BMC Gastroenterol. 2010; 10: 57.

PMCID: PMC2894006

. Pubblicato online 2010 8 giugno doi: 10,1186 / 1471-230X-10-57

Effetto combinato dei polimorfismi regolamentazione sulla trascrizione di UGT1A1 come

causa della sindrome Gilbert
Katsuyuki Matsui , 1 Yoshihiro Maruo , 1 Hiroshi Sato , 2 e Yoshihiro Takeuchi 1
1
2

Dipartimento di Pediatria, Shiga University of Medical Science, Tsukinow a, Seta, Otsu, Shiga 520-2192, Giappone
Dipartimento di Bioscienze, Shiga University of Medical Science, Tsukinow a, Seta, Otsu, Shiga 520-2192, Giappone
Corrispondente autore.

Katsuyuki Matsui: kmatsui@belle.shiga-med.ac.jp ; Yoshihiro Maruo: maruo@belle.shiga-med.ac.jp ; Hiroshi Sato: satoh@belle.shiga-med.ac.jp ; Yoshihiro Takeuchi: .jp
takeuchi@belle.shiga-med.ac
Ricevuto 2009 6 Nov; Accettato 2010 Jun 8.
Copyright 2010 Matsui et al; licenziatario BioMed Central Ltd.

originale
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Combined effect of regulatory polymorphisms on transcription of

UGT1A1 as a cause of Gilbert syndrome
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Sfondo

La sindrome di Gilbert causata da difetti di bilirubina UDP-glucuronosiltransferasi (UGT1A1). La variazione pi comune che si
ritiene essere coinvolti A (TA) 7TAA. Sebbene diversi polimorfismi sono stati trovati per collegare con A (TA) 7TAA, l'effetto
combinato dei polimorfismi regolatori nello sviluppo della sindrome Gilbert ancora chiaro.
Metodi

In una analisi di 15 pazienti e 60 soggetti normali, abbiamo rilevato 14 polimorfismi e nove aplotipi nella regione regolamentare.
Abbiamo classificato la regione normativo 4 kbp dei pazienti in: la TATA box compreso A (TA) 7TAA; un modulo potenziatore
reattivo fenobarbital compresi C.-3275T> G; e una regione tra cui dieci altri polimorfismi collegati. L'effetto sulla trascrizione di questi
polimorfismi stato studiato.
Risultati

Tutti aplotipi con A (TA) 7TAA avevano C.-3275T> G e polimorfismi supplementari. In un in-vitro studio di espressione della
regione normativo 4 kbp, A (TA) 7TAA solo non ha ridotto in modo significativo la trascrizione. Al contrario, C.-3275T> G ridotta
trascrizione al 69% di quella di tipo selvaggio, ei polimorfismi legati ridotta trascrizione al 88% di tipo selvatico. Trascrizione della
regione regolamentare tipica dei pazienti era di 56% di tipo selvatico. Co-espressione del recettore androstane costitutiva (CAR) ha
aumentato la trascrizione di tipo selvatico di un fattore di 4,3. Ogni polimorfismo di per s non ha ridotto la trascrizione al livello dei
pazienti, tuttavia, anche in presenza di CAR.
Conclusioni

Questi risultati implicano che la cooperazione di A (TA) 7TAA, C.-3275T> G e polimorfismi collegati necessaria nel causare la
sindrome di Gilbert.
Sfondo

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La via di eliminazione della bilirubina negli esseri umani catalizzata esclusivamente da bilirubina UDP-glucuronosiltransferasi
(UGT1A1) [ 1 ]. La sindrome di Gilbert un lieve iperbilirubinemia non coniugata ereditaria senza disfunzione epatica o anemia
emolitica. E 'causata da difetti di UGT1A1 ed uno dei pi diffusi disordini metabolici congeniti; Sindrome di Gilbert trovato
clinicamente in 3-10% della popolazione [ 2 - 5 ].
Il gene UGT1A1 ( UGT1A1 ) ha la TATA box e un modulo fenobarbital reattivo enhancer (gtPBREM) nella sua regione di
regolamentazione [ 6 , 7 ]. Il tipo selvaggio di TATA box ha sei ripetizioni di TA, ed convenzionalmente scritto come A (TA) 6TAA
[ 6 ]. Il gtPBREM un modulo importante enhancer di UGT1A1 , comprendente una regione di 290 bp. Si trova a circa 3,5 kbp
monte della regione codificante e lavora in presenza di recettori nucleari, come recettore androstane costitutiva (CAR) [ 7 ].

Tre variazioni sono i polimorfismi pi comuni nei pazienti con sindrome di Gilbert: il TA-inserimento (C.-53TA [8]) nella casella
TATA, scritto come A (TA) 7TAA; C.-3275T> G in gtPBREM; e c.211G> A (p.G71R) nell'esone 1 [ 8 - 11 ]. In precedenti
relazioni, C.-3275T> G stato scritto da C.-3279T> G [ 12 ]. Nella presente relazione che abbiamo adottato la sequenza
nucleotidica del UGT1A1 rivelato in GenBank adesione n NG_002601 , sulla base della nostra analisi del gene. A (TA) 7TAA si
trova in tutti i gruppi etnici, e la sua frequenza 0,36-0,40 in caucasici, 0,35-0,43 in africani e 0,15 in Giappone [ 11 - 15 ]. La
maggior parte dei caucasici e africani con la sindrome di Gilbert hanno omozigote A (TA) 7TAA [ 11 ]. Di conseguenza, A (TA)
7TAA ritenuto essere la causa principale della sindrome di Gilbert.
Attivit UGT1A1 nei pazienti con sindrome di Gilbert stato circa il 30% del normale, sulla base di studi che coinvolgono campioni di
fegato umano [ 16 - 18 ]. In successivi studi con campioni di fegato umano di omozigote A (TA) 7TAA, l'attivit enzimatica UGT1A1
stata del 48% di tipo selvaggio, e il livello di espressione della proteina UGT1A1 era 42-50% di tipo selvaggio [ 18 - 20 ]. A (TA)
7TAA ha riferito soltanto un terzo della attivit trascrizionale di tipo selvaggio, basato su uno studio dell'espressione genica con la
regione regolatrice dalle C.-546 a C.-4 [ 11 ]. No statisticamente significativa differenza di attivit tra A (TA) 6TAA e A (TA) 7TAA
stato rilevato nel nostro precedente studio, tuttavia, utilizzando sei diverse lunghezze di regione normativo varia 111-3188-bp in
lunghezza [ 21 ]. Inoltre, altri gruppi hanno riferito che l'attivit trascrizionale non era cos drasticamente ridotto A (TA) 7TAA (al 7086% di tipo selvatico, non di un terzo) [ 14 , 22 ].
La frequenza di C.-3275T> G in gtPBREM 0,26 in giapponese, 0,47 e 0,85 nei caucasici e afro-americani [ 12 , 23 ]. Abbiamo
trovato che tutti i pazienti con sindrome di Gilbert con omozigote A (TA) 7TAA erano anche omozigote per C.-3275T> G, e abbiamo
suggerito che un effetto combinato di questi polimorfismi sulla trascrizione essenziale per la sindrome [ 24 ]. Inoltre, il C.-3152G> A
e C.-364C> T polimorfismi, e C.-3275T> G, sono stati recentemente trovati a collegare con A (TA) 7TAA [ 12 , 23 ], e numerosi
polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) di UGT1A1 stati inoltre riferito GeneSNPs [ 25 ]. Per determinare il ruolo dei polimorfismi
di regolamentazione nella sindrome di Gilbert, abbiamo prima analizzato aplotipi dei pazienti e soggetti normali. Sulla base dei risultati,
l'attivit trascrizionale di un 4-kbp regione regolatrice continua stata studiata in presenza e assenza di CAR.
Metodi

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Il sequenziamento del UGT1A1 regione regolatoria trascrizionale

La regione a monte della UGT1A1 stati analizzati in una popolazione casuale di 50 soggetti giapponesi e in quattro giapponese con
sindrome Gilbert avente omozigote A (TA) 7TAA, nonch in dieci sani caucasici normali e 11 Caucasici non imparentati con sindrome
di Gilbert; tutti hanno dato il consenso informato. Lo studio stato approvato dal comitato etico della Shiga University of Medical
Science. Abbiamo amplificato la regione di regolamentazione quattro frammenti di DNA separati, utilizzando la reazione a catena della
polimerasi (PCR). Prime Stella HS (Takara Bio INC., Shiga, in Giappone) stato utilizzato per la PCR di frammento 1 (C.-3559 a
C.-2614). Ex Taq (Takara Bio Inc.) stato utilizzato per la PCR del frammento 2 (C.-2670 a C.-883), frammento 3 (C.-950 a
C.-314) e frammento 4 (C.-446 a c. 879 + 78). Il buffer D di un kit di PCR Optimizer (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)
stato utilizzato al posto del buffer allegato di Ex Taq nella PCR di frammento 3. I prodotti di PCR sono stati sequenziati direttamente
utilizzando un ABI PRISM Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Tabelle 1-A
e 1-D mostra tutti i primer e le condizioni utilizzate in questo studio.
Tabella 1
Fondi per l'amplificazione e sequenziamento di UGT1A

Costruzione dei vettori di espressione

Per studiare l'effetto del TATA box, gtPBREM, e gli altri polimorfismi della regione regolatoria, abbiamo costruito vettori di
espressione di luciferasi comprese le regioni regolatorie con combinazioni di questi polimorfismi differenti. Abbiamo anche costruito un
vettore di espressione CAR, per studiare l'effetto di CAR sulla trascrizione della regione di regolamentazione con gtPBREM.
Clonazione della regione regolatoria in due frammenti di DNA separati

Due tipi di DNA genomico sono stati scelti per costruire vettori di espressione. Uno un tipo Gilbert sindrome da un paziente
giapponese con la sindrome di Gilbert con omozigote A (TA) 7TAA. L'altro di tipo selvatico da un soggetto normale avere sequenza
identica, riportato in GenBank adesione n NG_002601 . La regione distale (C.-4076 a C.-1945) e della regione prossimale (C.-2483
per c.247) sono stati amplificati con PCR, utilizzando Takara LA Taq versione Hot Start (Takara Bio INC) (Tabella 1-B ). I
prodotti di PCR sono stati clonati in un pCR -XL-TOPO vettoriale con un kit di clonazione TOPO XL PCR (Invitrogen
Corporation), e le intere regioni coinvolte sono state controllate mediante sequenziamento in modo da eliminare eventuali errori
derivanti l'amplificazione PCR (Tabella 1 -E ).
Costruzione dei vettori di espressione

Siti di restrizione per legatura in un vettore di espressione sono state introdotte nel prossimali e distali regioni regolatorie mediante PCR

della regione regolatoria clonato, utilizzando primer PCR con i siti di restrizione (Tabella 1-C ). Ogni prodotto della PCR (prossimale;
C.-2323 a C.-1: distale; C.-4076 a C.-1945) stato inserito nel PCR di XL-TOPO vettoriale. Vettori di espressione PGV-B2
(CO TOYO B-Net., LTD, Tokyo, Giappone) con wild-type o Gilbert-sindrome-tipo continuo a 4 kbp regione normativo (C.-4076 a
C.-1) sono stati costruiti per restrizione e legatura con un kit di legatura-Convenienza, come indicato in figura (NIPPON GENE CO,
LTD, Tokyo, Giappone..) 1 : Vettori No.1 e 2 sono i tipi di bosco e Gilbert-sindrome, rispettivamente.
Figura 1
Elenco dei vettori costruito . UGT1A1 regioni regolatorie (C.-4076 a C.-1, nn. 1 - 8),
con combinazioni di varianti polimorfiche differenti, sono stati inseriti nel luciferasi giornalista
plasmide PGV-B2. La wild-type vettore No.1 e No.2 un tipico ...
Abbiamo scoperto che la regione tipica tra gtPBREM e A (TA) 7TAA del paziente comprendeva dieci polimorfismi collegate,
C.-3152G> A, C.-2951A> G, C.-2743T> C, C.-2737T> C, C.-2726G> A, C.-2724AT [8], C.-2473T> G, C.-1352A> C,
C.-689A> C e C.-364C> T (tabella 2 ). L'effetto della regione sulla attivit trascrizionale stata determinata come unit. Abbiamo
classificato la regione regolatoria del UGT1A1 con i polimorfismi rilevate nelle tre regioni seguenti: la TATA box compreso A (TA)
7TAA, gtPBREM compresi C.-3275T> G, e la regione rimanendo con le dieci polimorfismi legati, secondo le loro posizioni nella
sequenza normativo e studi precedenti. Per studiare gli effetti delle tre regioni sulla trascrizione, da sola o in combinazione, vettori con
diverse combinazioni di polimorfismi sono stati costruiti per restrizione e legatura, come indicato nella Figura 1 . Vettori nn. 3-8 sono i
tipi di combinazione.
Tabella 2
Aplotipi nella UGT1A1 regione regolatoria trascrizionale

Costruzione di espressione CAR vettoriale

CAR-cDNA stato isolato da una libreria di cDNA di fegato umano (Takara Bio INC) mediante PCR, come descritto da Auerbach
et al [ 26 ]. Il prodotto di PCR stato clonato nel vettore pCR2.1 (Invitrogen Corporation). CAR-cDNA stato tagliato da EcoR I e
EcoR V, e ligato nel vettore pCR3.1 (Invitrogen Corporation).
Transfection e luciferasi test

Cellule HepG2 dalla cella Riken Bank (Tsukuba, Giappone) sono state coltivate nel mezzo essenziale minimo, che comprende i sali di
Earle, aminoacidi non essenziali, ma non - L-glutammina (MEM, Invitrogen Corporation), integrato con il 10% di siero fetale bovino
(Invitrogen Corporation), 50 U di penicillina / ml e 50 mg di streptomicina / ml. Le cellule sono state trasferite ad una piastra di coltura
a 24 pozzetti (7 x 10 4 cellule / pozzetto) in 25 ore prima trasfezione. Per la trasfezione, 250 ml di MEM, 3,0 ml di GenePORTER
Transfection Reagent (GeneLantis, San Diego, CA) e vettori plasmidici sono stati versati sulle celle in ogni pozzetto. La composizione
dei vettori plasmidici per trasfezione era: plasmide reporter luciferasi PGV-B2 con una regione trascrizionale normativo (400 ng), il
plasmide di espressione CAR-pCR3.1 o plasmide finto (200 ng), e il plasmide di espressione luciferasi Renilla pRL- SV40 (6 ng) per
la normalizzazione. Dopo 3 ore, 250 ml di MEM contenente siero bovino fetale 20% stato aggiunto a ciascun pozzetto. Dopo 28
ore le cellule trasfettate in ogni pozzetto sono stati lisati, e le attivit luciferasi doppi sono stati immediatamente misurati con un kit dual
PicaGene SeaPansy Luminescence (CO TOYO B-Net., LTD).
L'analisi dei dati

Le analisi di aplotipo stata effettuata utilizzando il software Haploview 3.32 [ 27 ]. Variazioni attivit trascrizionale causa dei
polimorfismi sono stati analizzati mediante l'analisi di regressione multipla (vedi file aggiuntivi 1 , tabella S1), utilizzando il software
SPSS16.0.1J (SPSS Inc. Giappone, Tokyo, Giappone). Per la codifica manichino, abbiamo definito le wild-type e mutante tipo
polimorfismi come 0 e 1, rispettivamente.
Risultati

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Sequencing e aplotipo analisi nella regione regolatoria del UGT1A1

La regione a monte della UGT1A1 stata analizzata in pazienti con sindrome di Gilbert e in soggetti normali giapponesi e caucasici. La
regione di regolamentazione di tipo selvaggio era coerente con NG_002601 , che riportata ad essere la sequenza di UGT1A1 dal
Centro Nazionale USA for Biotechnology Information (tabella 2 , di tipo I). Quattordici variazioni polimorfiche con combinazioni
distinti sono stati identificati (Tabella 2 ). A (TA) 7TAA sempre legato C.-3275T> G, C.-2951A> G, C.-2743T> C, C.-2726G> A,
C.-2473T> G , C.-1352A> C, C.-689A> C e C.-364C> T. Inoltre, gli alleli con A (TA) 7TAA avevano varianti del numero ATrepeat da C.-2724. Il AT- numero di ripetizione a C.-2724 di tipo selvaggio aveva tre anni, indichiamo questo come C.-2724AT [ 3 ]
La variante di pazienti giapponesi hanno omozigote A (TA) 7TAA era otto AT-ripete:. [8 C.-2724AT ]. Il numero di ripetizione era
maggiore di otto pazienti caucasici, ma non poteva essere determinata esattamente a causa della difficolt di amplificazione con PCR

affidabili. Queste varianti sono descritti qui come C.-2724AT [> 8]. Inoltre, A (TA ) 7TAA era legato principalmente con C.-3152G>
A (C.-3156G> A in una precedente relazione (10)) e C.-2737T> C. Dall'analisi, nove differenti aplotipi sono stati identificati, con
combinazioni diverse di 14 variazioni polimorfiche (tabella 2 ) e 14 tipi di diplotype (vedi file aggiuntive 2 , tabella S2).
Effetto di polimorfismi normative in trascrizione

Sulla base dell'analisi aplotipo dei pazienti Gilbert in giapponese e caucasici, abbiamo selezionato le pi tipiche regioni regolatorie di
tipo selvatico e Gilbert sindrome di in-vitro studi di espressione: in tabella 2 , tipo I e tipo V, rispettivamente. La regione normativo
per la sindrome di Gilbert stato clonato da un paziente giapponese a causa del numero incerto AT-repeat in caucasici, dal momento
che tutti gli omozigoti con A (TA) 7TAA erano sindrome di Gilbert indipendentemente C.-2724AT [8] o C.-2724AT [> 8]. Per
semplificare l'analisi, la regione di regolamentazione con i polimorfismi rilevati stato classificato in tre categorie: la TATA box
compreso A (TA) 7TAA; gtPBREM compresi C.-3275T> G; e la regione con i dieci polimorfismi collegato specificato nella sezione
Materiali e Metodi sopra.
Le barre grigie in figura 2 mostrano attivit trascrizionale senza co-espressione di CAR. A (TA) 7TAA non ha ridotto in modo
significativo l'attivit trascrizionale (94% di tipo selvaggio, p = 0,14). Al contrario, C.-3275T> G e dieci polimorfismi collegati ridotto
significativamente l'attivit, al 69% e il 88% di tipo selvaggio, rispettivamente ( p <0.001 e p = 0,001). Il nostro studio dimostra che
C.-3275T> G esercita la maggiore riduzione nella trascrizione. L'aplotipo tipica dei pazienti Gilbert (GM (TA) 7_Gilbert nella figura 2
) ha ridotto l'attivit trascrizionale al 56% di tipo selvatico.
Figura 2
Attivit trascrizionale di regione normativo 4 kbp continuo (C.-4076 a C.-1), con /
senza il plasmide espressione CAR . La combinazione di variazioni di ciascun vettore di
espressione mostrato in Figura 1. Nome di espressione vettore rappresenta polimorfismi
...
Le barre bianche nella figura 2 mostrano attivit trascrizionale con co-espressione di CAR. L'attivit di wild-type aplotipo stata
aumentata con CAR di un fattore di 4.27 (SD = 0.18, p <0.001). I dieci polimorfismi legati solo non ha ridotto l'attivit trascrizionale.
Al contrario, C.-3275T> G e A (TA) 7TAA ridotto significativamente l'attivit, al 85% e 83% di tipo selvaggio rispettivamente ( p
<0.001 e p <0.001). L'aplotipo tipica dei pazienti con sindrome di Gilbert (GM (TA) 7_Gilbert nella figura 2 ) ha ridotto l'attivit
trascrizionale al 68% di tipo selvatico. Questi risultati suggeriscono che AT (TA) 7TAA per s non riduce l'attivit trascrizionale
sufficiente a causare la sindrome Gilbert, e che la cooperazione di C.-3275T> G e dieci polimorfismi collegati con AT (TA) 7TAA
necessaria per provocare la sindrome.
Discussione

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Riducendo la trascrizione di UGT1A1, A (TA) 7TAA riconosciuta come una delle pi importanti cause di sindrome di Gilbert.
Ulteriori polimorfismi a monte della regione codificante-UGT1A1 sono stati recentemente rilevata e, a parte A (TA) 7TAA e -3275T>
G al gtPBREM, il ruolo di questi polimorfismi nello sviluppo della sindrome di Gilbert ancora chiaro.
Nella presente analisi della regione regolatoria del UGT1A1 , nove aplotipi sono stati rilevati con diverse combinazioni di 14 varianti
polimorfiche (tabella 2 ). Da questa analisi abbiamo potuto determinare l'aplotipo tipico della regione regolamentare di pazienti con A
(TA) 7TAA come C.-3275G, .c-3152A, C.-2951G, C.-2743C, C.-2737C, c .-2726A, C.-2724AT [8] o [> 8], C.-2473G,
C.-1352C, C.-1125C, C.-997G, C.-689C, C.-364T e A (TA ) 7TAA. Inoltre, la regione regolatoria di tipo selvaggio era identica
NG_002601 in tutti i casi giapponesi e caucasici, e diversa dalla sequenza usata in studi di espressione precedenti, ossia AF297093 in
GenBank [ 12 , 28 ]. In particolare, quattro coppie di basi (C.-3043T, C.-3032G, C.-2985C e C.-2982G) a valle nei pressi
gtPBREM in AF297093 non esistono in NG_002601 .
Abbiamo classificato regione normativo in tre categorie, in modo da semplificare l'analisi, tenendo conto dei precedenti studi e le
posizioni presenti nella sequenza regolamentare. Queste tre categorie sono: gtPBREM compresi C.-3275T> G; la regione tra cui dieci
polimorfismi collegate; e la TATA box compreso A (TA) 7TAA. Abbiamo esaminato ulteriormente il loro effetto sulla trascrizione, sia
in presenza che in assenza di CAR. Questo stato fatto per tre ragioni. In primo luogo, l'attivit enhancer di gtPBREM elevata in
auto in in-vitro esperimenti usando le cellule di coltura [ 10 ]. In secondo luogo, CAR stata proposta come un regolatore chiave
della clearance bilirubina nel fegato in wild type e CAR umanizzato topi transgenici [ 29 ]. Terzo, C.-3275T> G risulta essere un
ulteriore fattore di sviluppo dell'iperbilirubinemia [ 30 ].
Trascrizione della regione normativo wild-type stata rafforzata 4,3 volte da co-espressione di CAR (figura 2 ). Questo era un fattore
simile a quella in studi precedenti UGT1A1 [ 10 ]. C'erano differenze di trascrizione tra A (TA) 7TAA, C.-3275T> G e dieci
polimorfismi collegati, sia in presenza e assenza di CAR. A (TA) 7TAA di per s ridotto di trascrizione al 94% di tipo selvatico (p =
0,14, non significativo), senza CAR, e al 83% (p <0,001) con CAR. Di per s, poi, A (TA) 7TAA non riduce l'attivit trascrizionale al
42-50%, che il valore stimato della attivit enzimatica e la quantit di proteina enzimatica in campioni di fegato umano omozigote A
(TA) 7TAA [ 18 - 20 ]. A (TA) 7TAA parimenti non riduce la trascrizione verso i valori riscontrati nei campioni umani nel nostro

esperimento utilizzando regioni regolatorie pi brevi (C.-2323 a C.-1 e C.-274 a C.-1) (dati non mostrati ). Questi risultati
suggeriscono che ulteriori mutazioni / varianti legate alla A (TA) 7TAA partecipano nel ridurre la trascrizione.
I dieci polimorfismi legati situato tra A (TA) 7TAA e C.-3275T> G insieme ridotto di trascrizione al 88% (p = 0,001), di tipo
selvaggio senza auto. Questa riduzione potrebbe essere dovuto principalmente a C.-1352A> C, dal momento che questa variazione
ridotto l'attivit al 85% di tipo selvaggio nel nostro studio precedente, con una regione regolatoria 3 kbp [ 21 ]. I dieci polimorfismi
collegati non ha indotto alcun cambiamento significativo nella trascrizione con CAR. Non chiaro il motivo per cui non vi era alcuna
riduzione significativa della trascrizione in presenza di CAR, ma la valorizzazione 4,3 volte della attivit con auto potrebbe mascherare
l'effetto inibitorio di C.-1352A> C.
A differenza di A (TA) 7TAA ei dieci polimorfismi collegate, C.-3275T> G notevolmente ridotta attivit trascrizionale con e senza
CAR, al 69% (p <0,001) e 85% (p <0,001) di tipo selvaggio, rispettivamente. Questo risultato coerente con la relazione che
C.-3275T> G un fattore di sviluppo dell'iperbilirubinemia [ 30 ].
Sugatani et al. recentemente riportato che la TATA box ridotta trascrizione in misura maggiore di C.-3275T> G (C.-3279T> G della
sequenza di accensione), in uno studio utilizzando la regione regolatoria da C.-3570 a C.-1 [ 28 ]. Questa regione normativo prevede
due differenze significative nel loro lavoro e la nostra. In primo luogo, essi non considerano i dieci polimorfismi tra gtPBREM e la
TATA box. In secondo luogo, il loro studio ha utilizzato la sequenza di AF297093 , mentre abbiamo utilizzato NG_002601 . Almeno
una parte della discrepanza tra i loro risultati e il nostro potrebbero derivare da queste differenze.
Senza CAR, l'aplotipo tipica dei pazienti con sindrome di Gilbert stato efficace nel ridurre la trascrizione, al 56% di tipo selvaggio, e
con auto al 68% di wild type (Figura 2 ). I risultati senza CAR sono quasi compatibile con il precedente in vivo dati: attivit enzimatica
UGT1A1 stata del 48%, e il livello di espressione della proteina UGT1A1 era 42-50%, di tipo selvatico in studi che utilizzano
campioni di fegato umano di portatori con omozigote A (TA) 7TAA [ 18 - 20 ]. C' solo una piccola quantit di CAR nei nuclei degli
epatociti primari umani [ 31 ], ma stato riferito che i difetti nella clearance bilirubina non si osservano in CAR-null mice finch non
viene applicato lo stress del caso, e che gli aumenti CAR nucleari la presenza di attivatori quali una grande concentrazione di bilirubina
[ 29 ]. Di conseguenza lo stato CAR dei pazienti possono essere simili a quelli della esperimento senza CAR, nel qual caso CAR non
importante ai livelli sierici di bilirubina del paziente. Anche se la quantit di CAR nucleare nei pazienti intermedio tra i valori negli
esperimenti con e senza CAR, A (TA) 7TAA da sola non sufficiente per ridurre il livello di trascrizione trovata nel fegato di pazienti
con omozigote A (TA ) 7TAA [ 18 - 20 ].
I livelli di bilirubina si trovano ad essere correlato a polimorfismi di UGT1A1 ; C.-3275T> G, A (TA) 7TAA e c.211G> A in studi
genetici epidemiologici [ 30 , 32 ].
Valutazione epidemiologica degli effetti di ogni polimorfismi sullo sviluppo della sindrome di Gilbert difficile, perch quasi tutti gli
aplotipi con A (TA) 7TAA hanno anche C.-3275T> G e altri polimorfismi come C.-1352A> C.
I nostri in-vitro studi implicano l'esistenza di effetti combinati dei polimorfismi sull'attivit trascrizionale nello sviluppo della sindrome di
Gilbert; questi studi utilizzano vettori con combinazioni dei polimorfismi progettati specificamente per analizzare il ruolo dei singoli
polimorfismi. I nostri risultati possono spiegare perch quasi tutti i pazienti con sindrome di Gilbert sono doppie omozigoti per A (TA)
7TAA e C.-3275T> G [ 24 , 33 , 34 ]. Poich C.-3275T> G da sola non sufficiente per ridurre il livello di trascrizione a quella dei
pazienti, meno frequente A (TA) 7TAA pu svolgere un ruolo determinante nell'eziologia della sindrome di Gilbert. Pazienti
eccezionali, come colui che omozigote per A (TA) 7TAA e eterozigoti per C.-3275T> G, eterozigoti per A (TA) 7TAA e omozigoti
per C.-3275T> G, e omozigote solo per C.-3275T > G, pu avere ulteriori varianti di UGT1A1 che non sono ancora stati indagati, o
hanno variazioni degli altri enzimi (s) correlate a bilirubina metabolismo [ 28 , 33 , 34 ]. Ulteriori studi del rapporto tra la
concentrazione di bilirubina sierica e genotipo che includono un numero sufficiente di pazienti con aplotipi minori, sulla base di questa
analisi, dovrebbe identificare con precisione il coinvolgimento di ogni mutazione polimorfica nello sviluppo della sindrome di Gilbert.
Conclusioni

Vai a:

Tutti aplotipi di Gilbert sindrome pazienti con A (TA) 7TAA hanno sia C.-3275T> G e 8-11 polimorfismi tra gtPBREM e A (TA)
7TAA. CAR aumenta la trascrizione e cambia la quantit di inibizione esercitata da ciascun polimorfismo sulla trascrizione.
Indipendentemente dalla presenza di CAR, A (TA) 7TAA non ha di per s sufficiente ridurre l'attivit trascrizionale di causare la
sindrome Gilbert. Il nostro studio mostra che C.-3275T> G e dieci polimorfismi rilevati nei pazienti sono importanti per la diminuzione
della trascrizione di UGT1A1 oltre a A (TA) 7TAA, e che la sindrome Gilbert potrebbe essere causato dagli effetti combinati di questi
polimorfismi.
Abbreviazioni

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UGT1A1: bilirubina UDP-glucuronosiltransferasi; UGT1A1 : bilirubina gene UDP-glucuronosiltransferasi; gtPBREM: fenobarbital

modulo enhancer reattivo di UGT1A1 ; AUTO: recettore androstane costitutiva; SNP: polimorfismo a singolo nucleotide.
Conflitto di interessi

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.

Contributo degli autori

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KM ha partecipato alla progettazione dello studio, effettuato gli esperimenti e le analisi statistiche, e ha redatto il manoscritto. YM e
HS hanno preso parte alla progettazione dello studio, coordinato lo studio e ha contribuito a redigere il manoscritto. YT ha contribuito
alla redazione del manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale prima della presentazione.
Storia pre-pubblicazione

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La storia di pre-pubblicazione di questo documento si pu accedere qui:

http://www.biomedcentral.com/1471-230X/10/57/prepub
Materiale supplementare

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Il file aggiuntivo 1:
Tabella S1: Risultati delle analisi di regressione multipla . Variazioni attivit trascrizionale causa dei polimorfismi sono stati
analizzati mediante analisi di regressione multipla. ACT = A 1 X1 A 2 X2 A 3 X3 ACT 0 . Notazione: ACT: attivit trascrizionale;
ACT 0 : attivit trascrizionale di tipo selvaggio vettore, che fissato a 1 nel nostro studio; A 1 , A 2 e A 3 : coefficiente di
C.-3275T> G, dei dieci polimorfismi collegati e A (TA) 7TAA rispettivamente; X 1 , X 2 e X 3 : numeri per codifica fittizia,
definita come 1 nel caso di tipo mutante del polimorfismo e 0 nel caso di tipo selvaggio polimorfismo. Nello studio, senza CAR, A
1 , A 2 e A 3 sono 0.693 ( p <0,001), 0,876 ( p = 0,001) e 0,944 ( p = 0,141, rispettivamente). Nello studio con CAR, A 1 , A
2 e A 3 sono 0,854 ( p <0,001), 0,997 ( p = 0,839) e 0,829 ( p <0.001), rispettivamente. P : p value.
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Il file aggiuntivo 2:
Tabella S2: Diplotype di caucasici e giapponesi . Abbiamo rilevato 14 tipi di diplotypes nel nostro studio da quattro differenti
gruppi: soggetti casuali giapponesi, giapponese pazienti con sindrome di Gilbert con omozigote A (TA) 7TAA, normali caucasici,
e pazienti caucasici con sindrome di Gilbert.
Clicca qui per il file (68K, DOC)

Ringraziamenti

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Questo lavoro stato sostenuto da sovvenzioni-in-aiuti per la ricerca scientifica del Ministero dell'Istruzione, della Scienza e Cultura
del Giappone (nn. 14704032, 18590508 e 19591248) e la Madre e il Bambino Health Foundation in Giappone. Ringraziamo il Dr.
H. Inoue della Divisione di Microbiologia e Malattie infettive, Shiga University of Medical Science, per una lettura critica del nostro
manoscritto, e il Dr. C. D'Addario di Ex-Medico Residente Hospital, Argentina, per averci fornito con campioni di DNA (con il
consenso informato). Ringraziamo anche il signor M. Suzaki del Laboratorio di Ricerca Centrale, Shiga University of Medical Science,
per l'assistenza tecnica.
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