Professional Documents
Culture Documents
(INFORME)
2004
INTRODUCCIN
Las bacterias son seres generalmente unicelulares que pertenecen al grupo de los
protistos inferiores. Son clulas de tamao variable cuyo lmite inferior est en las 0,2 y
el superior en las 50 ; sus dimensiones medias oscilan entre 0,5 y 1 . Las bacterias
tienen una estructura menos compleja que la de las clulas de los organismos superiores:
son clulas procariotas. Igualmente son muy diferentes a los virus, que no pueden
desarrollarse m s dentro de las clulas y que s lo contienen un cido nucleico.
Las bacterias juegan un papel fundamental en la naturaleza y en el hombre: la presencia
de una flora bacteriana normal es indispensable, aunque grmenes son patgenos.
Anlogamente tienen un papel importante en la industria y permiten desarrollar
importantes progresos en la investigaci n, concretamente en fisiolog a celular y en
gentica. Para hacer un estudio de estos microorganismos, se suele recurrir a tcnicas
especiales que van a permitir el acondicionamiento del material para dicho estudio. Los
colorantes y coloraciones se usan en estudios macro y microscpicos, por ejemplo: para
estudios de la actividad bioqumica de los microorganismos, clasificacin de los
microorganismos, etc.
Para efectuar una observacin del microorganismo, los mtodos de coloracin son
diversos y adems, constituyen un tem ms que posibilita realizar una clasificacin, es
decir, que hay tcnicas que permiten hacer un diagnstico informando cmo reacciona
una clula microbiana a ciertas manipulaciones fsicas y qumicas con los colorantes (ej:
mtodos de Gram-Nicole, cido-alcohol resistencia, etc.). El descubrimiento del
microscopio de contraste de fases y el uso del microscopio electrnico para exmenes de
microorganismos, han dejado de lado muchas de las tcnicas de coloracin. A pesar de
ello, los colorantes y las coloraciones se siguen usando en trabajo de diagnstico y de
investigacin por ser de un manipuleo sencillo y de fcil comprensin e interpretacin. A
continuacin realizaremos un estudio microbitico aplicando algunas tcnicas de
coloracin.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Preparar frotis a partir de cultivos bacterianos en diferentes medios, y realizar una
determinada tincin para la identificacin de la estructura, forma, disposicin, etc.,
de las bacterias.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Clasificar las bacterias en grampositivas y gramnegativas.
Identificar la importancia que tiene cada una de las coloraciones utilizadas en el
estudio de las bacterias.
Identificar las formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana
en una tincin.
1. TEORA RELACIONADA
Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos
(incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El trmino
microorganismo no tiene un significado taxonmico preciso sino que agrupa a todos los
organismos de dimensiones microscpicas (< 0.1 mm) aunque presenten grandes
diferencias entre si. As por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas
(hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambin difieren notablemente en el tamao aunque
sean todos microscpicos; en una escala comparativa tenemos:
Protozoarios > levaduras > bacterias > virus
Bacterias
Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales
presentan una de las tres formas generales siguientes:
- elipsoidal o esfrica
- cilndrica o en forma de bastn
- espiral o helicoidal.
Las bacterias esfricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta
forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin
celular. As tenemos:
* cocos en pares (diplococos)----------- Ej. Neisseria
* cocos en cadena ---------------------- Ej. Streptococcus
* cocos en racimo ---------------------- Ej. Staphylococcus
* cocos en ttradas -------------------- Ej. Pediococcus
* cocos en cubos ----------------------- Ej. Sarcina
* cocos sin distribucin especial
Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan
otros modelos de agrupacin. As tenemos:
* bastones en cadena -------------------------------- Ej. Bacillus
* bastones en letras chinas o empalizadas ------------ Ej. Corynebacterium
* bastones sin distribucin especial
Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales,
independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias
de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.
La observacin y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras
fundamentales:
observando los microorganismos vivos sin teir.
observando las clulas fijadas, teidas con colorantes.
Las bacterias vivas, en suspensin acuosa tienen propiedades pticas similares a las del
agua y, por lo tanto, son difciles de observar con el microscopio de campo claro debido a
la falta de contraste con el medio que las rodea.
Aunque las bacterias no difieren en sus propiedades pticas del medio externo, si son
muy diferentes desde el punto de vista qumico; esto es lo que permite distinguir las
bacterias por tincin, pues generalmente el colorante reacciona con la clula bacteriana
pero no lo hace con el medio.
La coloracin de las bacterias tiene como fines:
* aumentar el contraste de las clulas con el medio que las rodea. Esto implica mejorar la
visualizacin de las bacterias y permitir la distincin de formas y tamao.
* diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes.
* revelar la presencia de distintas estructuras internas.
Colorantes
Son compuestos qumicos que poseen un grupo cromforo que otorga color a la molcula
y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse
electrolticamente y por lo tanto, formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la
unin del colorante a otras sustancias con carga elctrica.
Los colorantes se clasifican como colorantes naturales y sintticos. Los colorantes
naturales son utilizados principalmente con fines histolgicos. La mayora de las tinciones
bacterianas son realizadas con colorantes sintticos, en su mayora anilinas, las cuales
derivan del benzeno.
Colorantes cidos, bsicos y neutros. Los colorantes ms usados son sales, las cuales
estn constituidas por un in cargado positivamente y un in cargado negativamente. Por
ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul de metileno.
a) Tincin bsica es aquella en que el color est dado por el ion cargado positivamente.
b) Tincin cida es aquella en que el color est dado por el ion cargado negativamente.
c) Tincin neutra es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos
colorantes cidos y bsicos.
Una reaccin de tincin se debera a una combinacin de reacciones fsicas y qumicas.
El pH del medio tiene gran influencia en la tincin ya que permite una mayor o menor
disociacin electroltica del grupo auxocromo, permitiendo de esta manera una mayor o
menor afinidad por los grupos qumicos sobre los cuales se une.
Si se aumenta el pH del medio existe una mayor afinidad del colorante por la bacteria,
sucediendo lo contrario si el pH se hace ms cido.
La fijacin de colorantes a la clula bacteriana se facilita con el uso de mordientes, con los
que forman compuestos insolubles (yodo, fenol, cido tnico, oxalato de amonio, etc.).
Algunos de los colorantes ms empleados en microbiologa son: azul de metileno, violeta
de genciana, fucsina bsica, safranina, verde de malaquita, etc.
Tinciones
Las tinciones pueden clasificarse en: tinciones simples, diferenciales y especiales.
a) Tinciones simples. Son aquellas en que se utiliza un solo colorante. Las bacterias se
tien en forma homognea de la misma coloracin.
La utilidad de esta tincin es relativa, ya que slo es factible observar forma y agrupacin
celular.
b) Tinciones diferenciales. Permiten establecer diferencias tintoriales entre grupos de
bacterias, debido a ello son las ms utilizadas en la identificacin de bacterias. Estas
tinciones se basan en la aplicacin de dos colorantes en etapas sucesivas entre las que
se aplican mordientes y compuestos qumicos decolorantes; de esta forma las bacterias
de diferente afinidad tintorial se observan teidas de distinto color.
c) Tinciones especiales. Permiten poner de manifiesto alguna estructura especial de la
clula bacteriana, ej.: material nuclear, membrana citoplasmtica, flagelos, cpsulas,
esporas, etc.
d) tinciones negativas: Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno,
aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del
colorante (nigrosina)
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas:
extensin, fijacin, tratamiento con colorantes y observacin.
2. FLUJOGRAM AS
Frotis.
A partir de un cultivo en medio lquido.
Esterilizar asa redonda
Tomar una gota del cultivo lquido
Colocarla en el portaobjetos
Extender la gota uniformemente
Secar al aire
Fijar por calor
Dejar enfriar
Teir
A partir de un cultivo en medio slido.
con el bajalengua
con el escobilln
Frotar y hacer
presin
sobre la zona
Secar al aire
Fijar con calor
Colorear
Coloraciones o tinciones.
Coloracin con azul de metileno.
Realizar frotis de secrecin faringea
Fijar con calor
Cubrir la lamina con azul de metileno
Lavar
por 2 min.
Secar al aire
Observar al microscopio
Reportar la morfologa y
disposicin de las bacterias
Coloracin de Gram.
Muestra
Secar al aire
Fijar con calor
Cubrir el portaobjeto con cristal de violeta
1 min.
Lavar
Adicionar lugol
1 min.
Lavar
1 min.
30 seg.
Secar
Observar al microscopio
Reportar la morfologa y
disposicin de las bacterias
muestra de tierra
Secar al aire
Fijar con calor
Cubrir portaobjetos con fucsina bsica
Calentar
10 min.
Enfriar
Lavar
2min
con agua destilada
Secar
Observar al microscopio
Reportar la morfologa y
disposicin de las bacterias
Realizar frotis
Secar
Fijar con calor
Cubrir portaobjeto con verde de malequita
Calentar
30seg
Enfriar
Lavar
Adicionar safranina al 5%
Lavar
Secar
Observar al microscopio
Reportar lo observado
Coloracin de Hiss (cpsula)
Realizar frotis
cultivo de
Klebsiella
pneumonie de
36-48h.
Secar
Cubrir portaobjetos
Lavar
Secar
Observar al microscopio
Reportar lo observado
3. RESULTADOS
Los microorganismos adquirieron un color azul, por su forma los podemos clasificar en
staphilococos, streptococos y cocobacilos.(ver anexo 1)
Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales,
puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.
Coloracin de Gram
Los microorganismos adquirieron un color rojo lo que indica que son gramnegativos, estos
adquieren esta coloracin debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy
diferente a la de los microorganismos Gram positivos, que adquieren un color violeta.
En cuanto a la forma, se puede decir que eran Staphilococos.(ver anexo 2)
En todas las tinciones ordinarias se sabe que la pared celular no se tie, sino solo el
protoplasma fuertemente reducido por el proceso de fijacin.
Nota: Al realizar la tincin de Gram, se debe tener la precaucin de no utilizar cultivos
bacterianos muy viejos, ya que los resultados obtenidos pueden inducir a error; as en
cultivos bacterianos relativamente viejos de bacterias Gram(+), algunas se observan como
Gram(-), ello se debe a la acidificacin paulatina del cultivo, disminuyendo la afinidad
tintorial.
5. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
Fundamento qumico celular de la coloracin de Gram
Tincin de Gram. Se considera hasta el momento como la tincin bacterias ms
importante. Permite una primera clasificacin de las bacterias en gram-positivas, teidas
en azul-violeta, y gram-negativas, organismos rojos. Se encuentra en el principio de toda
investigacin bacteriolgica puesto que de su resultado depende la marcha ulterior para el
aislamiento e identificacin del germen.
El mecanismo de la tincin de gram aun no se entiende del todo. Se supone que se basa
en una diferencia de permeabilidad entre las paredes celulares de los organismos
grampositivos y gramnegativos: el yodo forma con el cristal violeta un barniz que se une al
protoplasto. Este barniz no es soluble en agua, pero si lo es en alcohol-acetona. En la
decoloracin la pared celular de las bacterias grampositivas no permite la salida del
colorante, mientras que esto es lo que sucede en las gramnegativas. Los grmenes
gramnegativos quedan sin teir despus del lavar con alcohol y se tien de rojo con el
colorante de contraste, fucsina, mientras los grampositivos mantienen el color violeta.
Se ha deducido que la pared celular desempea un papel importante para la tincin de
gram por las siguientes observaciones: si se tratan clulas grampositivas con lisocima
estas se transforman en protoplastos. Los protoplastos se tien con el violeta de
genciana, pero pierden el color al lavar con alcohol, puesto que no ha y pared celular que
lo impida. De este modo los grmenes grampositivos cuya estructura de pared celular ha
llegado a desintegrar se hacen gramnegativos; finalmente es de importancia para el
diagnstico saber que los clostridios grampositivos que tienden a la autolisis, es decir a la
alteracin de la pared celular, se vuelven gramnegativos en los cultivos viejos.
Cul es la finalidad de fijar con calor los frotis bacterianos?
Cualquier tincin precisa una fijacin previa de la preparacin que en la m ayoria de los
casos se hace en la llama. Con la fijacin se pretende adherir fuertemente la preparacin
al portaobjetos, matar al germen, conservar las estructuras visibles de la clula y mejorar
su capacidad de tincin.
Importancia del lugol en la tcnica de Gram
El lugol es importante debido a que se utiliza como mordiente, para fijar el colorante sobre
el sustrato. Este refuerza la accin de un colorante.
Qu son los colorantes cidos y bsicos?Cmo actan?
COLORANTES BSICOS
Son sales, que estn en relacin con el componente bsico de su molcula. Su grupo
aminado forma una sal con un cido, el cual es soluble en agua; tie estructuras cidas
(lacas de hematoxilina, fucsina bsica, azul de metileno, verde de metileno). Existen
sustancias tales como las Basofilas, que muestran afinidad por colorantes bsicos
alcalinos.
COLORANTES CIDOS (colorante aninico)
Son sales que estn con relacin con el componente cido de su molcula; tie
estructuras bsicas, contenidas en el citoplasma celular (eosina, fucsina cida), son
colorantes citoplasmticos. Adems, se dan sustancias tales como las cido filas, las
cuales logran la afinidad por medio de este tipo de colorantes.
Dependiendo de la fraccin cromgena (generadora de color) el colorante ser cido
(cuando posee carga negativa) o bsico (cuando posee carga positiva)
Durante la coloracin las fracciones cromgenas se ligan a componentes tisulares de
carga contraria.
Qu otras tcnicas de coloracin se conocen para observar estructuras o
tipos de microorganismos?
RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para
los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que
aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato
de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los
....................... 100 g
.............................. 0,1
.................. 0,1
g
...... 10 a 30 gotas
CONCLUSIN
Por medio del anterior laboratorio realizado y con la ayuda de la bibliografa citada
podemos concluir los siguientes aspectos:
BIBLIOGRAFA
FEY, Hans. Compendio de bacteriologa general mdica. Ed Acribia. Espaa. 1978.
p 35-37.
Disponible en pgina web:
http://coli.usal.es/web/educativo/micro2/tema02.html
http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html
http://bilbo.edu.uy/~microbio/morfologia.html
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/general.php?Mostrar=introduccio
n
http://www.manant.unt.edu.ar/Departamentos/Ecologia/microbiologia/examen_
coloracion.htm
http://agronomia.uchile.cl/webcursos/microbiologiagral/pagina%20microbiologia
1/word/Guia_Lab_07_(1).doc