Universidad Nacional Autnoma de Nicaragua,

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Introduccin.

La cromatografa ha sido un mtodo muy empleado en los laboratorios

qumicos por su capacidad de separar e identificar compuestos de
acuerdo a su afinidad y absorcin de la muestra en una fase
estacionaria. Cuando se desean separar los componentes de una mezcla
compleja generalmente no se logra con una cromatografa
unidimensional, ya que con esta no se separaran totalmente los
componentes y sera necesario realizar varios cromatogramas; un
ejemplo de ellos es el anlisis de mezclas de aminocidos, por ello es
necesario realizar cromatografa bidimensional, en esta tcnica la
muestra se aplica en una esquina de la placa y el cromatograma se
corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, luego de que el
cromatograma est completo y el papel seco, la placa se rota a 90 0 y se
realiza una cromatografa paralela al segundo borde utilizando otro
sistema de solvente, dado que cada compuesto migra a una velocidad
caracterstica en un sistema de solvente determinado, la segunda
cromatografa debera incrementar en grado sustancial la separacin de
la mezcla de sus componentes.

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Cromatografa Bidimensional

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Objetivos

Objetivo general:
Conocer la cromatografa bidimensional para el uso en diversas
sustancias.

Objetivos especficos:
Aprender tericamente el mtodo de la cromatografa.
Determinar cmo se realizan y ejecutan los diversos mtodos o tipos de
cromatografa.
Conocer como poder interpretar los resultados en los ensayos de
cromatografa.

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Cromatografa Bidimensional

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Marco terico:

FUNDAMENTO

La
cromatografa
bidimensional,
se
basa
en
desarrollar un
Cromatograma con dos fases mviles distintas en diferentes direcciones.
En esta tcnica se realiza un cromatograma tradicional, salvo que la
muestra se aplica en una esquina de una hoja de papel de filtro y que el
cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel.
Luego de que el cromatograma est completo y el papel se sec, la hoja
se rota 900 y se realiza una cromatografia paralela al segundo borde
utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a
una velocidad caracterstica en un sistema de solventes determinado, la
segunda cromatografa debera incrementar en grado sustancial la
separacin de la mezcla en sus componentes.

Cromatografia Bidimensional en papel

DESARROLLO DEL METODO

Para mejorar una separacin incompleta, se combinan dos pasos de

cromatografa mono dimensional de la manera siguiente:
1 paso: Cargar la muestra en una esquina de la placa y se realiza el
desarrollo en sentido ascendente con el disolvente A.
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2 paso: A continuacin se elimina este disolvente por evaporacin, y
segirar 90 la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya
separada parcialmente se encuentre en el borde inferior, a continuacin
se desarrolla en sentido ascendente con un segundo eluyente
(disolvente B).
Tras la eliminacin del disolvente, se determina la posicin de los
componentes con un reactivo de revelado, tipo ninhidrina, y las manchas
originadas se identifican comparando sus posiciones con las de los
estndares.
En cuanto al anlisis cuantitativo, ste se puede hacer comparando el
rea de la mancha del estndar con la del analito, se puede hacer una
estimacin semicuantitativa de la cantidad del componente presente.
Los mejores resultados se obtienen si se raspa la mancha de la placa, se
extrae el analito del slido que forma la fase estacionaria, y se
determina el analito por mtodos fsico o qumicos.

Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de slice) de

algunos aminocidos.
Disolvente A: tolueno/2-cloroetanol/piridina.
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Disolvente
B:
cloroformo/alcohol
benclico/cido
actico.
Aminocidos: (1) cido asprtico, (2) cidoglutmico, (3) serina, (4) f3alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9) isoleucina y
(10) cistena

APLICACIONES:

Se realiza cuando se quieren hacer evaluaciones cualitativas rpidas

(screening). Las determinaciones cuantitativas son posibles por
acoplamiento del equipamiento necesario (unidades de carga, scanner);
en estos casos, es mejor recurrir a las placas de HPTLC, porque son ms
efectivas.
La cromatografa bidimensional, es un tipo de tcnica
cromatografica, en la que la muestra inyectada se separ pasando a
travs de dos etapas de separacin diferentes: esto se realiza mediante
la inyeccin del eluyente de la primera columna a una segunda columna.
Tipicamente la segunda columna tiene un mecanismo de separacin
diferente, por lo que las bandas que estn mal resueltas de la primera
columna
pueden estar completamente separados en la segunda
columna. Alternativamente, las dos columnas pueden funcionar a
diferentes temperaturas. La segunda etapa de separacin se debe
ejecutar mucho ms rpido que la primera, puesto que todava hay solo
un nico detector. La superficie plana es susceptible de desarrollo
secuencial en dos direcciones usando disolventes diferentes.
Las separaciones bidimensionales pueden llevarse a cabo en
cromatografa de gases o de liquidos. Varios y diferentes tipos de
estrategias de acoplamiento se han desarrollado para volver a
muestrear de la primera columna en la segunda.
La principal ventaja de las tcnicas de dos dimensiones es que ofrecen
un gran aumento de la capacidad de pico, sin necesidad de
separaciones extremadamente eficientes, ya sea en la columna.
Una vez separados los componentes de la muestra, parte de ellos o
todos se someten a etapas adicionales de separaciones bajo diferentes
condiciones, en otra columna o, en el caso de la cromatografa plana, en
direccin perpendicular.
Aqu parte o todos los componentes de la muestra se someten, una vez
separados a etapas adicionales de separacin.
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Cromatografa Bidimensional

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En cromatografa plana, la cromatografa bidimensional se refiere al
proceso cromatografico que hace que los componentes migren primero
en una direccin y luego en otra perpendicular a ella, las dos eluciones
se llevan a cabo con eluyentes diferentes.
La ventaja radica en la gran capacidad de picos que se puede lograr
utilizando diferentes mecanismos separativos, lo que es prcticamente
indispensable en muestras complejas por cantidad y variedad de
analitos presentes.
Histricamente, la cromatografa liquida
bidimensional ha sido utilizada casi exclusivamente para resolver
muestras con ms de cientos de constituyentes.
Este modo es de los primeros realizados y consiste en recolectar todas
las fracciones eluidas de primera dimensin, para poder ser de nuevo
analizadas por la segunda dimensin.
La cromatografa en capa fina es un procedimiento rpido y sencillo
para separar mezclas de sustancias y para identificar/caracterizar o para
determinar semi cuantitativamente componentes individuales. La
separacin se basa en que sustancias investigadas se reparten de modo
diferencial entre una fase estacionaria y una fase mvil, en esta el
eluyente (fase mvil) que se desplaza por una fina capa de sorbente
(fase estacionaria), transportando as los componentes individuales de
la mezcla de sustancias ms o menos lejos, dependiendo de la
solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorcin.
La separacin se realiza
generalmente por el procedimiento
ascendente, introduciendo el borde inferior de la placa cromatografica
en el solvente, que ser succionado por accin de las fuerzas capilares
del recubrimiento de la superficie de la placa.
Cromatografa bidimensional en capa fina:
Para mejorar una separacin incompleta, se combinan dos pasos de
cromatografa mono dimensional de la siguiente manera:
1- Cargar la muestra en una esquina de la placa y desarrollarla en
sentido ascendente.
2- Girar 90 la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya
separada parcialmente se encuentre en el borde inferior, a
continuacin se desarrolla en sentido ascendente con un segundo
eluyente.
Cromatografa en plano bidimensional
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En este caso la muestra se coloca en una de las esquinas de una placa
cuadrada y se realiza el desarrollo en direccin ascendente con el
disolvente A. A continuacin se elimina este disolvente por evaporacin,
y se gira la placa 90 grados, realizando ahora el desarrollo ascendente
con el disolvente B. Tras la eliminacin del disolvente, se determina la
posicin de los componentes con un reactivo de revelado, tipo
ninhidrina, y las manchas originadas se identifican comparando sus
posiciones con las de los estndares.
Cromatografa liquida bi-dimensional (2D-LC)
La cromatografa liquida bi-dimensional
es motivo de inters
y
experimentacin desde hace ya varios aos. La ventaja principal de la
cromatografa liquida bi-dimensional con respecto a la cromatografa
liquida de alta resolucin radica en la gran capacidad de picos que se
pueden lograr utilizando diferentes mecanismos separativos, lo que es
prcticamente indispensable en muestras complejas por la cantidad y
variedad de analitos presentes. Histricamente ha sido utilizada casi
exclusivamente para resolver con cientos de constituyentes.
El experimento consiste bsicamente en transferir una o varias
fracciones del eluyente de una columna cromatografa una segunda
columna para realizar otra etapa de separacin adicional, esta estrategia
puede tener varios objetivos:
Poder resolver componentes de una mezcla compleja que no
puede ser separada en una nica columna.
Para separar la matriz de una muestra respecto de los
componentes de inters.
Para concentrar y purificar al compuesto en particular.
Hacer un uso ms eficaz del tiempo de separacin.
Cromatografa
Aminocidos

Bidimensional

en

la

Separacin

de

Las mezclas de aminocidos pueden separarse en placas de capa fina de

gel de slica, empleando como fase mvil butano: agua: cido actico
(4:1:1). Las manchas de los aminocidos pueden detectarse sobre la
placa desarrollada, si despus de secarla se asperja con una solucin de
ninhidrina.
Los aminocidos aparecen como manchas ppura sobre un fondo
ligramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce

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amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color
amarillo obscuro.
Este mtodo, aunque no es muy sensible, se emple con frecuencia en
los primeros estudios de la composicin de las protenas. En la
actualidad ha sido desplazado por la cromatografa lquida de alta
resolucin, ya que esta ltima es ms confiable para la cuantificacin y
tiene mayor sensibilidad si los aminocidos se detectan por
fluorescencia.
Sin embargo, la cromatografa de capa fina se sigue empleando para
determinar fosfoaminocidos, ya que de esta manera es posible
identificar si una determinada fosfoprotena, se encuentra fosforilada en
serina, treonina o tirosina. Para ello, la protena debe degradarse
hasta liberar los aminocidos que la componen y luego esto se
separa en una placa de gel de slica. La placa se gira 90 0 y se
desarrolla con un segundo sistema de solventes. Los
fosfoaminocidos pueden revelarse con un reactivo de cido
fosfomolbdico para permitir su identificacin. Los sistemas en
los que las placas se desarrollan en ambas direcciones (en este
caso se aplica slo una muestra por placa) se conocen como TLC
bidimensional.

Conclusin:
En este trabajo de cromatografa bidimensional, logramos conocer que
era la cromatografa bidimensional, que se utiliza muy frecuentemente
para analizar muestras con cientos de componentes o muestras de
aminocidos. La cromatografa bidimensional se hace en dos etapas, las
cuales logran separar todos los componentes de una muestra.

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Bibliografa:

Voet Donald, Voet Judith G. Bioquimica 3era edicin. 2004. Editorial

Medica Panamericana S.A (Disponible en:
https://books.google.com.ni/books?
id=r5bedH_aST0C&pg=PA151&lpg=PA151&dq=cromatografia+bid
imensional&source=bl&ots=RmfRdXwgX3&sig=CbA9yuce7bnEEU
VNh-yPNxTOMxY&hl=es419&sa=X&ei=VuIhVYGCJKTHsQT34oDwDw&ved=0CEYQ6AEwCg#
v=onepage&q=cromatografia%20bidimensional&f=false.
Consultado el: 5 de abril del 2015.)

Ullate Rincon-Rafael Gmez, Serrano lvarez Alonso.

Cromatografia Principios y Aplicaciones. (Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/11642417/Cromatografia-Fundamentos-yAplicaciones#scribd . Consultado el: 5 de abril del 2015)

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