MATERIAIS E MTODOS

________________________________________________Materiais e Mtodos 30

3. MATERIAIS E MTODOS

3.1 Materiais
3.1.1 Fases estacionrias para cromatografia
-

Cromatografia em coluna de vidro:

Slica gel 60 (63-200 m) MERCK
Slica gel 60 H (70-230 m) MERCK
Slica gel tipo flash (35-70 m) ACROS
Sephadex LH 20 - SIGMA

Cromatografia em camada delgada preparativa:

Slica gel 60 PF254 (5-25 m) MERCK
(placas de vidro: 20 x 20 cm, 1 mm de espessura)
Placa comercial em slica gel (5-17 m) ALDRICH
(placas de vidro: 5 x 20 cm, 1 mm de espessura)

Cromatografia em camada delgada analtica:

Slica gel 60 HF 254 MERCK
(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura)
Slica silanizada 60 HF 254 MERCK
(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura)

3.1.2 Solventes
-

para cromatografia:
Solventes P. A. SINTH , VETEC e MALLINCKODT
Solventes grau cromatogrfico - MALLINCKODT e MERCK

para RMN:
Solventes deuterados - ACROS e ALDRICH
(acetona, gua, clorofrmio, DMSO, metanol e piridina)

________________________________________________Materiais e Mtodos 31

3.1.3 Equipamentos

Capela de fluxo laminar

- VECO VL FS 09 M

Autoclaves verticais
- PHOENIX AV 75

Estufa de incubao
- FANEM Ltda 347 CD

Mesa agitadora
- INNOVA T.M.4300 New Brunswick Scientific

Estufa com ar circulante

- Soc. FABBE. Ltda

Microscpio
- OLYMPUS CH-2

Espectrmetro de RMN
- BRUKER DPX-300 MHz
- BRUKER DRX-400 MHz
- BRUKER DRX-500 MHz

________________________________________________Materiais e Mtodos 32

Espectrmetro de Massas
- CG-EM: Shimadzu QP 5000
(coluna D 3-5; 25 m X 0,25 mm X 0,25 m)

- ESI-EM: Micromass Quattro LC (ionizao por electronspray)

Evaporador
- BCHI - modelo rotavapor R

Cromatgrafo a gs-CG
- Hewlett Packard HP 5890- srie II
(coluna HP-1; metilsilicone 100%; 25 m X 0,25 mm X 0,25 m)

Cromatgrafo Lquido de Alta Eficincia-CLAE

- Shimadzu SHIM-PAK- Diode array detector
(coluna CLC - ODS (M), 250 mm X 4,6 mm)

CLAE Reciclante
- Shimadzu LC- GAV (U.V.-SPD-10AV)
(coluna Shodex Asahipak GS-310 26 500 mm X 1,5 mm)

Espectrofotmetro no UV-VIS
- Shimadzu PC 1520 - Diode Array Spectrophotometer

Espectrofotmetro no Infravermelho
- Nicolet - Protege 460

Estufa de secagem e esterilizao

- FANEM Ltda

________________________________________________Materiais e Mtodos 33

3.1.4 Microrganismos
Os fungos foram isolados de amostras de solo brasileiro (P. viridicatum
da regio do Rio Miranda-MS e os demais da regio de So Carlos-SP) pela
Profa. Dra. Suraia Said, identificados na Fundao Tropical de Pesquisa
Andr Tosello e foram mantidos atravs de repiques sucessivos, a 4C, em
meio PDA ("Potato Dextrose Agar") no Laboratrio de Enzimologia Industrial
da FCFRP-USP.

3.2 Mtodos
3.2.1 Condies de cultivo
Inicialmente, as espcies de Penicillium foram cultivadas em diferentes
meios de cultura semi-slidos para seleo dos meios (tabela 4, p.32) nos
quais os fungos apresentaram maior produo de condios.
Os fungos foram repicados, em duplicata, em tubos de ensaio
contendo cerca de 5,0 mL dos meios de cultura solidificados com inclinao
semelhante (garantindo mesma superfcie de contato para multiplicao dos
condios) e incubados a 30C por 7, 10 e 16 dias. Em seguida, os condios
produzidos foram coletados adicionando-se cerca de 5 mL de gua estril
superfcie da cultura e raspando-se levemente, formando uma suspenso de
condios, que foram contados em Cmara de Nebauer (figura 7, p. 33).
Aps a seleo do fungo, P. verrucosum foi cultivado em duas etapas.
Inicialmente em uma pr-cultura e em seguida na cultura fermentativa onde
as condies de cultivo foram variadas.

________________________________________________Materiais e Mtodos 34

Tabela 4. Constituintes dos meios de cultura semi-slidos

Meio YES, descrito por Larsen et al. (2000)
Extrato de levedura

20 g/L

Merck

Sacarose

150 g/L

Vetec

MgSO4. 7H2O

0,5 g/L

Reagen

gar

20 g/L

Oxoid

Meio CYA, descrito por Malmstrom et al. (2000)

Extrato de levedura

5 g/L

Merck

Caldo de Czapek *

35 g/L

gar

15 g/L

Oxoid

Meio MEA, descrito por Kozlovsky et al. (2000)

Extrato de malte

20 g/L

Merck

Peptona

1 g/L

Oxoid

Glicose

20 g/L

Synth

gar

20 g/L

Oxoid

Meio AVEIA, descrito por Malmstrom et al. (2000)

Farinha de aveia

30 g/L

Nestl

gar

15 g/L

Oxoid

Meio PDA, descrito por Nam et al. (2000)

PDA (Potato Dextrose Agar)

39 g/L

Oxoid

* Caldo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992) (tabela 2)

Cerca de 5 x 106 a 1 x 107 condios por mL de P. verrucosum foram

inoculados em 60 mL de meio pr-fermentativo (tabela 5, p. 33) e incubados
inicialmente por 24 e 48 horas sob agitao constante (120 rpm) a 30C. Em
seguida a massa micelial foi assepticamente coletada por filtrao a vcuo.
Com objetivo de selecionar a melhor condio para produo de metablitos
secundrios ativos, a massa micelial obtida do meio pr-fermentativo foi
inoculada em 120 mL de 4 diferentes meios fermentativos (tabela 5, p. 33) e

________________________________________________Materiais e Mtodos 35

incubada por 48, 72 e 144 horas sob agitao constante (120 rpm) a 30C.
Novamente o fluido da cultura foi separado da massa micelial por filtrao a
vcuo. Procedimento ilustrado na figura 8 (p. 36).

P. viridicatum
P. verrucosum
P. ochrochlorum
P.waksmanii
P.simplicissimum
Repique em duplicata para cada tempo de incubao

Meio

Meio

Meio

Meio

Meio

AVEIA

PDA

YES

CYA

MEA

Incubao a 30C

7 dias
7 dias

10 dias
10 dias

16 dias
16 dias

5mL H2O estril

Raspagem, agitao, filtrao

Suspenso conidial
Diluio

Contagem em Cmara de Nebauer

Figura 7. Fluxograma de seleo do meio de cultura semi-slido que

favorece a conidiognese para cada espcie de Penicillium
estudada

Tabela 5. Constituintes dos meios lquidos de cultura

Meio Pr-fermentativo, descrito por Jackson et al. (1993)
P de milho (fub)

2,5 g/L

Yoki

Glicose

10 g/L

Synth

Farinha de aveia

10 g/L

Nestl

Pasta de tomate

40 g/L

Quero

________________________________________________Materiais e Mtodos 36

CaCl2. 2H2O
Sol. trao de elementos de Jackson

10 g/L

Merck

10 mL/L

- Soluo traos de elementos de Jackson

FeSO4. 7H2O

1 g/L

Reagen

MnCl2. 4H2O

1 g/L

Carlo Erba Reagente

CuCl2. 2H2O

0,025 g/L

Divis0 QM

CaCl2. 2H2O

0,1 g/L

Merck

H3BO3

0,56 g/L

Reagen

(NH4)6.MoO2.4H2O

0,019 g/L

Mallinckrodt

0,2 g/L

Mallinckrodt

ZnSO4. 7H2O

Meio Fermentativo de Jackson, descrito por Jackson et al. (1993)

Glicerol

15 g/L

Sigma

Melao de cana de acar

15 g/L

Usina da Pedra*

Peptona

6 g/L

Oxoid

Extrato de levedura

1,5 g/L

Merck

NaCl

30 g/L

Synth

KH2PO4

0,6 g/L

Synth

MgSO4. 7H2O

5 g/L

Reagen

CuSO4. 5H2O

0,001 g/L

Reagen

FeSO4. 7H2O

0,003 g/L

Reagen

Meio Fermentativo de Vogel, descrito por Vogel (1956)

Glicose

20 g/L

Synth

Soluo salina de Vogel

20 g/L

- Soluo salina de Vogel concentrada 50 vezes

Na3 C6H5O7. 2H2O

125 g/L

Synth

KH2PO4

250 g/L

Synth

NH4NO3

100 g/L

Nuclear

CaCl2. 2H2O

5 g/L

Merck

MgSO4. 7H2O

10 g/L

Reagen

Sol. trao de elementos de Vogel

5 mL/L

________________________________________________Materiais e Mtodos 37

Soluo de biotina

1 ml/L

- Soluo traos de elementos de Vogel

H3C6H5O7. H2O

5g

Reagen

ZnSO4. 7H2O

5g

Mallinckrodt

Fe (NH4)2(SO4)2. 6H2O

1g

Synth

CuSO4. 5H2O

0,25 g

Reagen

MnSO4. H2O

0,05 g

Reagen

H3BO3

0,05 g

Reagen

Na2MoO4. 2H2O

0,05 g

Mallinckrodt

H2O destilada

95 mL

Biotina

0,005 g

Sigma

lcool 50%

100 mL

Synth

- Soluo de biotina

Meio Fermentativo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992)

Sacarose

30 g/L

Vetec

NaNO3

2 g/L

Vetec

K2HPO4

1 g/L

Henrifarma

MgSO4. 7H2O

0,5 g/L

Reagen

KCl

0,5 g/L

Reagen

FeSO4. 7H2O

0,01 g/L

Reagen

pH=5
Meio Fermentativo de Takeuchi, descrito por Takeuchi et al. (1989)
Amido

25 g/L

Synth

Sacarose

20 g/L

Vetec

Casamino cido

10 g/L

Fisher Scientific

KH2PO4

5 g/L

Synth

2,5 g/L

Reagen

MgSO4. 7H2O
* Ribeiro Preto- SP.

________________________________________________Materiais e Mtodos 38

Suspenso de condios
5 X 106 1 X 107 condios/mL
60 mL meio prfermentativo (MPF)

Incubao a 30C; 120 rpm

48 horas

24 horas
A

A
B

120 mL meio
Takeuchi

120 mL meio
Vogel
B

120 mL meio
Czapeck

120 mL meio
Jackson

B
C

B
C

C C

A- Filtrao e transferncia da massa micelial para cada meio de cultura.

B- Incubao do meio pelos 3 tempos distintos a 30C; 120rpm

48 horas

72 horas
C

144 horas

C- Filtrao a vcuo para cada condio de cultivo

Total = 23 condies de cultivo

*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.

Massa micelial

Fluido da cultura

Figura 8. Fluxograma das condies de cultivo de Penicillium verrucosum

3.2.2 Obteno dos extratos brutos

A massa micelial foi inicialmente extrada com MeOH por 24 horas

resultando num primeiro extrato metanlico. Seqencialmente a massa foi
seca em estufa com ar circulante a 40C, triturada, pesada e extrada com
CH2Cl2 e MeOH por processo de macerao durante 5 dias. Foram feitas 3
repeties consecutivas para cada solvente. O fluido da cultura foi submetido
a partio lquido-lquido com AcOEt por 3 vezes consecutivas, resultando
em um extrato orgnico e um aquoso (figura 9, p. 37).

________________________________________________Materiais e Mtodos 39

Aps o processo de extrao tanto da massa micelial quanto do fluido

da cultura, os solventes foram evaporados at a secura em rotaevaporador
ou liofilizados.
Cultura de
Penicillium verrucosum

Fluido da cultura

Massa micelial
Suspeno em MeOH
24 horas
Filtrao

Massa
micelial

Extrato
ExtratoMa
Ma
MeOHMeOH-11

Partio lquido-lquido com AcOEt

Extrato Aq
Aquoso

Extrato Ac
AcOEt

Secagem a 40C
Ressuspeno em MeOH
Ultra-som por 30 minutos
Extrao por 5 dias (3 vezes consecutivas)
Filtrao

Total = 115 extratos brutos

Massa
micelial

Extrato Me
MeOH - 2

*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.

Ressuspeno em CH2Cl2
Extrao por 5 dias (3 vezes consecutivas)

Extrato Dc
CH2Cl2

Figura 9. Fluxograma de obteno dos extratos brutos intra e extra celular de

P. verrucosum

As condies de cultivo e rendimentos obtidos para os 115 extratos

brutos produzidos em pequena escala encontram-se na tabela 6 (p. 38).
Todos os extratos brutos obtidos em pequena escala foram avaliados
quanto a sua atividade tripanocida, atividade inibitria da enzima GAPDH de
T. cruzi e enzima APRT de L. tarentolae.

________________________________________________Materiais e Mtodos 40

Tabela 6. Quantidade dos 115 extratos brutos obtidos das 23 condies de

cultivo de P. verrucosum em pequena escala
N

Condio
de cultivo

Ac1

F1 242 C3 484

Ac2

Ac3

Ma4
Ma5
Ma6
Aq7

Peso N
(mg)

Condio
de cultivo

Peso
(mg)
22,1

Condio
de cultivo

Ma81

M 48 V 144

Peso
(mg)

32,0

Dc41

M 24 J 72

24 C 72

8,4

Dc42

M 24 J 144

5,5

Aq82

48 V 48

672,3

24 C 144

43,2

Me43

M 24 J 48

56,6

Aq83

48 V 72

885,2

M 24 C 48

56,6

Me44

M 24 J 72

105,1

Aq84

48 V 144

M 24 C 72

343,3

Me45

M 24 J 144

135,3

Me85

M 48 V 48

151,8

M 24 C 144

156,7

Ac46

24 T 48

5,6

Me86

M 48 V 72

94,4

24 C 48

1485,9 Ac47

24 T 72

8,1

Me87

M 48 V 144

Aq8

24 C 72

1153,0 Ac48

24 T 144

51,9

Dc88

M 48 V 48

1,2

Aq9

24 C 144

273,8

Ma49

M 24 T 48

229,3

Dc89

M 48 V 72

6,4

Dc10

M 24 C 48

8,9

Ma50

M 24 T 72

311,1

Dc90

M 48 V 144

Dc11

M 24 C 72

26,0

Ma51

M 24 T 144

234,7

Ac91

48 J

48

16,3

Dc12

M 24 C 144

5,5

Aq52

24 T 48

2364,0

Ac92

48 J

72

12,1

Me13 M 24 C 48

83,7

Aq53

24 T 72

1251,8

Ac93

48 J 144

Me14 M 24 C 72

111,0

Aq54

24 T 144

747,4

Ma94

M 48 J

48

723,2

11,1

Me15 M 24 C 144

27,8

Dc55

M 24 T 48

37,9

Ma95

M 48 J

72

459,4

Ac16

24 V 48

37,8

Dc56

M 24 T 72

23,0

Ma96

M 48 J 144

482,3

Ac17

24 V 72

44,5

Dc57

M 24 T 144

5,4

Aq97

48 J

48

1910,6

Ac18

24 V 144

28,0

Me58

M 24 T 48

172,9

Aq98

48 J

72

2630,5

Ma19 M 24 V 48

153,6

Me59

M 24 T 72

149,8

Aq99

48 J 144

2756,8

Ma20 M 24 V 72

175,1

Me60

M 24 T 144

94,4

Me100 M 48 J

48

222,7

Ma21 M 24 V 144

99,7

Ac61

48 C 48

4,3

Me101 M 48 J

72

123,0

Aq22

24 V 48

528,1

Ac62

48 C 72

3,7

Me102 M 48 J 144

206,5

Aq23

24 V 72

318,4

Ac63

48 C 144

4,8

Dc103 M 48 J

48

9,0

Aq24

24 V 144

412,6

Ma64

M 48 C 48

205,0

Dc104 M 48 J

72

7,4

Dc25

M 24 V 48

6,8

Ma65

M 48 C 72

237,5

Dc105 M 48 J 144

4,8

Dc26

M 24 V 72

3,2

Ma66

M 48 C 144

231,2

Ac106 F

48 T 48

6,4

Dc27

M 24 V 144

1,9

Aq67

48 C 48

1555,0

Ac107 F

48 T 72

14,5

Me28 M 24 V 48

40,9

Aq68

48 C 72

1186,3

Ac108 F

48 T 144

5,3

Me29 M 24 V 72

54,5

Aq69

48 C 144

309,4

Ma109 M 48 T 48

469,8

Me30 M 24 V 144

10,2

Me70

M 48 C 48

194,4

Ma110 M 48 T 72

357,5

Ac31

24 J 48

23,7

Me71

M 48 C 72

203,2

Ma111 M 48 T 144

415,8

Ac32

24 J 72

15,8

Me72

M 48 C 144

156,9

Aq112 F

48 T 48

1443,4

Ac33

24 J 144

59,9

Dc73

M 48 C 48

40,5

Aq113 F

48 T 72

1189,0

Ma34 M 24 J 48

284,1

Dc74

M 48 C 72

52,7

Aq114 F

48 T 144

889,8

Ma35 M 24 J 72

477,8

Dc75

M 48 C 144

11,6

Me115 M 48 T 48

214,7

Ma36 M 24 J 144
Aq37 F 24 J 48

349,9 Ac76
1349,9 Ac77

F
F

48 V 48
48 V 72

3,6
5,2

Me116 M 48 T 72
Me117 M 48 T 144

210,2
361,8

Aq38

24 J 72

1647,4 Ac78

48 V 144

Aq39

24 J 144 3715,5 Ma79

Dc40

M 24 J 48

31,1

Ma80

Dc118 M 48 T 48

23,8

M 48 V 48

123,8

Dc119 M 48 T 72

93,4

M 48 V 72

330,9

Dc120 M 48 T 144

52,0

Origem: M= massa micelial e F= fluido da cultura; Tempo de incubao na pr-cultura: 24 e 48 horas; Meio de cultura
4
fermentativo: C= Czapeck, J= Jackson, V= Vogel e T= Takeuchi; Tempo de incubao no meio fermentativo: 24, 48 e 72 horas
(meios de cultura e procedimentos previamente descritos (p..32-39). * perda da massa micelial durante o processo de filtrao a
vcuo.

________________________________________________Materiais e Mtodos 41

3.2.3 Perfis cromatogrficos via CLAE

Cerca de 30 extratos brutos, de origem intra e extracelular, tiveram seu

perfil cromatogrfico determinado via CLAE. As condies de trabalho
incluem coluna CLC - ODS (M), 25 cm X 4,6 mm, partculas de 5 m,
deteco simultnea a 220, 254 e 270 nm a temperatura ambiente de 22 a
25C. As amostras foram filtradas em membrana millipore de 0,45 m e 20 l
de uma soluo a 1 mg/mL foram analisadas em 60 min. de eluio, fase
H2O - MeOH 30% , fluxo de 0,5 mL/min e sistema de integrao
computadorizado com software CLASS-VP verso 5,02.
A escala do eixo das ordenadas (mAU) e do eixo das abcissas (min)
foram expandidas para visualizar a presena dos picos de baixa intensidade
de absoro e ampliar a visualizao de cada pico em seu tempo de
reteno.

3.2.4 Aumento da produo dos extratos Ac47 e Me59

Os extratos Ac47 e Me59 foram selecionados para fracionamento

cromatogrfico. Inicialmente foram produzidos em escala intermediria.
Porm, aps os fracionamentos preliminares do extrato Ac47 verificou-se que
a quantidade no era suficiente para isolamento das substncias, portanto o
fungo foi novamente cultivado em escala ampliada (tabela 7, p. 40).

________________________________________________Materiais e Mtodos 42

Tabela 7. Produo em diferentes escalas do extrato bruto Ac47 e Me59

Escala de Quantidade de cultura
produo
fermentada (L)
Pequena
0,12
Intermediria
2,80
Ampliada
9,60

Quantidade de
extrato Ac (mg)
8,1
448,3
1.751,0

Quantidade de
extrato Me (mg)
149,8
2.170,0
4.358,1

3.2.5 Fracionamento cromatogrfico de Ac47 e Me59

3.2.5.1 Extrato Ac47 produzido em escala intermediria (i)

O extrato Ac47i foi fracionado atravs de diversos processos
cromatogrficos: coluna lquida a vcuo (CLV) usando como fase
estacionria (FE) slica gel 60 H e fase mvel (FM) hexano, hexano:AcOEt
nas propores 5%,10%,20%, 30%, 50% e 80% alm de AcOEt:MeOH 50%
e MeOH, originando 10 fraes. Destas fraes, Ac47.6i foi fracionada por
cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) usando como FM
hexano:AcOEt 1:1, originando 5 fraes. A frao Ac47.9i foi fracionada em
coluna flash isocrtica com FM CH2Cl2:MeOH 9:1, originando 17 fraes,
das quais, Ac47.9.8i foi fracionada por CCDP comercial usando como FM
CH2Cl2:MeOH 9:1, originando 4 novas fraes (figura 10, p. 41).
Os espectros de RMN1H das fraes Ac47.9.9i e Ac47.9.10i
apresentaram-se muito semelhantes portanto as duas fraes foram
reunidas e novamente separadas por lavagens consecutivas com MeOH e
CHCl3, originando Ac47.b1i e Ac47.b2i respectivamente. A frao Acb1i foi
fracionada por CLAE reciclante nas condies especificadas na figura 11 (p.
41).

________________________________________________Materiais e Mtodos 43

AC47i
448,3 mg
CLV (FE = slica gel 60 H)
13 X 5 cm (h X )
FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%,
80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH
10 Fr.
Ac47.6i

Ac47.9i

16,2 mg

200 mg
Coluna em slica flash
40 X 2 cm
FM = CH2Cl 2:MeOH 9:1
17 Fr.

CCDP (20 X 20cm)

FM= Hex : AcOEt 50%
5 Fr.
Ac47.6.1i

Ac47.6.3i

Ac47.6.5i

1,7 mg

1,2 mg

3,1 mg

Ac47.6.2i

Ac47.6.4i

1,1 mg

2,2 mg

Ac47.9.8i
Ac47.9.10i

2,9 mg
CCDP 5 X 20cm

5,7 mg

FM = CH2Cl 2:MeOH 9:1

4 Fr.

Ac47.9.9i

Ac47.9.8.1i

Ac47.9.8.3i

0,7 mg

0,4 mg

6,8 mg

Ac47.9.8.2i

Ac47.9.8.4i

1,6 mg

0,8 mg

Figura 10. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47i de P. verrucosum

Ac47.9.9i

Ac47.9.10i

6,8 mg

5,7 mg

Lavagem com MeOH

MeOH
Ac47.b1i

Resduo

8,9 mg

3,6 mg
CLAE reciclante

Lavagem com CHCl3

Coluna polimrica 500 X 21,5mm

Fluxo = 5mL/min. (10 ciclos)
FM= MeOH:CH 2Cl2 50%
= 254 nm, 365 nm

Ac47.b2i
1 mg

Resduo
2,6 mg

20 Fr.
Fraes analisadas via RMN1H

Figura 11. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.9i e Ac47.9.10i

________________________________________________Materiais e Mtodos 44

3.2.5.2 Extrato Ac47 produzido em escala ampliada

O extrato Ac47, produzido em escala ampliada, tambm foi submetido

a processos cromatogrficos, inicialmente por CLV usando como FE slica
gel 60 H e FM Hexano, Hexano:AcOEt nas propores 5%,10%, 20%, 30%,
50% e 80% alm de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH. A frao Ac47.9 foi
fracionada novamente por CLV usando como FE slica gel 60 H e FM
CH2Cl2, CH2Cl2:MeOH nas propores 5%,10%, 20%, 30%, 50% e 80% e
MeOH, originando 8 fraes (figura 12, p. 42). As fraes Ac47.9.2, Ac47.9.3
e Ac47.9.4 foram submetidas a novos processos cromatogrficos. Para a
frao Ac479.2 utilizou-se coluna flash isocrtica (CHCl 3:MeOH 9:1),
procedimento ilustrado na figura 13 (p. 43).
Ac47
1,75 g
CLV (FE = slica gel 60 H)
9 X 9 cm
FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%,
AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH
10 Fr.
Ac47.9
683,2 mg
CLV (FE = slica gel 60 H)
18 X 4 cm
FM = CH2Cl2, CH2Cl2:MeOH 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%,
MeOH
8 Fr.

Ac47.9.1
4 mg

Ac47.9.2

Ac47.9.4

Ac47.9.6

Ac47.9.8

98,3 mg

131 mg

25,7 mg

13,7 mg

Ac47.9.3

Ac47.9.5

Ac47.9.7

269,4 mg

62,2 mg

10,7 mg

________________________________________________Materiais e Mtodos 45

Figura 12. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47

Ac47.9.2
98,3 mg
Coluna em slica flash
19 X 2 cm
FM = CHCl3:MeOH 9:1
9 Fr.

Ac47.9.2.2

Ac47.9.2.4

Ac47.9.2.6

Ac47.9.2.8

3,2 mg

32,6 mg

2,5 mg

1,5 mg

Ac47.9.2.1

Ac47.9.2.3

Ac47.9.2.5

Ac47.9.2.7

Ac47.9.2.9

0,2 mg

48,3 mg

9,7 mg

1,6 mg

2,7 mg

Figura 13. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.2

Para a frao Ac47.9.3 utilizou-se coluna em slica gel com FM

CHCl3:MeOH 9:1, originando 14 fraes, das quais Ac47.9.3.8 foi separada
em CLAE reciclante nas condies especificadas na figura 14 (p. 43).
Ac47.9.3
269,4 mg
Coluna em slica gel
15 X 2 cm
FM = CHCl3:MeOH 9:1
14 Fr.
Ac47.9.3.8
35,7 mg
CLAE reciclante
Coluna polimrica 500 X 21,5mm
Fluxo =3mL/min. (12 ciclos)
FM = MeOH:CH2Cl2 50%
= 225 nm, 276 nm
9 Fr.

Ac47.9.3.8.2

Ac47.9.3.8.4

Ac47.9.3.8.6

Ac47.9.3.8.8

0,8 mg

1,4 mg

0,8 mg

0,7 mg

Ac47.9.3.8.1

Ac47.9.3.8.3

Ac47.9.3.8.5

Ac47.9.3.8.7

Ac47.9.3.8.9

2 mg

0,8 mg

1,1 mg

0,9 mg

0,7 mg

________________________________________________Materiais e Mtodos 46

Figura 14. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.3

A frao Ac47.9.4 foi fracionada inicialmente por coluna em Sephadex
LH 20 usando como FM MeOH, originando 8 fraes das quais duas
(Ac47.9.4.4 e Ac47.9.4.5)

foram separadas em CLAE reciclante nas

condies especificadas na figura 15 (p. 44). Na CLAE foram geradas 9 e 13

fraes respectivamente. Destas fraes foi isolada uma substncia que
corresponde a frao Ac47.9.4.4.7 e Ac47.9.4.5.12 que apresentaram
espectro de RMN 1H iguais e foram reunidas de acordo com a figura 15 (p.
44).

Ac47.9.4
131 mg
Coluna em Sephadex LH 20
40 X 4 cm
FM= MeOH
8 Fr.

Ac47.9.4.4

Ac47.9.4.5

34,9 mg

24,3 mg
CLAE reciclante

CLAE reciclante

Coluna polimrica 500 X 21,5mm

Coluna polimrica 500 X 21,5mm

Fluxo =3mL/min. (22 ciclos)

Fluxo =5mL/min. (6 ciclos)

FM= MeOH:CH2Cl2 50%

FM= MeOH:CH2Cl2 50%

= 225 nm, 276 nm

= 225 nm, 276 nm

9 Fr.

13 Fr.

Ac47.9.4.4.7

Ac47.9.4.5.12

1,8 mg

1 mg

RMN1H

RMN1H
Substncia F1
2,8 mg

Figura 15. Fluxograma de isolamento da substncia F1

________________________________________________Materiais e Mtodos 47

Em todos os fracionamentos utilizou-se cromatografia em camada

delgada (CCDA) em slica gel ou slica silanizada para reunio de fraes
semelhantes, escolha de FM, entre outros procedimentos.

3.2.5.3 Extrato Me59 produzido em escala ampliada

Inicialmente o extrato Me59 foi particionado com solventes orgnicos,

originando 5 fraes (figura 16, p. 45).

Me59
4,36g
Suspenso em MeOH:H2O 1:3
Partio lq-lq com CH2Cl2
Frao
Hidroalcolica

CH2Cl2
Concentrao
Suspenso em MeOH
Partio lq-lq com Hex
Me59.5

Me59.1

194,7 mg 335,6 mg

Me59.4
56 mg

Partio lq-lq com AcOEt

Frao
Hidroalcolica
Partio lq-lq com n-BuOH

Me59.1- MeOH
Me59.2- n-BuOH
Me59.3- Aquoso

Me59.2

Me59.3

1,81 g

1,44 g

Me59.4- AcOEt
Me59.5- Hex

Figura 16. Fluxograma de partio lquido-lquido do extrato Me59

A frao Me59.1 foi fracionada por CLV, usando como FE slica gel
60H e FM hexano, hexano:AcOEt nas propores 5%,10%, 20%, 30%, 50%

________________________________________________Materiais e Mtodos 48

e 80% alm de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH, originando 9 novas

fraes. A frao Me59.1.9 foi fracionada novamente por coluna em
Sephadex LH 20 usando como FM MeOH, originando 6 fraes das quais
uma,

Me59.1.9.2,

foi

fracionada

por

CCDP

usando

como

FM

nBuOH:AcOH:H2O 6:1:3 (figura 17,p. 46).

A frao Me59.2 tambm foi fracionada por CLV usando como FE
slica gel 60 H e FM AcOEt, AcOEt:(MeOH:H2O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%,
20%, 50%, 80%, 100%, originado 10 fraes. Para a frao Me59.2.1 utilizouse coluna flash isocrtica (Hex:Me2CO:AcOH 9:1:0,3), seguida de CCDP para
Me59.2.1.3 usando como FM Hex:Me 2CO:AcOH 19:1:0,6 (figura 18, p. 47).

Me59.1
335,6 mg
CLV (FE = slica gel 60 H)
18 X 5 cm
FM = Hex, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt,
AcOEt:MeOH 50%, MeOH
9 Fr.
M59.1.9
205,4 mg
Coluna em Sephadex LH 20
28 X 2 cm
FM= MeOH
6 Fr.
Me59.1.9.2
13,9 mg
CCDP (5 X 20cm)
FM= n-BuOH:AcOH:H2O 6:1:3
6 Fr.

Me59.1.9.2.1

Me59.1.9.2.3

Me59.1.9.2.5

5,4 mg

5,2 mg

1,6 mg

Me59.1.9.2.2

Me59.1.9.2.4

Me59.1.9.2.6

0,3 mg

2,3 mg

2,8 mg

Figura 17. Fluxograma de fracionamento de Me59.1

________________________________________________Materiais e Mtodos 49

A frao Me59.2.8 foi acetilada e purificada por CCDP originando a

substncia M3a, conforme a figura 18 (p. 47). Alm disso, esta frao
tambm foi esterificada com diazometano, originando a mistura de
substncias M2, analisada por CG/EM.
Me59.2
1,81 g
CLV (FE = slica gel 60 H)
20 X 5 cm
FM = AcOEt, AcOEt:(MeOH:H2O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%,
20%, 50%, 80%, 100%
10 Fr.

Coluna em slica gel

22 X 2 cm
Me59.2.8 diazometano FM = MeOH:CHCl 3

Me59.2.1
259,5 mg

242,2 mg
Acetilao 40mg

Coluna em slica flash

22 X 2 cm

(piridina/anidrido actico)

FM = Hex:Me2 CO:AcOH 9:1:0,3

12 horas.Extrao com AcOEt

7 Fr.

Mistura de
substncias M2
32 mg
CG/EM

Me59.2.8.1

Me59.2.1.3

30 mg

127,2 mg

CCDP (20 X 20cm)

CCDP 3X (20 X 20cm)

FM= Hex:Me2CO:AcOH 19:1:0,6
2 Fr.

FM= Me2CO:Hex 9:1

steres
metlicos
de cidos
graxos

2 Fr.
Me59.2.8.1.2

Me592.1.3.1

Me59.2.1.3.2

77 mg

62,7 mg

13,9 mg
CCDP (20 X 20cm)
FM= MeOH:Me2 CO 1:1
2 Fr.
Substncia M3a
8,2 mg

Figura 18. Fluxograma de fracionamento de Me59.2

Usando coluna em sephadex LH 20, FM H2O:MeOH 7:3, a frao

Me59.3 originou 5 novas fraes e a substncia M3. Para Me59.3.2 e
Me59.3.3 foi utilizado fracionamento em coluna em slica gel com FM
H2O:Me2CO 4:1. Da frao Me59.3.3. foram isolada a substncia M5 e a

________________________________________________Materiais e Mtodos 50

substncia M4 que foi

acetilada e purificada por coluna em slica gel,

originando a substncia M4a, conforme a figura 19 (p. 48).

Me59.3
1,44 g
Coluna em Sephadex LH 20
44 X 2,5 cm
FM= MeOH:H2O 7:3
6 Fr.

Me59.3.2
18 m g
Coluna em slica gel

Me59.3.3

Substncia M3

183,1 mg

187,7 mg

Coluna em slica gel

13 X 1 cm

22 X 2 cm

FM = H2O:Me2CO 4:1

FM = H2O:Me2CO 4:1

3 Fr.

6 Fr.

Me59.3.2.1

Me59.3.2.2

Me59.3.2.3

8,4 m g

2,2 m g

10 m g

Substncia M4
118,3 mg
Acetilao 30mg

Substncia M5
16,3 mg

(piridina/anidrido actico)
12 horas.Extrao com AcOEt
Coluna em slica gel
18 X 1 cm
FM = Hex:Me 2CO 3:2
Substncia M4a
10,2 mg

Figura 19. Fluxograma de fracionamento de Me59.3

Me59.4
56 mg
CCDP (20 X 20cm)
FM= CHCl3 :AcOEt 7:3
6 Fr.
Mistura de
substncias M6
30 mg
Transesterificao 30mg
(MeOH/H2SO4 )
2 horas em refluxo.Extrao com Hex
Mistura de
substncia M6b
5,5 mg

CG/EM
steres
metlicos
dos cidos
graxos

________________________________________________Materiais e Mtodos 51

Figura 20. Fluxograma de fracionamento de Me59.4

A frao Me59.4 foi fracionada em CCDP usando como FM
CHCl3:AcOEt 7:3, gerando 5 fraes e a mistura de substncias M6 que foi
transesterificada originando a mistura de substncias M6b que foi analisada
via CG-EM (figura 20, p. 48).

3.2.6 Reaes qumicas efetuadas em algumas substncias

- Acetilao

As reaes de acetilao foram feitas com 1,0 mL de anidrido actico

e 0,5 mL de piridina para 30 mg da substncia M4 e 40mg da frao
Me59.2.8. As misturas reacionais foram deixadas em agitao por 14 horas
temperatura ambiente. A mistura reacional foi vertida sobre gua gelada e
os produtos extrados com AcOEt. A fase orgnica foi lavada com soluo
de cido actico 10%. O solvente foi evaporado aps a secagem com sulfato
de sdio anidro (Santos, 2001).

- Transesterificao de triglicerdeos

A transesterificao foi feita com 30 mg da mistura de substncias M6

que foi solubilizada em 2,0 mL de MeOH. Pedaos de porcelana e 30l de
H2SO4 foram adicionados mistura reacional que foi refluxada por 2 horas
sob agitao ocasional. A extrao foi feita com hexano aps adio de

________________________________________________Materiais e Mtodos 52

20,0mL de H2O e a fase orgnica foi lavada com soluo bicarbonatada 5%,
seca com sulfato de sdio e rotaevaporada at a secura (Santos, 2001).
- Esterificao com diazometano

A frao Me59.2.8 foi esterificada com uma soluo de diazometano.

Para isso foi adicionada uma soluo de diazometano em ter ao substrato
at no ser mais observada a eliminao de gs de N2.
A soluo de diazometano foi preparada dissolvendo-se 2,14g de ptoluilsulfonilmetilnitrosamida (diazald) em 30 mL de ter etlico (em balo de
destilao) e resfriando-se a soluo em banho de gelo. Foi adicionada uma
soluo de 0,4 g de KOH em 10,0 mL de etanol. Aps 5 minutos a soluo
etrea de diazometano foi destilada com aquecimento por banho de leo. O
reagente foi recolhido sobre ter etlico resfriado em banho de gelo (Pupo,
1997).

3.2.7 Elucidao estrutural das substncias

A elucidao das estruturas qumicas foi feita atravs das tcnicas

espectroscpicas: IV, EM, RMN1H, RMN13C, COSY 1H1H, HMBC, HMQC.

3.2.8 Ensaios antiparasitrios in vitro para avaliao da atividade

tripanocida

Esse ensaio foi realizado pelo Prof. Dr. Srgio de Albuquerque

(FCFRP-USP). O bioensaio foi realizado em amostras sangneas coletadas

________________________________________________Materiais e Mtodos 53

de ratos albinos Swiss no stimo dia de parasitemia aps a infeco com a

linhagem Y de T. cruzi (Silva & Nussenzweig, 1953). O sangue infectado foi
diludo a uma concentrao de 2x106 tripomastigotas/mL. Os ensaios foram
realizados em microplacas (96 orifcios) com 400 L de sangue em triplicata.
Para extratos brutos a concentrao utilizada nos ensaios foi de 500 g/mL e
1 mg/ml. Para substncias puras a concentrao foi de 8, 32 e 128 M. As
placas foram incubadas a 4oC e o nmero de parasitas contados aps 24
horas, de acordo com o procedimento descrito por Brener, 1962. Sangue
infectado com o mesmo volume de DMSO foi usado como controle negativo e
a violeta de genciana foi usada como controle positivo (250 g/mL).

3.2.9 Ensaios de inibio das atividades enzimticas

As enzimas utilizadas neste trabalho so obtidas de forma

recombinante a partir dos plasmdeos inseridos em bactrias Escherichia coli.
A preparao e a purificao das enzimas so feitas rotineiramente de
acordo com os procedimentos estabelecidos no Laboratrio de Cristalografia
de Protenas e Biologia Estrutural do Instituto de Fsica de So Carlos da
Universidade de So Paulo. O procedimento para GAPDH j foi descrito
(Souza et al., 1998).

- Enzima GAPDH de T. cruzi

________________________________________________Materiais e Mtodos 54

Os ensaios foram realizados no Laboratrio de Qumica Farmacutica

da FCFRP-USP e foram feitos conforme procedimento previamente descrito
(Vieira et al., 2001), pela medida espectrofotomtrica de NADH formado em
340 nm durante 30 s. A mistura reacional contm (volume final 1 mL): 50 mM
tampo Tris-HCl pH 8,6 com 1 mM EDTA e 1mM -mercaptoetanol, 30 mM
arseniato de sdio, 2,5 mM NAD, 0,3 mM gliceraldedo-3-fosfato (G3P) e 1,5
g de enzima. A reao iniciada pela adio do substrato.
Para o teste de inibio, as solues dos extratos (1 mg/mL) foram
preparadas em DMSO e 100 L foi adicionado mistura reacional.
Substncias puras so inicialmente testadas em 100 g/ml e esta
concentrao diminuda at a obteno de aproximadamente 50% de
inibio (IC50). A concentrao final de DMSO usada foi 10% e este volume
foi subtrado do volume do tampo. Substncias puras so inicialmente
testadas em 100 g/mL e esta concentrao diminuda at a obteno de
aproximadamente 50% de inibio (IC50). Ensaios controle foram feitos na
ausncia de extratos, onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado.
As medidas foram feitas em triplicata e considerou-se o valor da mdia.

- Enzima APRT de L. tarentolae

Os ensaios foram realizados no Laboratrio de Cristalografia de

Protenas e Biologia Estrutural do Instituto de Fsica de So Carlos da
Universidade de So Paulo. Utilizou-se a enzima APRT de L. tarentolae,
clonada e caracterizada por Thiemann e colaboradores em 1998 e estes

________________________________________________Materiais e Mtodos 55

ensaios foram feitos de acordo com a modificao de um procedimento

previamente

descrito

(Tuttle

&

Krenistsky,

1990)

pela

medida

espectrofotomtrica da formao de AMP. Os ensaios de atividade foram

acompanhados por 60 segundos e o comprimento de onda utilizado 259
nm. A mistura reacional contm (volume final de 0,5 mL): tampo Tris - HCl
100 mM (pH 7,4); MgCl2 5 mM; Adenina 100 mM; PRPP 560 mM e APRT 7,5
g. Para o teste de inibio, as solues dos extratos (1 mg/ml) foram
preparadas em DMSO e 100L foi adicionado mistura reacional. A
concentrao final de DMSO usada foi 10% e este volume foi subtrado do
volume do tampo. Ensaios controle foram feitos na ausncia de extratos,
onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado. As medidas foram
feitas em triplicata e considera-se o valor da mdia.
Os resultados obtidos para GAPDH e APRT foram avaliados conforme
procedimento previamente descrito (Vieira et al., 2001). Todas as medidas
so feitas em triplicata, onde se calcula a mdia e em seguida aplica-se a
frmula:

Abs
_________

Atividade especfica =
(U/mg)

x volume da cubeta

t (min)
__________________________________
NADH, AMP x vol. enzima na cubeta x [enzima]
A

onde:
t = min.
NADH= 6,22 mM-1 cm-1
AMP= 1,24 mM-1 cm-1
volumes expressos em mililitros (mL)

________________________________________________Materiais e Mtodos 56

A atividade especfica das enzimas (unidade/mg) calculada atravs

de medidas espectrofotomtricas da formao do produto (NADH) pela
diferena de absorbncia entre os tempos especficos de reao para cada
enzima.
Atravs da atividade especfica possvel calcular a porcentagem de
inibio da enzima GAPDH de T. cruzi (tabela 13, p. 61) e enzima APRT de
L. tarentolae (tabela 15, p. 65) frente aos extratos brutos testados. Pela
frmula:

% = 100 X U/mg (controle) U/mg (amostra)

U/mg (controle)

As enzimas foram armazenadas a 4C e utilizadas nos experimentos

nas concentraes de 0,3 mg/mL para GAPDH e 0,9 mg/mL para APRT .