v. 9, n. 1, p. 13-17, maro/maio, 2013

ESTUDO COMPARATIVO DE DOIS MTODOS DE EXTRAO DE DNA GENMICO
DO PEQUI (Caryocar coriaceum Wittm.)
Isaac Farias Cansano1, Henrique Douglas Melo Coutinho2
RESUMO - Caryocar coriaceum Wittm. (pequi) uma espcie abundante Floresta Nacional do
Araripe (FLONA). O fruto apresenta altas concentraes de vitaminas A, B1, B2, C e E, leo e
protenas, alm de propriedades amplamente utilizadas na medicina popular. Este trabalho visou
comparar dois protocolos de extrao de DNA. No primeiro procedimento, o isolamento do DNA
foi realizado com a macerao de folhas jovens utilizando o N 2 lquido por meio do CTAB 2%.
Para o segundo protocolo, folhas jovens foram submetidas a uma macerao em liquidificador
domstico utilizando tampo de extrao com propores especficas para sua homogeneizao.
Estas amostras foram quantificadas e analisadas quanto quantidade do DNA obtido. Uma maior
concentrao de DNA foi observada nas amostras extradas por macerao mecnica. A partir
destes dados obtidos, o procedimento dois demonstrou ser mais simples e de menor custo,
favorecendo assim seu uso laboratorial.
Unitermos: genmico, espectrofotometria, lise mecnica, CTAB.
COMPARISON BETWEEN TWO METHODS OF GENOMIC DNA EXTRACTION FROM
PEQUI (Caryocar coriaceum Wittm.)
ABSTRACT - Caryocar coriaceum Wittm. (pequi) is a common plant found on the National Forest
of Araripe (FLONA). The fruit presents a high content of vitamins A, B1, B2, C and E; fixed oil
and proteins, being also used on the folk medicine due its biological activities. The aim of this work
was compare two different protocols of DNA extraction. On the protocol 1, the DNA was isolated
from young leaves macerated using liquid nitrogen and CTAB 2%. On the protocol 2, the same
kinds of leaves were disrupted using a domestic blender for a mechanical lysis and homogenized
with extraction buffer. The two samples were quantified and analyzed to verify the DNA quality.
Best quality and higher concentrations of DNA were observed from the protocol 2. Due this results,
the protocol 2 shows to combine low costs and simplicity, being a possible method to be used on
laboratories and as didactic resource on the schools.
Uniterms: genomic, spectrophotometry, mechanical lysis, CTAB.
INTRODUO
O gnero Caryocar autctone e ocorrente em diversas regies do Brasil (Macedo, 2005).
Algumas espcies so encontradas em savanas, vegetao semelhante ao cerrado Brasileiro, estando
presente desde a Costa Rica at o Paraguai (Franco et al., 2004). Caryocar coriaceum Wittm.
1

Bilogo, Mestre em Gentica, Universidade Federal do Vale do So Francisco - UNIVASF, Departamento de Cincias
da Natureza, So Raimundo Nonato PI, Brasil (isaac.farias@gmail.com); 2 Bilogo, Doutor em Farmacologia,
Universidade Regional do Cariri - URCA, Departamento de Qumica Biolgica, Crato CE, Brasil
(hdmcoutinho@gmail.com ).
*
Endereo para correspondncia: Henrique D.M. Coutinho: Universidade Regional do Cariri - URCA; Centro de
Cincias Biolgicas e da Sade - CCBS; Departamento de Qumica Biolgica; Laboratrio de Microbiologia e Biologia
Molecular LMBM. 63105-000. Crato, CE Brasil. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E Mail:
hdmcoutinho@gmail.com
Recebido em 20/01/2013 - Aceite para publicao em 27/02/2013
Revista de Biologia e Farmcia. Universidade Estadual da Paraba. Centro de Cincias Biolgicas e da Sade.
Departamento de Biologia. Av. Juvncio Arruda, s/n, Bodocong, Campina Grande, PB, BRASIL. Cep: 58.109-753. Email: biofar@uepb.edu.br ou biofar.uepb@gmail.com

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(Pequi), uma espcie bem representada do nordeste Brasileiro. Madeira, casca, polpa, folhas e
amndoas so empregados para as mais diversas finalidades pelas comunidades tradicionais
(Oliveira, 1988; 2009).
A literatura disponvel existente retrata que C. coriaceum foi objetivo de trabalhos de anlise
morfolgica, fsica e qumica dos seus frutos bem como suas propriedades medicinais, inexistindo
pesquisas genticas at o momento (Saraiva et al., 2008; Oliveira, 2009). O estudo molecular frente
a espcies nativas de grande importncia, principalmente em estudos visando o auxlio em
programas de melhoramento gentico, uma vez que este tipo de planta naturalmente propaga-se por
sementes, apresentando grande heterogeneidade em suas caractersticas (Silva; Medeiros Filho,
2006; Vera et al., 2007).
Entretanto, dependendo da espcie em questo e das condies laboratoriais, so necessrias
algumas modificaes e adaptaes nos protocolos para a obteno de padres qualitativos e
quantitativos de DNA. Estas adequaes acontecem porque algumas plantas apresentam altos nveis
de polifenis e presena de mucilagens foliares que dificultam a extrao e amplificao de cidos
nuclicos, necessitando assim de uma otimizao que facilite a operacionalizao da tcnica de
extrao (Ferreira; Grattapaglia, 1995). Diante deste fato, pretende-se conhecer o nvel de
Diversidade Gentica do pequizeiro (Caryocar coriaceum Wittm.) na Biorregio do Araripe, onde
um dos objetivos especficos foi testar e analisar dois protocolos de extrao de DNA [mtodo
CTAB e SDS via liquidificador] para uma melhor padronizao e otimizao do DNA dessa espcie
na regio em destaque.
MATERIAIS E MTODOS
Material vegetal
Folhas jovens foram colhidas em reas preservadas da Reserva Florestal do Araripe. Estas
foram estocadas em sacos plsticos, etiquetados e armazenados em recipientes isolantes a 0C e
posteriormente foram armazenadas em freezer a -20o C at a extrao do DNA. Os protocolos
adotados so bastante utilizados e consistentes em estudos genticos direcionado a plantas, bem
como acompanhados com as devidas adaptaes necessrias de padronizao.
Extrao de DNA usando o protocolo CTAB
O isolamento do DNA genmico foi feito usando 0,5g de folhas jovens para cada amostra de
pequi seguindo protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990), com modificaes. As amostras foram
maceradas na presena de N2 lquido, sendo ento transferidas para tubos contendo 6 mL de CATB
2% (brometo de Cetil-Trimetilamnio; Tris-HCl; EDTA) previamente incubados a 65 C durante
1h. Em seguida, foi feita uma lavagem com clorofrmio/lcool isoamlico (1 mL) com proporo de
24:1 e centrifugada a 2500 rpm por 15 minutos temperatura ambiente. Recuperada a fase superior
de cada tubo, estes foram conduzidos para tubos autoclavados, adicionando-se dois teros de
volume de isopropanol e deixados em temperatura ambiente por 12h. Na sequncia, foram
centrifugados a 1500 rpm por 3 minutos. Posteriormente, foram adicionados dois volumes de NaCl
(1M), mantendo os tubos em soluo por 10 minutos e 2,5 volumes de Etanol 100%, seguido de
centrifugao a 1500 rpm por 3 minutos para a precipitao do DNA. Aps a retirada do
sobrenadante, o DNA foi seco e adicionado ao pellet dois volumes de T.E. para ressuspender o
DNA. As amostras foram armazenadas a 4C, preservando o material at a quantificao.
Extrao de DNA usando o protocolo SDS via liquidificador
Seguindo o protocolo de Milach (1998) com modificaes. Foi preparada uma soluo com
250 ml de Tampo de Extrao (NaCl 5M: 25 mL, Tris-HCl 1M: 25 mL, EDTA 0,25 M: 50 mL,
SDS 20%: 15,62 mL, gua destilada e estril: 134,38 mL). Com isso, 10 g de folhas jovens foram
adicionadas em um liquidificador domstico junto com o tampo de extrao, a fim de ocorra a
marcerao. Aps 10 minutos, a soluo foi depositada em um Becker de 500 ml e incubada a 65
C durante 30 minutos. A soluo foi distribuda em 10 microtubos de 2 mL, colocando-os no
banho-maria para manter o extrato ressuspendido. Em torno de 10 minutos, os tubos foram retirados
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e adicionado um volume (650 l) de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1) em cada tubo, e

misturados cuidadosamente por inverso por 10 minutos, centrifugando-os a 5000 rpm por 15
minutos. Os sobrenadantes foram removidos e repassados para tubos estreis, repetindo-se este
procedimento por duas vezes. Na sequncia, estas amostras foram colocadas no refrigerador a 4C e
logo aps 2 horas foram centrifugadas a 10000 rpm por 15 minutos. Novamente os sobrenadantes
foram removidos, e distribudos em novos microtubos, ressuspendendo com gua ultrapura, sendo
ento armazenados e acondicionados em refrigerador a -20C at o momento da anlise de
quantificao destes materiais.
Anlise do DNA extrado por eletroforese em gel de agarose
A observao do DNA no primeiro protocolo foi realizada em gel de agarose a 1,5%,
utilizando um mix de 5 l de DNA e 5 l de corante de corrida (xileno cianol, azul de bromofenol e
sacarose), a 80 V/cm durante 1h e analisado em transiluminador. O segundo protocolo foi feito por
anlise em gel de agarose a 1,5%, numa reao de 4L de DNA (amostra) e 15L de corante de
corrida (glicerol, T.E. e azul de bromofenol), a 80 v por 1h e analisado em transiluminador. O DNA
de seis amostras foi quantificado por espectrofotometria a 260nm e sua pureza analisada pela
relao 260/280nm para os dois protocolos citados.
RESULTADOS E DISCUSSO
Foram detectadas diferenas nos dois protocolos utilizados. O protocolo 1 (Doyle; Doyle,
1990 com modificaes) no foi to eficiente para a extrao de DNA de Caryocar coriaceum
Wittm. No foi encontrado material gentico nas amostras 05 e 06 utilizadas neste procedimento
(Tabela 1).
A partir do protocolo 2 (Milach, 1998 com modificaes) foi possvel extrair uma
quantidade maior de DNA. Este protocolo decorreu de modificaes nas etapas de extrao e
centrifugao, facilitando a obteno de materiais com melhor qualidade e quantidade do que foi
encontrado no protocolo anterior e com pequenas parcelas de contaminantes.
Os testes qualitativos e quantitativos de DNA foram realizados pelo espectrofotmetro
(FEMTO 800 XI) nas seis amostras. A concentrao de DNA foi tambm estimada em relao sua
pureza, de acordo com Sambrook et al. (2001).
As amostras do procedimento 1 perfizeram valores de 260 nm entre 0,033 e 0,085, e de
280 nm entre 0,037 e 0,078. Nas amostras do protocolo 2, os valores encontrados de 260 nm foram
entre 0,242 e 0,306, e de 280 nm entre 0,197 e 0,263. A relao A260/280 perfez valores entre 0,89
e 1,35 bem como entre 1,12 e 1,40, respectivamente.
Tabela 1 - Quantificao e anlise de pureza de seis amostras de DNA extrado de Caryocar
coriaceum Wittm. a partir de tecido foliar, obtidas pelo mtodo CTAB e SDS, utilizando leituras de
absorbncia de 260 nm e 280 nm.
Amostras
CTAB
SDS
A260 A280 A260/280 [DNA]ng/ A260 A280 A260/280 [DNA]ng/L
L
0,085 0,063
1,35
425,00
0,295 0,262
1,12
1475,00
01
0,075 0,078
0,96
325,00
0,242 0,197
1,23
1210,00
02
0,033 0,037
0,89
95,00
0,299 0,252
1,19
1495,00
03
0,058 0,047
1,23
290,00
0,272 0,216
1,26
1360,00
04
0,306 0,263
1,16
1530,00
05
0,291 0,207
1,40
1455,00
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Segundo Weising et al. (2004) e Kotchoni e Gachomo (2009), o mtodo CTAB tem sido
muito utilizado para extrao em tecidos frescos e diversos protocolos tm sido desenvolvidos para
este fim em todo o mundo. Entretanto, para extrao de DNA de C. coriaceum Wittm., alguns
procedimentos podem ter favorecido a presena de compostos que ajudam a degradar o DNA no
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momento da extrao, como polissacardeos e compostos fenlicos, detentores de grande presena

nos vegetais e que possuem um amplo efeito oxidativo nos constituintes celulares.
Entretanto, no outro protocolo utilizando SDS, diversos autores evidenciaram uma boa
eficincia no isolamento do DNA para estudos de variabilidade gentica, sendo tambm bastante
significativo na utilizao deste material gentico em programas de melhoramento gentico de
espcies agroindustriais (Figueira et al., 1992; Ahmed et al., 2009). Embora o mtodo utilizado com
xito tenha sido realizado de forma rudimentar, este procedimento garantiu o isolamento do DNA
em maior quantidade, com melhor pureza e com menor custo, ainda que seja preciso alguns ajustes
a fim de que resulte em um material gentico sem contaminantes.
Diferentes mtodos de extrao de DNA surgiram nas ltimas dcadas, na sua maioria
utilizando o nitrognio lquido (Kotchoni; Gachomo, 2009), ou em menores propores, fazendo
uso da liofilizao (Sperisen et al., 2000) ou at raspa de vidro (Huang et al., 2002). O intuito de
macerar o tecido foliar facilitar a separao e o isolamento do material gentico, servindo como de
ponto de partida para diversos estudos genticos, como seleo assistida por marcadores
moleculares ou mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci) (Ferreira; Grattapaglia, 1995).
De acordo com Faleiro et al. (1996), a integridade do DNA de fundamental importncia
para uma boa reprodutibilidade de produtos amplificadores assistidos por marcadores moleculares.
Entretanto, dependendo da quantidade presente de contaminantes no material, o uso destes cidos
nuclicos no inviabiliza a obteno de padres ntidos e reprodutveis por meio da PCR. O
procedimento utilizado via liquidificador pioneiro em tcnicas de isolamento de materiais
genticos, podendo ento ser empregado, mesmo de forma to simples, em diversas finalidades
cientficas como, por exemplo, em estudos de diversidade gentica intra e interespecfica, embora
os resultados de outros autores tenham sido relatados at o momento utilizando outros meios de
macerao mecnica (Faleiro et al., 2008).
Este mtodo pode tambm ser favorvel em centros universitrios ou instituies de
ensino de regies longnquas, onde possuem dificuldades de obter nitrognio lquido, e com isso a
tcnica de extrao de cidos nuclicos possa est mais presente em aulas prticas de biologia ou
projetos de pesquisa e extenso, auxiliando assim o entendimento da parte terica disciplinar. Entre
os protocolos testados neste trabalho, o que apresentou melhor resultado foi o de Milach (1998) via
liquidificador/SDS, modificado para se adaptar Caryocar coriaceum Wittm., obtendo uma
qualidade e quantidade superior em relao ao outro procedimento.
Este trabalho pode representar um importante passo para o estudo da espcie vegetal
nativa, uma vez que pioneiro na rea da gentica de plantas na regio, o que auxiliar na execuo
de um protocolo com menor custo, ampliando a aplicabilidade deste procedimento para outras
espcies nativas da Chapada do Araripe.
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