1.

Manipulacin de la expresin gnica en bacterias

El objetivo principal de la ingeniera gentica con fines industriales es lograr la correcta

expresin a altos niveles del gen clonado en el microorganismo husped elegido. Sin
embargo, la clonacin directa (sin manipulacin adicional) de un gen en un vector
normal (como el pBR322) no suele asegurar que nuestro gen de inters se vaya a
expresar bien, sobre todo cuando procede de especies alejadas filogenticamente. Por
esta razn hay que proceder al diseo de vectores especializados y a menudo a
modificaciones del gen de inters, con objeto de que este pueda transcribirse y
traducirse bien en el microorganismo husped. He aqu algunos de los elementos que
conviene manipular para este fin:
Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripcin (promotoresoperadores, terminadores)
Seales para el comienzo de la traduccin, especialmente sitios de unin del ribosoma
y codn de inicio de la traduccin
Eficiciencia de la traduccin, lo que puede obligar a utilizar codones sinnimos
adaptados a la abundancia de los correspondientes ARNt del husped
Estabilidad de la protena en la clula husped
Localizacin celular de la protena a expresar: en muchos casos interesa que la
protena se secrete, por lo que el diseo gentico debe incluir seales de
procesamiento postraduccional adecuadas. Otras veces interesa que la protena se
quede en el espacio periplsmico de la bacteria Gram-negativa husped, o que se
retenga en el citoplasma
Nmero de copias del gen clonado. Cuando se pretende que el gen se exprese a alto
nivel, se suele escoger un plsmido de control relajado, es decir, con gran nmero de
copias, mientras que si interesa un nivel bajo de expresin se escoge un plsmido de
control estricto (poco nmero de copias) o se recurre a integrar el gen de inters en el
cromosoma
Cada vez que queramos clonar y expresar un gen, debemos ajustar especficamente
muchos de estos parmetros, construyendo vectores de expresin ad hoc, escogiendo
las cepas huspedes, etc. Se trata de una labor que frecuentemente es bastante ardua,
y que pone en juego una gran cantidad de conocimiento de biologa molecular y de
pericias tcnicas.
Uno de los microorganismos huspedes ms usados es nuestro viejo amigo, el
colibacilo Escherichia coli, probablemente el ser vivo ms estudiado a nivel molecular, y
del que se dispone de una vasta batera de mtodos de manipulacin gentica in vitro.
Pero para muchos experimentos se debe recurrir a otros huspedes, como Bacillus
subtilis, la levaduraSaccharomyces cerevisiae, o incluso clulas de insectos o de
mamfero.
Antes de entrar en detalles, hagamos un retrato rpido de lo que debe tener un vector
de expresin en E. coli (se citan los elementos genticos siguiendo el orden desde el lado
5 al lado 3):
Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas 35 (TTGACA o parecida) y
10 (TATAAT o parecida)
A corta distancia del promotor, una regin que al transcribirse suministre el sitio de
entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno, que es

complementaria del extremo 3 del ARNr 16S

A unos 3-11 pb aguas abajo de la secuencia de Shine-Dalgarno, debera situarse el
codn ATG que seala el comienzo de la traducccin del ARNm. Este codn lo puede
suministrar el gen a clonar, o bien el vector puede disponer de ese codn, seguido de
alguna diana que permita la insercin del gen a expresar
Finalmente, y situado al lado 3 de todo lo anterior, una secuencia que funcione como
terminador de la transcripcin (que en su forma de ARN constituye la tpica horquilla
por emparejamiento intracatenario, donde la ARN polimerasa se desliga del ARN recin
formado).
A continuacin abordaremos algunos ejemplos de estrategias usadas en la manipulacin
de la expresin gentica en bacterias (sobre todo E. coli).

1.1

Promotores fuertes y regulables

En principio, uno podra pensar que si queremos expresar un gen a alto nivel,
deberamos escoger un promotor fuerte y constitutivo. Sin embargo, la mayor parte de
las veces no conviene usar tal tipo de promotores, porque al estar expresando
permanentemente el gen de inters a alto nivel, pueden sustraerse recursos para el
normal crecimiento de las clulas. Esto es especialmente delicado si la protena fornea
tiene efectos negativos para el huped. Por lo tanto, lo normal es emplear promotores
regulables, que el investigador puede conectar y desconectar a voluntad. Una estrategia
habitual es aquella en la que se cultiva la bacteria recombinante hasta que se logran
grandes densidades, momento en que se suministra la seal para que el promotor se
active y transcriba el gen insertado.

1.1.1

Ejemplos de promotores regulables

Los promotores regulables de E. coli que se emplean en los vectores de expresin ms

habituales son promotores fuertes pero que bajo ciertas condiciones estn reprimidos
por las correspondientes protenas represoras, lo que suministra la base para inducir o
desreprimir el gen adyacente a voluntad.

1.1.1.1 Derivados del promotor lac

El promotor del opern de la lactosa (lac) ha servido para disear elementos de control
de expresin en numerosos vectores. Mientras en el medio no exista lactosa (o un
inductor apropiado), el promotor est reprimido por el represor (producto del gen lacI).
En el laboratorio, la induccin se suele lograr aadiendo al medio un inductor gratuito
(que a diferencia de la lactosa, no se metaboliza, pero se une al represor, inactivndolo).
Ejemplo de inductor gratuito es el IPTG (isopropil-b-D-tiogalactsido). Para que el
promotor lac se exprese a alto nivel, tenemos que evitar la represin catablica: en
ausencia de glucosa la protena CAP se une con AMPc, y el complejo se une cerca del
promotor, ayudando a la ARN polimerasa a comenzar la transcripcin.
En los vectores de expresin se suele emplear un promotor lac mutante, conocido
como lacUV5 (con una sustitucin en la regin 10), que es ms potente que el promotor
silvestre. Por supuesto, esta variante es reprimible por LacI e inducible por IPTG.

1.1.1.2 Derivados del promotor trp

El opern trp contiene los genes estructurales que determinan las enzimas para la
sntesis del triptfano. Su promotor se ve reprimido, en presencia del triptfano en el
medio, por el complejo represor-triptfano. Si no hay triptfano disponible, el represor
queda inactivo, y por lo tanto el opern trp se transcribe. En los vectores basados en el

promotor trp, la expresin se logra en medio sin triptfano, mientras que se reprime en
presencia del aminocido, o aadiendo el compuesto cido 3-indol-acrlico.

1.1.1.3 Promotor hbrido artificial tac

En los aos 80 se dise un promotor artificial combinando la regin 35 del
promotor trp y la 10 del promotor lac, ponindole de nombre promotor tac. Dicho
promotor result ser 5 veces ms potente que el de trp y 10 veces ms que el de lac. A
semejanza del promotor de lac, el tac es inducible por IPTG y reprimible por glucosa. Se
ha usado mucho en vectores de expresin de alto rendimiento. Se llegan a alcanzar
niveles de protena recombinante del 10-30% de la total.
1.1.1.4 Promotores derivados del fago l
Se puede usar un sistema de expresin regulable consistente en el promotor P L del
fago l y su represor cI. En la prctica se recurre al represor mutante cI857, que es un
mutante termosensible (ts). De esta manera, podemos cultivar la bacteria recombinante
a una temperatura moderada (30C) a la que el represor impide la transcripcin del gen
de inters. Cuando el cultivo alcanza la densidad deseada, subimos la temperatura hasta
42C, lo que inactiva al represor, y se logra la expresin a alto nivel de nuestro gen
desde el promotor PL
1.1.1.5 Promotor del fago T7
El promotor del fago T7 necesita la ARN polimerasa especfica del mismo fago, por lo que
si queremos expresar genes bajo ese promotor, hay que clonar simultneamente el gen
de la polimerasa de T7. Normalmente este gen de la polimerasa se inserta en el
cromosoma de E. coli o en el profago l (la versin insertada del cromosoma del l en las
clulas lisognicas) y bajo el control del promotor de lac. Entonces se procede a
transformar las clulas con la construccin gentica dotada del gen de inters aguas
abajo del promotor del T7. Cuando aadimos el inductor IPTG, se induce el gen de la
polimerasa de T7, protena que transcribe a gran nivel el gen que hemos clonado.

1.1.2

Un ejemplo de plsmido de expresin de alta eficiencia

El plsmido pPLc2833 era ya un buen plsmido de expresin, pero vamos a ver cmo, a
partir de l, se construy otro an mejor.
El pPLc2833 cuenta con un mdulo pensado para clonar genes bajo el control del
promotor PL del fago l: tras el PL existe un polilinker, es decir, un trecho de ADN dotado
de mltiples dianas nicas para las respectivas enzimas de restriccin (lo que permite
usar cada vez la enzima ms adecuada a nuestro experimento). Este plsmido presenta
unas 40 copias por cromosoma. Para lograr una expresin a mayor nivel, se sustituy su
origen de replicacin por el origen de replicacin de otro plsmido, llamado pKN402, de
modo que el nmero de copias se puede aumentar unas 8 veces incubando la bacteria a
42C. De esta forma se obtuvo el plsmido mejorado pCP3. Para su uso correcto, las
clulas que albergan derivados de pCP3 con genes clonados bajo el promotor PL se
cultivan primero a 28C, y una vez alcanzada una buena densidad, la temperatura se
sube hasta 42C, con lo que el nmero de copias sube hasta unas 700. A esa
temperatura, el represor termosensible cI(ts) se inactiva, por lo que el promotor
PL funciona a su mximo rendimiento, y se logran altos niveles de la protena codificada
por el gen clonado.
Para hacerse una idea de la eficiencia de este sistema de expresin, baste decir que
cuando se clon el gen de la ligasa de T4 en el pCP3, nada menos que el 20% de la

protena total a 42C era ligasa de T4. (A ttulo comparativo, la protena natural ms
abundante de E. coli supone el 2% de la protena total).

1.1.3

Otros sistemas

El uso de promotores que se activan al bajar la temperatura presenta la ventaja de que

la protena se pliega mejor, con lo que se evitan los problemas de la formacin de
cuerpos de inclusin. El promotor mejor caracterizado es el de cspA, aunque tiene el
incoveniente de que se inactiva al cabo de 1-2 horas, tiempo demasiado corto para los
fermentadores.
Recientemente ha recibido atencin el sistema de la arabinosa, que ha sido
comercializado por Invitrogen. Usa el azcar arabinosa, que es barato, siendo la fuerza
del promotor dearaBAD ms dbil que la de los lac.

1.1.4

Sistemas de expresin adaptados a la gran escala

Los sistemas de expresin que hemos estudiado hasta ahora son muy buenos ... a escala
de laboratorio de investigacin, pero presentan el problema de que resultan caros y
complicados si los queremos usar a escala industrial (donde manejamos volmenes de
cientos de litros de cultivo):
Los sistemas basados en protenas termosensibles plantean el problema de que
cuando queremos aumentar la temperatura en un gran fermentador, esto requiere
bastante tiempo (hasta 1 hora), y sobre todo, un gasto de energa importante.
En los sistemas que se inducen con inductores como el IPTG, el problema es
econmico: no sera rentable aadir la cantidad adecuada de este tipo de sustancias a
un gran fermentador.
Para solucionar estos inconvenientes, se dise un sistema de expresin ms barato, con
dos plsmidos:
Uno de los plsmidos es de bajo nmero de copias, y lleva la parte codificadora del
gen del represor cI bajo el control del promotor trp. (El uso de un plsmido de control
estricto del nmero de copias garantiza que no se va a producir un exceso de
molculas de represor.
El segundo plsmido lleva el gen a expresar bajo el control del promotor p L.
Sabiendo cmo funcionan los elementos genticos implicados, es fcil deducir el
comportamiento del sistema:
En ausencia de triptfano en el medio, el promotor del trp est activo, y se producen
molculas de represor cI. Este represor se une al promotor pL del otro plsmido, y
reprime la transcripcin de nuestro gen, por lo que no se produce protena.
En presencia de triptfano, se reprime la transcripcin del gen cI desde el
promotor trp. Al no producirse represor cI, el gen clonado en el segundo plsmido se
puede expresar (desrepresin).
En la situacin real de un fermentador, las cosas ocurren de la siguiente manera:
Al principio, la bacteria se cultiva en un medio barato a base de melazas e
hidrolizados de casena, que contiene poco triptfano libre, de modo que nuestro gen
clonado no se expresa, porque est reprimido por cI.
Una vez que el cultivo se hace denso, se aade al medio triptona (un hidrolizado de
protena rico en triptfano). Entonces, al bloquearse el gen cI, queda desreprimido el
gen clonado, con lo que se pueden producir grandes cantidades de la

correspondiente protena. (Se han logrado niveles de 20% de protena recombinante

respecto de protena total).
Para la produccin a gran escala lo ideal sera un promotor que no requiera induccin
externa, y que por lo tanto haga el sistema ms barato y automtico. El del
gen pho (fosfatasa alcalina) puede ser bueno, ya que se induce cuando se produce
limitacin de fosfatos, al final del crecimiento. Los rendimientos mejoran cuando al
mismo tiempo se muta la protena sensora de fosfato PhoS (PtsS), con lo que se logra la
induccin del promotor a una mayor concentracin de fosfato, y prolonga el periodo de
produccin. Por lo tanto, se puede adaptar a un fermentador con alimentacin continua
de fosfato sin que se reprima el promotor de phoA.

1.2

Protenas de fusin

Cuando uno intenta expresar genes en huspedes heterlogos es frecuente encontrarse

con el hecho de que la protena buscada se degrade, con lo que se obtienen bajos
niveles tiles. Para solventar este problema, uno de los trucos consiste en lograr
protenas hbridas, de fusin, en las que nuestra protena heterloga (o la parte funcional
que nos interesa) est unida covalentemente con una protena estable del propio
husped, lo que la protege del ataque de proteasas de ste.
Para conseguir estas protenas de fusin, hay que hacer una construccin gentica en la
que unimos, en la adecuada fase de lectura, un gen del husped con el gen que
queremos expresar. Veamos brevemente los elementos importantes de un vector
especializado para obtener protenas de fusin en E. coli que queden expuestas al
exterior desde la membrana externa:
Porcin terminal 5 del gen ompF que codifica una protena de membrana externa. Este
segmento suministra las seales de comienzo de la transcripcin y de la traduccin,
as como las seales para que la protena viaje hasta la membrana externa.
Inmediantamente despus, una versin truncada del gen lacZ, desprovista no solo del
promotor, sino carente de los codones correspondientes a los ocho primeros
aminocidos. A pesar de ello, se podra sintetizar b-galactosidasa funcional en el caso
de estar en fase la secuencia que acabamos de describir. Otra caracterstica de
este lacZ es que su protena es capaz de funcionar incluso cuando va fusionada en su
extremo amino-terminal con otra protena.
La situacin relativa entre el extremo 5 del ompF y el gen modificado de lacZ en el
vector original es tal que este ltimo no est en fase correcta. Por lo tanto, el vector no
codifica b-galactosidasa.
Ahora bien, si clonamos un gen entre ompF y lacZ de modo que todos queden en fase,
se producir una protena tri-hbrida consistente en el extremo de OmpF fusionado
con nuestra protena, que a su vez va fusionada con la b-galactosidasa. Los clones
recombinantes que sinteticen esta protena tri-hbrida se pueden identificar fcilmente
porque tienen actividad b-galactosidasa, detectable como colonias azules en placas
provistas de galactsido artificial cromognico X-gal.
La protena tri-hbrida se puede usar para dos fines:
Como antgeno para producir anticuerpos frente a la porcin proteica que hemos
expresado con el gen clonado
Como medio para aislar pequeas porciones importantes de nuestra protena.

El elemento Flag se compra a una empresa en forma del vector, previsto para
su uso en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Este elemento determina un
pptido de ocho aminocidos, cuya secuencia es Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-AspLys. Imaginemos que queremos expresar en levadura el gen de la interleucina
2 (IL-2), una citoquina de gran valor teraputico. Pues bien, insertamos dicho
gen a continuacin del elemento gentico de Flag. La levadura recombinante
produce y secreta la protena hbrida, que no se degrada. Por otro lado, el
pptido Flag nos va a facilitar la tarea de purificar en un solo paso nuestra
protena de inters, por cromatografa de afinidad:
Se prepara una columna cromatogrfica a base de un soporte sinttico (como
polipropileno) al que se une anticuerpo monoclonal especfico frente al pptido Flag
Se hace pasar el extracto o sobrenadante de la cepa recombinante por la columna. La
protena hbrida que nos interesa queda retenida (al engarzarse con el anticuerpo),
mientras que las restantes pasan de largo.
Para eluir la protena recombinante, se lava la columna con un tampn bajo en calcio.
Aunque la IL-2 recombinante provista de los 8 aminocidos de Flag en su extremo Nterminal es funcional, las autoridades sanitarias obligan a eliminar ese pptido, cosa
que se hace tratando el hbrido con una proteasa especfica (enteroquinasa intestinal
bovina).
Esto ltimo nos ilustra el principio de que para satisfacer los estndares de seguridad y
calidad, las protenas recombinantes logradas como hbridos deben ser despojadas de
las porciones del elemento de fusin. Por ello, los elementos de fusin suelen ser
secuencias reconocidas por proteasas especficas que cortan en la juntura entre dicho
elemento y la protena de inters, sin atacar a esta.

1.3

Manipulacin de factores que afectan a la traduccin

Como se sabe, no todos los ARNm se traducen con la misma eficiencia. Uno de los
factores que condicionan esta eficacia diferencial es la presencia, al comienzo del ARNm,
de una secuencia (de 6 a 8 bases) que se puede emparejar con otra secuencia
complementaria situada en el extremo 3 del ARNr 16S. As pues, el ARNm, para que sea
traducido bien debe contar con este sitio de unin al ribosoma (RBS en siglas inglesas,
tambin conocido como secuencia de Shine-Dalgarno), que suele consistir en 5UAAGGAGG-3. Por esta razn, muchos vectores de expresin en E. coli se han diseado
para dotar al gen clonado de una secuencia de este tipo, con objeto de que su ARNm se
traduzca eficientemente. Aparte de esto, hay que tener presente otras consideraciones:
Debe existir una cierta distancia (en torno a 8 bases) entre la secuencia de ShineDalgarno y el codn AUG que seala el comienzo de la traduccin
El segmento inicial del ADN que contiene la secuencia de Shine-Dalgarno y los
primeros codones del gen clonado debe ser tal que, una vez transcrito, el ARN no
forme emparejamientos intracatenarios. Es decir, a nivel de ARN ese segmento debe
de carecer de la capacidad de formar estructuras secundarias en horquillas, que
dificultan el acceso de los ribosomas.
Otro factor que puede condicionar la eficiencia de traduccin deriva del hecho de que
nuestro gen de eleccin tenga un sesgo de codones diferente al del organismo
husped, es decir, tenga abundantes codones para los que el anfitrin no disponga de
suficiente nivel de los correspondientes ARNt. (Por ejemplo, de los cuatro codones para

Gly, el GGA se usa poco en E. coli, pero mucho en humanos; por lo tanto, si queremos
expresar un gen humano con abundantes codones GGA en esta bacteria, nos podemos
encontrar que la traduccin es poco eficiente, debido a la escasez de ARNt que
reconozca este triplete). Cuando se nos presenta un problema de este tipo de sesgo de
uso de codones, lo nico que podemos hacer (aunque suele ser complicado) es sintetizar
en laboratorio una versin sinnima de nuestro gen en la que los codones estn
optimizados al uso del husped.

1.4

Mejora de la estabilidad de la protena

Cada protena tiene una vida media tpica, que puede ser de unos pocos minutos o de
varias horas. A tal estabilidad colabora la presencia de puentes disulfuro y de ciertos
aminocidos en el extremo N-terminal. A menudo la simple modificacin que aade un
determinado aminocido a ese extremo de una protena a expresar es suficiente para
conferirle una mayor estabilidad. Por supuesto, las protenas de gran vida media se
acumulan en la clula, y por lo tanto aumentan los rendimientos del producto
recuperado.

1.5

Resolucin de los problemas de los vectores multicopia

Muchos vectores derivan de plsmidos de control relajado: los derivados de ColE1 tienen
de 15 a 60 copias. La serie pUC llega a presentar varios cientos de copias por clula. Los
derivados p15A estn en unas 15 copias. En ausencia de presin selectiva se pierden
(10-5-10-6 por generacin) como resultado de multimerizacin. Pero cuando se clonan
genes cuyos productos son txicos u originan una gran carga metablica, o cuando las
clulas se cultivan en continuo a altas densidades, las prdidas son mucho mayores. El
uso de antibiticos para mantener la presin selectiva presenta desventajas, entre ellas
la contaminacin del producto o la biomasa con el antibitico. Se han diseado
alternativas a esto, entre ellas el uso de plsmidos que ocasionan la muerte celular al
perderese. Pero tienen el inconveniente de que introducen restricciones en el diseo de
los medios de cultivo e introducen carga metablica adicional. Para saltar estas
desventajas, se ha diseado el siguiente sistema:
Cepa husped con un gen cromosmico condicionalmente esencial bajo el control del
promotor-operador de lac
Un plsmido acompaante multicopia que lleva el operador de lac
La titulacin (secuestro mayoritario) del represor LacI por los numerosos operadores
de lac origina la expresin del gen cromosmico (de resistencia a kanamicina) y el
crecimiento selectivo de clulas portadoras del plsmido en medio con el antibitico.
En muchos casos es deseable y ms rentable una produccin no demasiado alto, aunque
estable. Para elo se puede intentar recurrir a vectores con menos copias o a integracin
cromosmica.

1.5.1

Plsmidos de mediano nmero de copias

Los plsmidos de medio nmero de copias tienen entre 5 y 20 por clula. Se han
construido vectores a partir de varios plsmidos naturales:
RK2 (del grupo IncP). De amplio espectro, son de control estricto, autotransmisibles y
presentan entre 10-15 copias por cromosoma. Los miniplsmidos derivados de RK2 se
han mostrado estables durante 200 generaciones en algunos pseudomonas en
ausencia de presin selectiva, pero pueden ser mucho menos estables en otras
bacterias.

RSF1010 (grupo IncQ). De amplio espectro, autotransmisibles, presentan unas 20

copias por clula.

1.5.2

Plsmidos de bajo nmero de copias

Tienen entre 1-5 copias por clula. Se ha construido un vector derivado de F, que
presenta las siguientes caractersticas:
9 kb de F con elementos necesarios para la replicacin y la estabilidad segregacional:
Los orgenes oriV, oriS aseguran replicacin especfica del ciclo celular,
el locus de reparto permite ese reparto equitativo a clulas hijas,
el gen repD recombina los dmeros hasta monmeros
los genes ccd matan cualquier segregante que pierda el plsmido.
Mdulo de clonacin para la expresin:
Promotor de araBAD y gen araC para una expresin inducible por arabinosa
Sitio de clonacin mltiple
Terminadores de transcripcin
Este plsmido es estable en ausencia de presin selectiva, tiene una expresin gnica
bien controlada e impone una pequea carga metablica.

1.5.3

Integracin cromosmica

A menudo es mejor intentar expresar el gen a clonar desde una localizacin estable en el
cromosoma del husped, evitando que se replique por medio de plsmidos. Una vez
insertado en el cromosoma, el gen puede quedar all de forma estable durante
muchsimas generaciones sin necesidad de recurrir a presin selectiva.
La integracin debe lograrse en un sitio del cromosoma que no sea esencial. Para que
nuestro gen se integre en determinado sitio del husped, debemos hacer una
construccin gentica en la que el gen vaya unido a secuencias homlogas del husped,
con objeto de favorecer la recombinacin. Veamos un resumen de mtodo para clonar
genes por integracin en cromosoma:

1. Hay que identificar un sitio adecuado para la integracin (o sea, un lugar

que sepamos que al romperlo no vamos a afectar las funciones celulares
normales).
2. Aislamos y clonamos todo o parte de ese sitio cromosmico.
3. Asociamos nuestro gen favorito (provisto de un promotor regulable) al
sitio clonado para la integracin. Esto lo podemos hacer de dos modos:
a. Nuestro gen lo hemos insertado dentro del sitio de integracin
clonado, por lo que tendremos un sandwich de dos trozos del sitio
de integracin enmarcando a nuestro gen
b. Insertamos nuestro gen de modo adyacente al ADN clonado de
integracin
4. Transferimos nuestra construccin gentica a las clulas huspedes. Para
ello la construccin gentica va formando parte de un plsmido que no
puede replicarse en el husped (vector suicida).

5. Se aplica la presin selectiva que permita recuperar y multiplicar los

transformantes buscados. Obviamente, con estas condiciones, la
propagacin del gen clonado slo tiene lugar si se ha integrado en el ADN
cromosmico de las clulas.
Si hemos hecho la transformacin usando un plsmido que lleva el gen interrumpiendo
el sitio de integracin clonado [caso a) de la fase 3) citada arriba], los dos segmentos
separados de ADN del sitio de integracin suministran sendos lugares de homologa
respecto del cromosoma, con lo que se puede producir un doble sobrecruzamiento que
lleva a la integracin de nuestro gen.
Si hemos transformado con el plsmido en el que nuestro gen est adyacente al ADN
clonado del sitio de integracin (caso b), un simple sobrecruzamiento entre este y la
regin homloga del cromosoma conduce a la integracin de todo el plsmido,
incluyendo nuestro gen de inters.
Otra manera de lograr inserciones en lugares cromosmicos predeterminados es
mediante un sistema en dos pasos que se ha ensayado con xito en Bacillus subtilis:

1. insertamos un gen marcador de resistencia a antibiticos en un lugar no

esencial del cromosoma (empleando la lgica que hemos descrito ms
arriba, en la que el gen interrumpe secuencias del husped previamente
clonadas), seleccionando transformantes resistentes a ese antibitico.
2. ahora transformamos con un segundo plsmido suicida en el que
tenemos a nuestro gen interrumpiendo las mismas secuencias clonadas
del husped usadas en la fase 1). Un doble entrecruzamiento entre
dichas secuencias y las homlogas del husped nos elimina el gen
marcador mientras que nos inserta nuestro gen.
Si repetimos la anterior, pero usando en cada caso secuencias clonadas diferentes del
hospedador, lo que obtenemos es una cepa que lleva varias copias de nuestro gen
insertadas en diferentes lugares del cromosoma.

1.6

Carga metablica

Ya antes hemos aludido a los efectos negativos de carga metablica que suele acarrear
la introduccin y expresin de ADN forneo en el organismo husped. Esto se puede
deber a una variedad de factores:
Gran nmero de copias o gran tamao del vector
Limitacin de oxgeno disuelto en el medio
La gran produccin de la protena fornea puede agotar las reservas de ciertos
aminoacil-ARNt (e incluso de ciertos aminocidos) y drenar a la clula de su energa
Si la protena del gen clonado se expresa a alto nivel y se exporta desde el citoplasma
hasta la membrana o el periplasma, puede producir atascos en los sitios de
exportacin, con lo que dificulta la localizacin correcta de protenas del husped.
Las propias protenas forneas pueden tener efectos negativos interfiriendo con el
husped, generando efectos txicos, etc.
Con un buen diseo experimental, se pueden disminuir los efectos de la carga
metablica, mejorando los rendimientos de protena recombinante y mejorando la
estabilidad de las clulas transformadas. Por ejemplo:

Muchas veces es mejor usar un vector de bajo nmero de copias, e incluso no emplear
plsmidos, sino sistemas de integracin cromosmica de nuestro gen (vase la seccin
que dedicamos a esta cuestin)
Usar promotores fuertes pero regulables, de modo que durante la mayor parte del
crecimiento tengamos a nuestro gen desconectado, pero que lo induzcamos o
desreprimamos al llegar el cultivo a cierta densidad celular
Siempre que sea posible, adaptar los codones de nuestro gen al sesgo peculiar de uso
de codones de nuestro husped. Ello puede suponer tener que construir un gen
sinttico que sea sinnimo del original, pero adaptado al husped.
Para evitar los problemas de falta de disposicin de oxgeno, se ha diseado un sistema
en el que se expresa la hemoglobina de Vitreoscilla en E. coli, lo que incrementa la
concentracin de ribosomas y ARNt al final de una fermentacin de 30 horas.
Al final de cuentas, y de cara a la produccin industrial, es mejor el rendimiento que se
logra con un husped que produce un modesto 5% de protena fornea pero que puede
alcanzar densidades en el fermentador de 40 g de peso seco por litro, que el que se
lograra con un 15% de eficiencia en protena fornea pero con una densidad de solo 10
g de peso seco de biomasa por litro.

2.
2.1

Ingeniera gentica de levaduras

Aspectos generales

La clonacin en bacterias ha permitido obtener a escala industrial algunas protenas

recombinantes, especialmente de inters teraputico. Sin embargo, no siempre las
protenas de origen eucaritico se producen adecuadamente en huspedes procariticos,
ya que a menudo son inestables o carecen de actividad biolgica. Por otro lado las
protenas recombinantes obtenidas en bacterias, a pesar de haber sido cuidadosamente
purificadas, pueden venir acompaadas de pequeas cantidades de sustancias
bacterianas contaminantes, que pueden tener efectos pirognicos (induccin de fiebre).
Por todas estas razones, la ingeniera gentica ha desarrollado otros sistemas,
principalmente eucariticos, que salven al menos algunos de estos obstculos. En este
sentido, las levaduras presentan una serie de ventajas:
Son eucariotas, y por lo tanto ms semejantes a las clulas de los organismos
superiores que los procariotas (por ejemplo, sus mecanismos de secrecin)
A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de modificaciones postraduccionales
en las protenas (glucosilaciones en ciertos aminocidos, eliminacin de la metionina
inicial, rotura proteoltica de un precursor inactivo, etc.), lo que puede hacer que las
protenas heterlogas de organismos superiores puedan alcanzar su actividad biolgica
(aunque esto no siempre est garantizado)
A semejanza de ciertas bacterias, la levadura Saccharomyces cerevisiae es muy fcil
de manejar con mtodos microbiolgicos
S. cerevisiae est muy bien estudiada al nivel gentico y molecular. No slo se puede
realizar gentica clsica (mutagnesis y recombinacin meitica, alternancia de ciclo
haploide y diploide), sino que cuenta con herramientas avanzadas de ingeniera
gentica, y su genoma se secuenci totalmente en 1996
Desde hace decenios, las levaduras se cultivan a escala industrial, y participan en
multitud de procesos biotecnolgicos. Adems, cuenta con la calificacin oficial de
organismo reconocido como seguro (GRAS), indispensable para poder usarlo en

obtencin de sustancias para consumo humano

Por todo ello, las levaduras son los huspedes eucariticos de clonacin ms fciles de
usar, y una buena alternativa para intentar la produccin industrial de protenas de
inters. (Sin embargo, debido a que las levaduras poseen un sistema
de splicing diferente y menos efectivo que el de eucariotas superiores, si queremos
expresar estos genes, hay que recurrir no a la versin genmica, sino al ADNc tras
retrocopia del correspondiente ARNm maduro).
Existen varios mtodos artificiales para introducir ADN exgeno en levaduras:
Obteniendo protoplastos en medio hipertnico y mezclndolos con el ADN en presencia
de una sustancia fusognica como el polietilenglicol (PEG)
Tratando clulas completas con sales de litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con
choque trmico para estimular la transformacin
Por electroporacin: el ADN entra en las clulas tratadas con cortos pulsos de corriente
elctrica.
Igualmente existe multitud de tipos diferentes de vectores, cada uno con una serie de
caractersticas apropiadas para fines concretos. En general, los vectores de levadura,
aparte de secuencias de levadura, contienen tambin secuencias de vectores
bacterianos, previstas para su amplificacin y manejo sobre todo en E. coli. Por esta
razn se suelen calificar como vectores bifuncionales o lanzadera (porque permiten
pasar del husped bacteriano a la levadura, y viceversa). Daremos solo una breve lista
de las principales clases de vectores y sus rasgos ms notables:
Vectores integrativos (YIp): suelen contener un gen silvestre de levadura, lo que
permite que el vector se inserte, por recombinacin homloga, con secuencias
homlogas de la levadura husped. No se suelen emplear para la expresin de genes
heterlogos
Vectores de replicacin autnoma basada en componentes cromosmicos (YRp)
Vectores con secuencias de replicacin autnoma (ARS): suelen ser vectores
inestables, por lo que no tienen inters industrial
Vectores YCp con ARS y secuencias centromricas (CEN): al disponer de secuencias
de centrmeros de levadura, se segregan mejor a las clulas hijas, por lo que son
ms estables, aunque se siguen perdiendo poco a poco, por lo que tampoco son
demasiado tiles para la expresin a escala industrial
Cromosomas artificiales de levadura (YAC): son vectores que cuentan con una
secuencia ARS, una secuencia CEN y dos secuencias telomricas (TEL). Estn previstos
para insertar grandes trozos de ADN (de ms de 100 kb). No se usan como vectores de
expresin, sino como vectores de gran capacidad a la hora de generar genotecas de
organismos complejos y preparar la secuenciacin (por ejemplo, los llamados
megaYACs han sido muy tiles en el Proyecto Genoma Humano).
Vectores basados en el crculo de 2mm de levadura: se trata de vectores que se
aprovechan de un plsmido natural de S. cerevisiae, conocido simplemente como
crculo de 2mm (por su tamao). Es un plsmido crptico (no codifica funciones
fenotpicas aparte de su propia replicacin) existente en algunas cepas (cepas cir +)
que se encuentra en unas 50 a 100 copias en el ncleo, constituyendo una especie de
minicromosoma estable. Los vectores incorporan algunas de las secuencias del 2mm
implicadas en su replicacin y mantenimiento.

La manipulacin gentica de S. cerevisiae ha permitido obtener molculas y procesos de

gran inters comercial, sobre todo en el mbito clnico.

2.2
2.2.1

Sistemas de expresin en Saccharomyces cerevisiae

Expresin directa (sin secrecin)

Veamos un ejemplo que ilustre algunos aspectos de cmo lograr expresin directa (sin
excrecin al medio) de un gen heterlogo eucaritico, el ADNc de la superxido
dismutasa humana citoplsmica que requiere cobre y zinc (Cu/Zn-SOD). Se fabric un
plsmido lanzadera con las siguientes caractersticas:
Secuencias para manejo en E. coli: un gen de resistencia a ampicilina (ApR) y un origen
de replicacin derivado de pBR322
Un gen para seleccionar transformantes en levadura: el gen LEU2, de modo que
cuando el plsmido entra en una determinada cepa auxotrofa leu2-, la convierte en
prototrofa (crece en medio mnimo carente de leucina)
Secuencias derivadas del crculo de 2mm, para la replicacin del plsmido en S.
cerevisiae
El ADNc de nuestro gen (el de la Cu/Zn-SOD), emparedado entre secuencias para el
comienzo y el trmino de la transcripcin en levadura. En esta ocasin se escogieron
secuencias sealizadoras procedentes del gen GAPD (gliceraldehido-fosfato
deshidrogenasa) de la propia levadura. Hay que tener en cuenta que los promotores
de levadura son diferentes a los procariticos, e incluyen secuencias activadoras a
cierta distancia de la porcin codificadora. Estas secuencias, llamadas a menudo UAS
(upstream activating sequences) se parecen funcionalmente a los potenciadores o
intensificadores (enhancers) de los eucariotas superiores.
Cuando se transform una levadura leu2- con este plsmido, se aislaron transformantes
prototrofos en medio mnimo. Como el promotor del gen GAPD es constitutivo, la
protena humana de Cu/Zn-SOD se expresaba continuamente, a grandes niveles.
Adems, la levadura haba realizado una modificacin similar a las de la protena nativa
de humanos, la acetilacin en el grupo amino de la alanina N-terminal.
La mayora de vectores de expresin actuales recurre, sin embargo, a promotores de
genes inducibles, como los de la respuesta al choque trmico, o el GAL1 y el GAL10 que
se inducen 1000 veces en presencia de galactosa.

2.2.2

Expresin y secrecin

Si la protena que queremos expresar debe ir glucosilada, el gen debe clonarse de modo
que el producto se secrete, ya que en levaduras solamente las protenas secretadas son
modificadas de esta manera. Para ello, debemos unir al lado 5 de nuestro gen las
secuencias responsables del procesamiento y secrecin del factor a de la levadura (el
factor a es una especie de feromona para el cruce entre clulas haploides de sexos
opuestos). De este modo, la protena de fusin es reconocida por el sistema de
transporte y secrecin de S. cerevisiae, de modo que se corta el pptido seal del
precursor del factor a (llamado pre-pro-a), y se excreta la protena recombinante al
medio. Este fue el sistema que permiti expresar y secretar en levadura la hirudina,
protena anticoagulante de inters clnico procedente de la sanguijuela Hirudo
medicinalis.

2.3

Sistemas de expresin en otras levaduras

Aunque, como hemos visto, ha habido xitos en la expresin de protenas

en Saccharomyces cerevisiae, existe una serie de problemas a la hora de lograrlo a
escala industrial:
En los grandes volmenes del fermentador, existe una gran frecuencia de prdida de
los plsmidos, incluso cuando usamos promotores inducibles que solo se activan al
final
La protena heterloga excretada suele tener un patrn de glucosilacin diferente al de
la original. Concretamente, existen oligosacridos a base de ms de 100 manosas,
mientras que las protenas naturales no suelen pasar de las 10 manosa por cada
aminocido modificado.
A veces, la protena, en vez de secretarse, se queda en el espacio periplsmico.
Por todo ello, se ha intentado desarrollar sistemas de expresin en otras levaduras,
como Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris y Hansenula polimorpha.
P. pastoris se ha usado desde 1984 para producir unas 300 protenas recombinantes. Es
una levadura metilotrfica ascomictica que se us durante un tiempo para producir
protena unicelular para piensos, en un proceso desarrollado por la empresa Phillips
Petroleum. En los aos 80, esta empresa transfiri a otra empresa californiana (SIBIA) su
sistema de expresin gentica, sistema que est disponible comercialmente para
investigacin a travs de la compaa Invitrogen.
Las ventajas de este sistema son las siguientes:
Ventajas derivadas de las caractersticas metablicas de esta levadura:
Gran preferencia por el metabolismo respiratorio, lo que permite cultivos ms densos
que otras levaduras
Modificaciones postraduccionales mejores que los de S. cerevisiae: procesamiento
proteoltico, glucosilacin y formacin de puentes disulfuro
Altos rendimientos de protena, normalmente superiores a los sistemas de baculovirus
y de clulas de mamfero
Muy altos niveles de secrecin de protena heterloga, con apenas secrecin de
protena nativa
Sistema fcilmente escalable a escala industrial
Sistema ms barato y ms rpido que los de eucariotas superiores
El sistema original de expresin en P. pastoris est basado en el promotor de uno de los
genes de la alcohol-oxidasa. La alcohol-oxidasa cataliza la primera reaccin de la ruta de
degradacin del metanol, al oxidarlo hasta formaldehido y perxido de hidrgeno. La
reaccin tiene lugar en el peroxima, orgnulo que secuestran el perxido del resto de la
clula. La alcohol-oxidasa tiene poca afinidad por el metanol, pero esto lo compensa esta
levadura sintetizando grandes cantidades de la enzima, determinada por dos
genes, AOX1, AOX2. El producto del primero representa ms del 90% de la actividad
total. El promotor de AOX1 est fuertemente regulado e inducido por metanol, pero est
reprimido en otras condiciones, como hambre de carbono. La protena representa hasta
el 5% del total de protena soluble durante la induccin con metanol. Por lo tanto, el
promotor era un buen candidato para la expresin controlada de genes heterlogos: es
posible cultivar la levadura recombinante durante la mayor parte del tiempo en una
fuente de carbono no inductora como la glucosa o el glicerol; cuando se alcanza una
densidad buena, se aade metanol para la induccin de la expresin del gen clonado.

Este sistema, disponible comercialmente y de fcil uso, ha permitido expresar ms de

400 tipos de protenas, desde endostatina humana hasta protena de tela de araa.
Veamos un ejemplo concreto: la produccin de antgeno de superficie del virus de la
hepatitis B:
Se clon el gen del antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) entre las
seales de inicio y trmino de transcripcin del gen AOX1 de P. pastoris.
Se dise un plsmido lanzadera previsto para la integracin cromosmica de la
construccin gentica, y cuya porcin de levadura consista (en este orden):
Mdulo de expresin promotor de AOX1-gen HBsAg-terminador de AOX1
Gen marcador HIS4 (para seleccionar transformantes en el auxotrofo his4- )
Secuencias del gen AOX1 correspondientes a la porcin no codificante distal (en 3)
Con este plsmido se transform una cepa auxotrofa his4- . El diseo del vector es tal
que, al carecer de secuencias de mantenimiento en la levadura, la nica manera de que
se originen los transformantes es por recombinacin. Un doble entrecruzamiento por
recombinacin homloga en el que, por un extremo participen las secuencias de
promotor, y por el otro las secuencias en 3 del gen AOX1 significa la integracin del
mdulo levadura del plsmido, incluyendo el gen silvestre HIS4 y la construccin de
expresin con el gen de HBsAg, pero con ello interrumpimos el gen AOX1 silvestre. La
seleccin de este evento se hace en:
medio mnimo sin histidina, para seleccionar la integracin del gen HIS4
con metanol: las colonias que han integrado el mdulo y que inactivan el
gen AOX1 endgeno crecen lentamente en metanol (porque tienen otro el otro gen,
menos efectivo,AOX2)
Estos transformantes, cuando se crecen en metanol, sintetizan grandes cantidades del
antgeno del virus de la hepatitis B, que se queda en el citoplasma. Un clon
transformante lleg a producir el equivalente a casi 10 millones de dosis de vacuna
cuando se cultiv en un recipiente de 240 litros. Adems, la construccin gentica era
estable durante al menos varios das de cultivo.
A pesar de lo anterior, este sistema de expresin presenta ciertas limitaciones, algunas
de las cuales se estn resolviendo en los ltimos aos:

1. El metanol que se necesita para la induccin supone cierto riesgo de

fuego y puede no ser adecuado para producir protenas alimentarias. Por
lo tanto, se necesitan promotores fuertes que no necesiten metanol para
su induccin. Ya se cuenta con algunos:
a. Promotor del gen de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa
(GAP). Suministra un alto nivel constitutivo de expresin en glucosa
o glicerol. El inconveniente es que al ser constitutivo, puede no ser
adecuado para expresar protenas que supongan efectos negativos
para el hospedador.
b. Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codificador de una glutatindeshidrogensasa dependiente de formaldehido. Se puede inducir por
metanol o por metilamina (una fuente inocua de N) en medios con

glucosa. Los niveles inducidos de expresin con este promotor son

parecidos a los del gen AOX1 en metanol.
2. Se necesitan promotores de expresin moderada. Algunos ejemplos:
a. Del gen PEX8, que codifica una protena de biognesis del
peroxisoma. Suministra expresin a bajo nivel sobre glucosa, y se
induce moderadamente (unas 10 veces) cuando las clulas se pasan
a metanol.
b. Del gen YPT1: confiere expresin baja pero constitutiva en glucosa,
metanol o manitol
2 Otra limitacin era la carencia de ms genes marcadores para seleccionar
los recombinantes. Hasta hace poco, solo se dispona de HIS4, ARG4 y Sh
ble (resistencia al antibitico zeocina). Ahora contamos con otros
marcadores: ADE1, URA3.
Otros sistemas de expresin en otras levaduras:
Levaduras metilotrficas:
Candida boidinii
Hansenula polymorpha
Pichia methanolica
Levaduras que usan lactosa: Kluyveromyces lactis
Levaduras usadoras de alcanos y de cidos grasos: Yarrowia lipolytica

3.

Sistemas de expresin de baculovirus

Los baculovirus son un tipo de virus que infectan artrpodos, especialmente insectos.
Durante su infeccin, las partculas virsicas se empaquetan en unos grupos llamados
cuerpos polidricos, que son cuerpos de inclusin localizados en el ncleo celular,
compuestos mayoritariamente de la protena poliedrina. La poliedrina se sintetiza en
grandes cantidades al final del ciclo infectivo, pudiendo llegar a suponer el 50% del total
proteico de la clula.
El genoma de los baculovirus consta de una molcula circular de ADN de c.d., de un
tamao de entre 88 y 200 kb. Aunque los poliedros se necesitan para la infeccin, no se
requieren para mantener el cultivo celular infectado. Por lo tanto, el gen de la poliedrina
es dispensable y puede hacerse hueco en esa parte del genoma para manipulacin
gentica. Como el genoma es demasiado grande para manupular directamente, se
recurre a lo siguiente:
El ADN heterlogo se inserta en un vector intermedio llamado de transferencia, sin
capacidad infectiva, que es un vector con secuencias de E. coli (para hacer las
manipulaciones fcilmente en la bacteria), y que lleva el eficiente promotor de la
poliedrina, tras el cual se inserta el gen de inters.
Se co-transfectan clulas de insecto con el vector que lleva el ADN clonado y con ADN
virsico no recombinante.
Tiene lugar la recombinacin in vivo entre el vector de transferencia y secuencias del
genoma virsico, con lo que se generan genomas recombinantes que se pueden

seleccionar y uar para producir la protena de inters.

Presentan las ventajas de que las protenas forneas se expresan a alto nivel,
experimentando modificaciones postraduccionales similares a las de mamferos. El coste
de produccin es superior al de levaduras, pero menor al de usar clulas de mamferos
Se ha logrado adaptar lneas celulares de insectos a algunos de los requerimientos
habituales de la produccin a gran escala, incluyendo la resistencia a la agitacin de
los fermentadores
Hoy da ya se pueden usar cultivos de clulas de insectos en biorreactores parecidos a
los empleados con los microorganismos
Se han hecho avances en diseo de medios de cultivo ms sencillos y baratos, que no
necesitan suero. Todo ello permite el escalado, esencial para la produccin de grandes
cantidades de protenas teraputicas recombinantes
Una de las aplicaciones ms importantes de los baculovirus derivados de cultivos de
clulas de insectos es su uso como insecticidas biolgicos selectivos y seguros, que se
emplean sobre todo en lucha biolgica e integrada frente a plagas que afectan a
bosques

4.

Ingeniera de protenas

La ingeniera de protenas es uno de los mbitos ms novedosos y prometedores de la

ingeniera gentica. Mediante este conjunto de tcnicas se alteran genes de modos
racionales para modificar la estructura de protenas. Una de las modalidades es realizar
mutagnesis in vitro sobre el ADN clonado, introduciendo mutaciones puntuales en sitios
predeterminados, deleciones, etc. Si estas tcnicas se unen al mayor conocimiento de la
estructura y funcin de las protenas, se puede uno dirigir a alterar aminocidos
concretos que afectan a propiedades fisicoqumicas o alostricas. Se puede, p. ej., lograr
modificar el estatus nutricional de las protenas, o aumentar su estabilidad ante
condiciones de pH, temperatura, etc.