PRACTICA No.

1
1. Tema: EXTRACCIN DE PROTENAS
2.

Objetivos:
-

Extraer protenas de material vegetal mediante un buffer de extraccin y

trituracin de este material para su posterior electroforesis.

Conocer el procedimiento o protocolo de extraccin.

Identificar la funcin de cada uno de los reactivos utilizados en la

extraccin.

3. Marco Terico
Preguntas para realizar el marco terico
a. Qu es un proteoma?
b. Qu tipo de roturas celulares se conocen y en qu consisten?
c. Cmo se realiza la rotura celular en vegetales con el fin de aislar protenas?
d. Qu reactivos se utilizan para las roturas celulares?
e. Qu tipo de tampn de extraccin vamos a utilizar?
f. Analizar el tampn de extraccin que lleva y averiguar para que sirve
g. A qu temperatura se realiza la extraccin de protenas? Por qu?
h. Por qu es un proceso corto, el de extraccin de protenas?
i. Para qu se utiliza la centrfuga?
j . Cules son las protenas solubles y cuales son insolubles?
k. Qu protenas vamos a obtener en la muestra proteica, solubles insolubles?
I. En qu temperatura es necesario mantener y guardar los extractos de protenas
vegetales?
4. Materiales y Mtodos
Tubos eppendorf
Guantes
Tris HCI
EDTA
Micropipetas
SDS
Mercaptoetanol
Mortero y pistilo
Centrfuga
Hielo
4.1. Preparacin de buffer de extraccin
(Calcular la cantidad necesaria de acuerdo al nmero de alumnos)

Tris HCI 1.5M a Tris HCI 50 Mm (0.3 mi en 20 mi de solucin).

EDTA 3 mg en 20 mi de solucin.

Mercaptoetanol 14.3 M a Mercaptoetanol 10 Mm (6.99 ul en 20 mi de

solucin).
Se afora 20 mi en una probeta con agua estril.

4.2. Procedimiento de Extraccin

5.

Pesar I g de muestra fresca, agregar nitrgeno lquido, si no hay, enfriar y

mantener en fro (con hielo) y triturar en un mortero en hielo.
Aadir 2.5 mi de buffer de extraccin.
Agregar 3ul de mercaptoetanol.
Centrifugar a 10.000 rpm durante 20 min. en fro.
Transferir el sobrenadante a un tubo limpio, rotular cada extracto.
Se guarda en el congelador las muestras para ser usadas posteriormente.

Resultados y Discusin

Describa los resultados de la prctica realizada y discuta cada una de las

observaciones
6. Conclusiones y Recomendaciones
Con el conocimiento derivado de sus observaciones, indique conclusiones y
recomendaciones.
7.

Bibliografa

PRESENTACION DEL INFORME DE LABORATORIO

-

Presentar el informe escrito a mano y debe exponerlo oralmente, y de modo

individual.

El informe debe contener todas las preguntas del marco terico y el anlisis del
protocolo con el uso de sus reactivos.

PRCTICA No. 2
1. Tema: PREPARACIN DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA ELECTROFORESIS
2.

3.

Objetivos:
-

Entrenar e instruir al estudiante sobre el uso, manejo y utilizacin de

materiales y reactivos para la adecuada preparacin de geles de
poliacrilamida para realizar un corrimiento electrofortico.

Diferenciar las caractersticas entre los geles de agarosa para DNA y

poliacrilamida para protenas

Introduccin:
Electroforesis en geles de poliacrilamida

La electroforesis de protenas en geles con una matriz de poliacrilamida, comnmente

denominada PAGE (Poiyacrilamide gel electrophoresis) es sin duda alguna de las
tcnicas ms ampliamente usadas para caracterizar mezclas complejas de protenas.
La electroforesis en poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico a
nivel de muestras pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de
protenas.
Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un medio que
tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es
proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor
carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin. Empleando geles de slice o de
acetato de celulosa y aplicando las protenas en una zona estrecha en torno a los
electrodos se pueden determinar diferentes cargas netas (carga total/masa) entre
protenas. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este mtodo pues la
migracin de las protenas en su seno no slo es proporcional a la carga neta sino
tambin al tamao y forma de las protenas.
Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son qumicamente
inertes transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperaturas y fuerzas
inicas.
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por accin
de un agente entrecruzados la bisacrilamida en presencia de un iniciador y un
catalizador.
Como iniciador se suele utilizar TEMED (N, N-tetrametiInediamina) y como catalizador
el ion persulfato (S2O8") que se aade en forma de persulfato de amonio.
La porosidad del gel es determinada por las proporciones de poliacrilamida.

En los sistemas discontinuos el primer tampn asegura la migracin de todas las

protenas en el frente de migracin provocndose la acumulacin de todas las que se
han cargado en el pocilio. La separacin realmente comienza a partir del momento en
el que el frente de migracin alcanza la frontera del segundo tampn.
Los dos geles, el stacking y el resolving, tienen caractersticas diferentes, tienen que
averiguar que caractersticas poseen cada uno y como se diferencian. Este sistema es
especialmente adecuado para analizar muestras diluidas sin perder resolucin.
Precaucin
La acrilamida es altamente txica y carcinognica en su estado lquido, pero tienen que
averiguar como es que se puede manipular y como hay que prevenir cualquier
accidente.

4. IVIarco Terico
a. Qu es la poliacrilamida y para que sirve?
b. Cmo hay que utilizar la acrilamida, bis acrilamida para que no resulte daina,
como se utiliza.
c. Semejanzas y diferencias entre los geles de poliacrilamida y geles de agarosa,
para qu se utiliza cada uno de los geles, que tipos de molculas se corren en
cada gel, por qu?
d. Cules son las condiciones necesarias para un buen corrimiento
electrofortico en geles de poliacrilamida?
e. Cmo se da la formacin del gel de poliacrilamida?
f. Clasificacin de PAGE
g. Analice todos los reactivos para realizar la electroforesis.
5.

Materiales y Mtodos

Cmaras electroforticas
Peines
Fuente de poder
Tampn de corrida
Acrilamida vs Bisacrilamida
5.1. Buffer de carga

5 mi de Bromofenol

1.5 mi de P-mercaptoetanol al 6%
10 g de sacarosa al 50%
1.5 g SDS al 6%
0.378 g de Tris HCI 0.125M pH 6.8

5.2. Buffer de

electroforesis

Tris base 5Mm

Glicina 250 Mm
SDS al 10%

5.3. Montaje del gel

Se limpia cada una de los cristales con etanol al 70% con papel toalla, que
no deje pelusa.
Una vez limpios se procede a montar los 2 cristales con un separador
plstico.
Se colocan en la cmara electrofortica por medio de pinzas plsticas
Se llena con buffer de corrimiento los espacio de la cmara.
Se conectan los electrodos a la cmara para empezar el corrimiento, se lo
debe hacer a 60V el primer gel y cambiar el voltaje a 100 cuando pase al
segundo gel.
Resolving

Gel

Stacking Gel
10 mi

10 mi

25 mi

5 mi

H2O

3.3

8.2

3.4

6.8

30% acril:bisacr

10

830 ul

1.7

1.5 M Tris pH 8.8

2.5

6.3

630 ul

1.25 Tris pH 6.8

10% SDS

0.1

250 ul

50 ul

100 ul

10% APS
TEMED

0.1

250 ul
10 ul

50 ul
5ul

100 ul

Para 2 geles

Para 4 geles

4ul
Para 2 geles

Para
geles

10 ul

Se tie el gel con la solucin de tincin y despus de 24h. se destie con la solucin
de destincin, Ver protocolos para preparar.
6. Resultados y Discusin
Describa los resultados de la prctica realizada y discuta cada una de las
observaciones.
7. Conclusiones y Recomendaciones
Con el conocimiento derivado de sus observaciones, indique conclusiones y
recomendaciones acerca de la adecuada preparacin de geles de poliacrilamida
para electroforesis.
8. Bibliografa