MICROSCOPIA Y TCNICAS MICROSCPICAS

Conceptos tiles en microscopa

Resolucin: capacidad de distinguir entre dos objetos muy prximos.
(http://www.carlostapia.es/fisica/resolucion_criterios_practica.html,
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitu
lo3_4.htm)

(Ernst Abbe, 1873)

d= resolucin en micrmetros
lamda= longitud de onda de la luz
n= ndice de refraccin del medio entre muestra y objetivo (el ndice
depende de la cantidad de enlaces del medio)
a= semiabertura objetivo
Disco de Airy: sucesin de anillos de luz concntricos con un mximo central,
causada por la difraccin de la luz que pasa por una abertura circular
(mientras ms pequea la abertura hay ms difraccin).

Criterio de Raylreigh: este criterio se basa en que podemos ver dos objetos
puntuales perfectamente separados cuando el mximo de luz de un objeto
cae en el mnimo de luz del adyacente, siendo la cada en contraste entre
los dos mximos de un 28%.
Funcin de dispersin de punto: respuesta de un sistema a un punto objeto:
mientras ms desenfocado est el punto de objeto, ms baja es la calidad
del sistema de imagen.

 Fluorforo: grupo funcional de la molcula que hace que sta sea

fluorescente. Absorbe energa de una longitud de onda especfica y la
vuelve a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda (es decir,
con menor energa).
Tcnicas microscpicas
Microscopa de contraste de fases
(http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_contraste_de_fases)
Permite ver clulas sin ninguna tincin aprovechando las diferencias entre los
ndices de refraccin de los componentes de una clula: la luz que pasa por los
sectores de mayor n se desva y queda fuera de fase respecto a las otras ondas.
Los anillos pticos del objetivo y del condensador anulan la amplitud de las ondas
que estaban fuera de fase y generan una imagen de mayor contraste.
Microscopia de superresolucin
(Vence limitacin impuesta por los discos de Airy)
(http://en.wikipedia.org/wiki/Super-resolution_microscopy)
o Tcnicas funcionales deterministas
SIM (Microscopa de iluminacin estructurada)
Consiste en crear secciones de muestras de fluorescencia en las que no haya luz
difusa, aumentando as su resolucin. Se ilumina con patrones de luz
determinados que se convierten en patrones de interferencia (moir) entre dos
cuadrculas.

Patrn de Moir

Una de las cuadrculas tomar la forma del patrn de luz, y la otra tomar la forma
del objeto marcado con fluorforos. De esta manera, podemos obtener la
informacin del objeto gracias al patrn de moir.
(http://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Learn-Explore/Centro-deInformacion/SIM , http://www.zeiss.es/microscopy/es_es/productos/sistemas-decaptura-de-imagenes/apotome-2-para-biologia.html)
otras tcnicas funcionales deterministas:
NSOM
ANSOM
NORM
4PI
SMI
o Tcnicas funcionales estocsticas

STED (Microscopa de deplecin por emisin estimulada, Premio Nobel

qumica 2014: Betzig, Hell y Moerner)
Desactiva fluorforos para aumentar resolucin. esto lo consigue a travs de la
emisin que ocurre cuando un fluroforo excitado se encuentra con un fotn
cuya cantidad de energa coincide con la diferencia que hay entre el estado
excitado y normal. Con esta interaccin el fluorforo vuelve a su estado normal
antes de que suceda la fluorescencia y se reduce la emisin de los fluorforos
que se encontraban lejos del mximo central. (http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/stedfundamentals/indexflash.
html)
PALM y STORM (microscopa de localizacin fotoactivada)
(http://en.wikipedia.org/wiki/Photoactivated_localization_microscopy)
Utilizan la activacin secuencial y blanqueo de los fluorforos para crear imgenes
de alta resolucin. De esta manera se obtienen numerosas fotos en las que
aparecen slo algunos fluorforos activos, y la superposicin de stas resulta en la
reconstruccin de una imagen completa que revela la posicin de las molculas
marcadas. (http://avances-tecnologicos.euroresidentes.com/2009/02/ipalmmiscroscopia-interferometrica-de.html ,
http://microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/storm/index.html)

otras tcnicas:
SPDM