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1) Calibracin, validacin e implementacin de las tcnicas analticas que permitan identificar cianobacterias y
cuantificar sus metabolitos en agua natural y potable; as como los mtodos para determinar las principales
caractersticas fisicoqumicas y microbiolgicas
2) Realizacin de un programa de muestreo y caracterizacin fisicoqumica y microbiolgica del agua cruda y tratada
3) Anlisis estadstico de resultados.
A continuacin se describen los materiales, reactivos y las tcnicas analticas empleados en el estudio.
Material y reactivos
Aguas a evaluar
Las muestras de agua a evaluar fueron recolectadas en: a) Homogeneizacin del agua cruda de la
PPLB, b) a la entrada y salida de sedimentadores, y c) a la salida de la Planta Potabilizadora Los
Las muestras, recolectadas por triplicado, se utilizaron para la medicin de los parmetros fisicoqumicos,
microbiolgicos y de los metabolitos de cianobacterias. A continuacin se describe la tcnica de recoleccin y
preservacin de cada parmetro.
Parmetros fisicoqumicos
Los parmetros fisicoqumicos determinados fueron: pH, temperatura, contenido de oxgeno disuelto, color, turbiedad,
fosfatos, nitritos, nitratos y slidos suspendidos totales.
Parmetros microbiolgicos
Determinacin de clorofila-a: Las muestras se recolectaron en frascos mbar de un litro, se llevaron en hieleras al
laboratorio y se conservaron a una temperatura de 4C, para evitar su descomposicin gradual.
Muestreo de organismos: Cada muestra se recolect por duplicado en frascos mbar de un litro. En la botella se
agregaron 20 mL de formol (J.J Baker CAS, 2106-2) al 36% (fijador de clulas). Estas muestras fueron llevadas en
hieleras al laboratorio para su observacin.
Metabolitos de cianobacterias
Parmetros fisicoqumicos
Las tcnicas analticas y los equipos utilizados para cuantificar los parmetros fisicoqumicos
Parmetros microbiolgicos
Determinacin de clorofila-a:
La determinacin de clorofila-a se realiz con base en la tcnica estandarizada propuesta por la Agencia de
Proteccin al Ambiente (EPA, por sus siglas en ingls), Mtodo 446 (1997). Esta tcnica est constituida por dos
etapas: a) extraccin y b) cuantificacin por mtodo espectrofotomtrico. A continuacin se describe cada etapa.
a) Extraccin de Clorofila-a:
Los pigmentos se extraen del concentrado planctnico con acetona acuosa y la absorbancia del extracto se
determina con un espectrofotmetro (HACH DR 2010).
Este procedimiento, que se describe a continuacin, se realiza con poca luz o sin luz, para evitar procesos de
degradacin de la clorofila-a y se utilizan tubos opacos o protegidos de la luz con papel aluminio.
Procedimiento:
La muestra se recolecta en una botella mbar y se analiza en un lapso mximo de 24 horas (o bien se almacena
refrigerada a una temperatura de 4C), siguiendo el procedimiento que a continuacin se describe:
1.
2.
Se verifica que los volmenes de las muestras de agua cruda y del sedimentador entrada sean de 200 mL, y
Se instala el dispositivo de filtracin (Figura 3.2) y se filtra la muestra con filtros (Whatman GF/F 0.7 m).
Despus de cada vertido siempre se agita la muestra, dada la gran capacidad de flotacin que poseen las
cianobacterias.
4.
La muestra concentrada en el filtro se puede guardar en refrigeracin en papel aluminio durante 3 semanas,
6.
Con pipeta graduada se agregan 3 mL de una solucin concentrada de acetona (90%, marca Sigma) y 0.2
La muestra se agita en vrtex durante 1 minuto y luego se ajusta el volumen a 10 mL con acetona.
8.
La muestra se macera durante 20 horas y se agita cada 3 horas para permitir el mximo contacto entre la
acetona y el papel.
9.
Se centrifuga el extracto durante 20 minutos en una centrifugadora modelo J-600, marca SOL-BAT a 2500
1.
ptica.
2.
Para calcular la concentracin de clorofila-a se lee la densidad ptica (DO) del sobrenadante a 664, 647 y
630 nm.
Metabolitos de cianobacterias
Determinacin de 2-MIB y GEO por SPME-GC-MS
En los anlisis para identificar y cuantificar los metabolitos causantes de olor y sabor terro-mohoso se utilizaron
estndares de 2-metilisoborneol con 98% de pureza, y para geosmina con 97% de pureza
La determinacin de los metabolitos 2-MIB y GEO, est constituida por dos etapas: a) microextraccin en fase slida
y b) cuantificacin por el mtodo cromatogrfico de gases acoplado a espectrometra de masas. Para la
cuantificacin se aplicaron dos etapas tanto a las muestras de agua recolectadas en la PPLB, como a soluciones
estndar diluidas en agua destilada y preparadas para obtener la curva de calibracin. Para las curvas de calibracin,
se prepararon soluciones en agua destilada a 5, 10, 20, 40, 80, 100 y 140 ng/L, y posteriormente se analizaron por
microextraccin en fase slida acoplada a cromatografa de gases con detector de espectrmetro de masas (SPMEGCMS por sus siglas en ingls).
En la etapa previa a la de micro-extraccin en fase slida, las muestras se recolectaron en frascos de 100 mL con un
volumen de muestra de 60 mL, se adicionaron con un embudo 15 g de NaCl (con 99.96% de pureza, marca J. T.
Baker) para incrementar la volatilizacin de los metabolitos y se agrega una barra magntica. Las muestras se
taparon para evitar la evaporacin de los metabolitos, se trasladaron en hielera y se dejaron en el cuarto fro del
laboratorio a una temperatura de 4C.
Al da siguiente, se realiz la etapa de micro-extraccin en fase slida, en una parrilla de agitacin se coloc el frasco
de la muestra y se introdujo el inyector, el cual tiene una fibra (Marca Supelco, 57348-U) de 50/30 DVB/CAR/PDMS (2
cm). Para que los dos metabolitos se adsorbieran en la fibra, con posterioridad, se agit magnticamente, de manera
vigorosa mediante una parrilla de agitacin (870 rpm), durante 30 minutos a 60C.
La desorcin se realiz en el cromatgrafo de gases al momento de inyectar, durante 5 minutos en modo splitless a
una temperatura de 250C; ste es un tipo de inyeccin de muestras en cromatografa de gases, apropiado para el
anlisis de trazas La descripcin de la tcnica se ilustra en la Figura 3.3 y los parmetros de operacin del
cromatgrafo de gases se muestran en la Tabla 3.3.
Muestras
60mL de agua
15g de NaCl
Desorcin
60C
CG-EM
Adsorcin
30min
60C
Adsorcin
Acondicionamiento
500mL de agua
HPLC
5 mL cloruro de metileno/acetato de
etilo
5 mL de MeOH
5 mL de2H
O
Concentracin
Rotavapor
Desorcin
5 mL de MeOH/H
2O al 30%
5 mL de MeOH/H
2O al 70%