PRCTICA 4

AMPLIFICACIN DE DNA MEDIANTE PCR-RAPD

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFECIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGA
LABORATORIO DE INGENIERIA MOLECULAR

PRCTICA 4
AMPLIFICACION DE DNA MEDIANTE PCR-RAPD

EQUIPO 1:
DIAZ BARROSO ARTURO
HERNANDEZ MENDOZA TAIDA V.
HERNANDEZ ORTEGA MONZERRAT
LPEZ GOMEZ SANDRA

GRUPO: 7AV2
PROFESOR:
GERARDO RODRGUEZ MUZ

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AMPLIFICACIN DE DNA MEDIANTE PCR-RAPD

9 MARZO DEL 2015

Contenido
1.

Introduccin.................................................................................................. 3

2.

Propsito de la prctica................................................................................ 4

3.

Marco Terico................................................................................................ 4
MAAP (Mltiples perfiles arbitrarios de amplificacin).....................................4
RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar)....................................................4
AP-PCR (PCR con oligonucletidos arbitrarios).................................................5

4.

Procedimiento............................................................................................... 6

5.

Discusin de Resultados............................................................................... 7

6.

Conclusiones................................................................................................. 9

7.

Anexos.......................................................................................................... 9

8.

Referencias................................................................................................... 9

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AMPLIFICACIN DE DNA MEDIANTE PCR-RAPD

1. Introduccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) cambi radicalmente los
mtodos de anlisis a nivel molecular. Para estimar la diversidad gentica, se
pueden amplificar mediante la PCR diferentes regiones del genoma y comparar
entre individuos, poblaciones o especies diferentes. En especies para las que
no se cuenta con suficientes datos genmicos previamente publicados, o bien
para las cuales se quiere obtener informacin gentica de manera rpida y
relativamente

econmica,

inespecficos.

Estos

se

pueden

marcadores

emplear

usan

marcadores

iniciadores

moleculares

(tambin

llamados

oligonucletidos o primers) que amplifican al azar diferentes regiones en el

genoma y generan un patrn de productos de PCR o huella gentica (Wolfe y
Liston 1998) que se visualizan mediante una electroforesis en geles de agarosa
o acrilamida. Los marcadores conocidos como RAPDs (del ingls Random
Amplified Polymorphic DNA o ADN polimrfico amplificado al azar) (Williams et
al. 1990) y a los ISSRs (de Inter-Simple Sequence Repeats o regiones
intermedias entre secuencias simples repetidas). Para fines de los estudios de
gentica de poblaciones, estos marcadores son marcadores dominantes, lo
cual significa que bajo el modelo de un locus con dos alelos, la presencia de
una

banda

representa

al

genotipo

dominante

(tanto

homcigo

como

hetercigo), mientras que una ausencia de la banda representa al genotipo

homcigo recesivo. Los RAPDs son una tcnica que consiste en la amplificacin
de segmentos de ADN con iniciadores pequeos (generalmente de 10
nucletidos de longitud) de secuencias aleatorias no-palindrmicas, con un
contenido de G + C entre 50 y 80%, (Lynch y Milligan 1994). La secuencia del
iniciador es elegida a priori de manera arbitraria y slo se utiliza un iniciador
por reaccin, que actuar al mismo tiempo como iniciador sentido y
antisentido. Los fragmentos obtenidos se visualizan como un patrn de bandeo
caracterstico del individuo y cada banda observada se considera un locus. La

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presencia o la ausencia de las bandas entre individuos se deben a cambios en

la secuencia (o a la prdida) de los sitios a los que se alinea el iniciador
(Navarro 1999). La insercin o eliminacin de nucletidos en la secuencia
intermedia entre los dos sitios de acoplamiento, aumentar o disminuir el
tamao de la molcula amplificada.

2. Propsito de la prctica
El propsito de la presente prctica es realizar la reaccin de PCR-RAPD
para amplificar segmentos al azar y analizar el patrn de bandeo
obtenido.

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3. Marco Terico
MAAP (Mltiples perfiles arbitrarios de amplificacin)
Trmino genrico acuado en 1994 con el que se designan las tcnicas que
emplean oligonucletidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas.

RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar)

Es una de las tcnicas ms verstiles desde que se desarroll en el ao 1990.
Se usa una coleccin de decanucletidos para amplificar por PCR reas
especficas distribudas al azar por el genoma. Su pequeez y la baja
temperatura de alineamiento (36C) aseguran que se unen a infinidad de
secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos fragmentos de
DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de agarosa para obtener
perfiles electroforticos que variarn segn el polimorfismo de los distintos
individuos o grupos de individuos, y proporcionarn una huella dactilar
caracterstica. Es muy cmoda, rpida, requiere poco DNA que adems no
necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la
secuencia,

se

pueden

distinguir

rpida

simultneamente

muchos

organismos. Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen

corresponder a DNA ligado a algn carcter, sino redundante, y que no da
informacin sobre el nmero de copias que el DNA genmico contiene de la
secuencia amplificada. Esta tecnologa ha sido utilizada para la catalogacin de
frutos, seleccin de variedades, y diferenciacin de lneas clonales. Tambin se
est utilizando para el anlisis de las variedades de apio, uva, limn y olivo.

AP-PCR (PCR con oligonucletidos arbitrarios)

La idea es similar a la de la RAPD, desarrollndose a la vez que sta, aunque se
cambia el diseo de los oligonucletidos y el tipo de PCR. Los oligonucletidos
han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja
astringencia (poco especficos) que permite la polimerizacin de una batera de
fragmentos caractersticos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de
alta astringencia para amplificar (visualizar) especficamente las bandas

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anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden migrar en un gel de

agarosa para observar las grandes diferencias entre especies, o bien se puede
marcar radiactivamente y migrar en gel de poliacrilamida para obtener
resultados mucho ms finos y precisos. Existe una variacin denominada DAF
(Huellas dactilares por amplificacin de DNA) que utiliza oligonucletidos de 5 a
15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difciles
de interpretar.

4. Procedimiento Experimental
Se program el termociclador de la siguiente forma: 95C 8min; 95C 1min,
45C 1min, 72C 2min (40 ciclos); 72C 15min; Almacenamiento 4C.
Se prepar la mezcla de reaccin en tubos de microensayo de 0.5mL, en
condiciones de esterilidad con: Amortiguador de amplificacin 10X (3l), MgCl2
(16mM), dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1.5mM c/u), Primer 1nM, Agua desionizada y
esteril c.b.p (20l).
Se agregaron de 20-50 ng de DNA de pepino.
Posteriormente se aadi una gota de aceite mineral estril a cada tubo, y se
colocaron en el termociclador calentado a 90C, 1 min.
Despus se adicionaron 1.5 unidades de la enzima Taq polimerasa, una vez
adicionada la enzima se colocaron los tubos en el termociclador y se corri el
programa.

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Electroforesis en gel

Se prepar un gel de agarosa al 3% con TE y se sumergi dentro del tanque de

la cmara llena del regulador TAE. Se colocaron las muestras de PCR,
procurando no tomar el aceite y se mezclaron con 7l de colorante de
corrimiento y cargaron los pozos de gel con la mezcla. Dejar un pozo para el
marcador de PM. y otro pozo para una muestra de DNA sin amplificar.
Se tap la cmara y desarrollar la electroforesis a 100 mV, 30min y se
revelaron las bandas obtenidas con luz UV.

5. Discusin de Resultados
a) Anlisis Practica
En la obtencin de resultados de esta prctica, por razones que se intentan
explicar a continuacin, no se obtuvieron evidencias a analizar; por esta razn
para efectos del anlisis de la Amplificacin de DNA mediante PCR-RAPD,
tambin se muestra el anlisis de resultados de un estudio realizado sobre: la
amplificacin de DNA polimrfico mediante RAPD para detectar el efecto
genotxico de metales pesados.
Las principales ventajas del mtodo RAPD es su rapidez, la aplicabilidad a
cualquier organismo (ya que no se requiere ninguna informacin sobre la
secuencia de nucletidos, ciclo celular o cromosoma) y la sensibilidad para
detectar una amplia gama de dao en el ADN y las mutaciones. Sin embargo,
RAPD es un mtodo cualitativo y la naturaleza y cantidad de los efectos de ADN
slo se puede especular.
La reaccin de PCR es muy sensible a cambios de iones, temperaturas,
contaminantes que pueden estar en el ADN o en el agua. Una de las
desventajas de esta tcnica es la contaminacin cruzada: a pesar de la
extremada sensibilidad de PCR, la cual es una de las ventajas principales,
existe riesgo de resultados falso-positivos. En teora, una sola molcula del

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producto previa a una amplificacin puede contaminar muestras negativas en

una amplificacin subsecuente.
Otra gran desventaja que puede afectar en la obtencin de resultados, es la
inestabilidad de este reactivo. Este problema aumenta en climas donde la
temperatura es alta. En cuanto al DNA es realmente estable a temperatura
ambiente cuando es seco y el tiempo de vida media de la Taq DNA polimerasa
es prolongada si se mantiene en frio.
Una recomendacin que hacen otros estudios para la obtencin de resultados
positivos, es hacer la mezcla del PCR lo ms homognea posible. Una causa
muy comn de errores se encuentra aqu, el congelar y descongelar cambia las
concentraciones de los reactivos y/o forma gradientes dentro de los tubos, y al
homogeneizarlos se asegura obtener resultados reproducibles. Ya preparados,
los tubos deben mantenerse en hielo o a 4 C hasta meterlos al termociclador,
para evitar que la polimerasa sintetice fragmentos inespecficos.
Cuando no se obtiene nada el problema puede estar en el ADN que puede
estar contaminado con protenas o alguna sustancia que inhibe la reaccin de
PCR.
La polimerasa necesita de iones de magnesio para funcionar adecuadamente
(MgCl2 permite

aumentar

la

intensidad

de

las

bandas

una

mejor

visualizacin) pero mucho magnesio inhibe a la polimerasa, y poco puede

generar productos inespecficos.
Revisar los oligonucletidos ya que podran estar degradados, defectuosos, mal
diseados o incluso que la cantidad utilizada no sea la correcta. Si hay mucha
cantidad aumenta el rendimiento del PCR, pero podran formarse productos
inespecficos, y si se agrega an mayor cantidad los oligos pueden formar
dmeros, en vez de unirse al ADN, y eso impide la amplificacin del producto. Si
se utiliza muy poco, podra tener mayor especificidad en el producto, pero
puede suceder que no veremos el amplificado (pues baja el rendimiento), as
que es necesario encontrar el ptimo para cada reaccin.

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Es muy frecuente que los PCRs se contaminen. Para monitorearlo, siempre hay
que trabajar con un control negativo: un tubo extra al que se le agreguen todos
los reactivos utilizados en el PCR, excepto ADN. Si en esta muestra hay
amplificacin significa que en algn reactivo hay restos de ADN o de producto
de PCR que est contaminando el experimento. Si esto sucede, consideramos
que lo ms fcil es deshacerse de todas las alcuotas sospechosas (por eso es
importante preparar alcuotas de todos los reactivos) y tomar alcuotas nuevas.
Para prevenirlo sugerimos algunas medidas que podran ser de utilidad: los
productos de PCR son frecuentemente los que contaminan, al ser molculas de
tamao muy pequeo y al estar tan concentradas es fcil que una gotita de
producto quede en una pipeta (las pipetas absorben el lquido por aspersin y
las gotitas quedan regadas como si fueran spray); al preparar una mezcla
posteriormente, esto contamina alguno de los reactivos que se utilizan. Para
evitarlo existen puntas con filtro y pipetas especiales, pero son caras. Tambin
existen cabinas con luz UV y flujo laminar, aunque tambin son caras. La luz UV
forma dmeros de pirimidina entre las dobles cadenas de ADN, por lo que estas
molculas se vuelven imposibles de amplificar. Por otro lado, el flujo laminar
evita contaminacin de un tubo a otro, y es til sobre todo si se trabaja con
plsmidos o reamplificando productos de PCR ya que las molculas pequeas
son altamente contaminantes. Sugerimos tambin separar las reas de trabajo
(la zona de preparacin y la zona de amplificacin; si no es posible, limpiar
muy bien la zona con alcohol antes de preparar la mezcla del PCR, y trabajar
siempre sobre un papel) y tener un juego de pipetas exclusivo para trabajar la
mezcla para la reaccin de PCR, separadas de las pipetas con las que se
manejen los productos de PCR ya amplificados. Otra fuente de contaminacin
es el ADN que amplificamos, aqu el problema puede ser sobre todo los dedos,
al abrir y cerrar los tubos. La sugerencia ms comn es utilizar guantes.
Tambin sugerimos agregar el ADN al final en cada tubo, si es posible utilizar
una pipeta slo para el ADN, y si no hay, tener mucho cuidado y limpiar muy
bien las pipetas despus de agregarlo. Tambin se evita la contaminacin si se
guardan en lugares y/o cajas distintas los reactivos del PCR, las muestras de
ADN y los productos de PCR.

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Otra sugerencia es utilizar material que haya sido esterilizado en autoclave

para que est libre de ADN y de nucleasas. Esta es una medida muy comn,
pero se pueden tener contaminaciones provenientes del agua de la autoclave,
tambin se puede descontaminar utilizando luz ultravioleta en las pipetas;
Adems del control negativo que nos permite visualizar posibles casos de
contaminacin, una vez que se ha ajustado el protocolo de PCR es siempre
recomendable incluir un control positivo. ste es un tubo que contiene ADN de
una muestra que haya amplificado adecuadamente y cuyo patrn de bandas es
conocido. De esta manera, puede esperarse que si la reaccin se llev a cabo
correctamente, esta muestra siempre salga. En caso contrario, si el PCR no
gener bandas en ninguna de las muestras, ni siquiera en el control positivo,
puede suponerse que el error radica en que no se agreg algn reactivo o bien
que los ciclos de temperatura no se llevaron a cabo adecuadamente, ya sea
por problemas de la mquina o bien por error al elegir el programa de
amplificacin.
b) Anlisis del artculo

Figura 1 Optimizacin de RAPD-PCR

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Figura 2 RAPD derivado de las plantas de rin de frijol tratado con metales pesados

Figura 3 RAPD derivado de las plantas de rin de frijol tratado con metales pesados

El estudio del artculo Aplicacin de RAPD para detectar el efecto genotoxico de

los metales pesados, busca evidenciar la genotoxicidad de ciertos los metales
y de qu forma modifica la huella gentica, en este caso de la planta de frijol. Y
esto se puede decir que es una de las muchas aplicaciones que tiene el RAPD.
El estudio se realiz con cadmio, plomo y

manganeso, que son metales

pesados y son conocidos por ser genotxicos, es decir que se distinguen por
modificar a los cromosomas y con ello las caractersticas del individuo.

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En la figura uno se muestra la comparacin, de la banda 4-9 del ADN del frijol a
diferentes concentraciones y con ello la influencia del mismo que podra
producir en una PCR, por lo que observamos que a mayor concentracin de
ADN hay mayor concentracin en cada una de las bandas y por ello el grosor
de cada una es mayor.
En los resultados se log evidenciar que la huella gentica del frijol tiene 77
bandas, de las cuales se modifica su cantidad en las plantas de frijol
suministradas con los metales pesados anteriormente nombrados. Las plantas
a las que se les suministr 350mg/l se encontraron la aparicin de 22 bandas y
desaparecieron 34 bandas que se presentaban en la huella original, de igual
forma a la concentracin de 150mg/l aparecieron 18 bandas. La modificacin
gentica se hace ms evidente en que hay una disminucin en el crecimiento
de la raz en un 50-70% adems de que se presenta una deficiencia de clorofila
(clorosis).

6. Conclusiones
Para estimar la diversidad gentica, se pueden amplificar mediante la PCR
diferentes regiones del genoma y comparar entre individuos, poblaciones o
especies diferentes.
Empleando marcadores moleculares inespecficos. Estos usan iniciadores
(tambin llamados oligonucletidos o primers) que amplifican al azar diferentes
regiones en el genoma y generan un patrn de productos de PCR o huella
gentica que se visualiza mediante una electroforesis en geles de agarosa o
acrilamida.
La reaccin de PCR es muy sensible a cambios de iones, temperaturas,
contaminantes que pueden estar en el ADN o en el agua. Una de las
desventajas de esta tcnica es la contaminacin cruzada. Otra fuente de
contaminacin es el ADN que amplificamos, puede ser la contaminacin por
nuestras manos, al abrir y cerrar los tubos. Generando el anlisis se puede
suponer que el error radica tambin en que no se agreg de manera correcta

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algn reactivo o bien que los ciclos de temperatura no se llevaron a cabo

adecuadamente, ya sea por problemas de la mquina o bien por error al elegir
el programa de amplificacin.
En el artculo analizado se busc evidenciar la genotoxicidad de ciertos

los

metales y de qu forma modifica la huella gentica de la planta de frijol. Y esto

se puede decir que es una de las muchas aplicaciones que tiene el RAPD.

7. Anexos
Cantidades de la Reaccin
Amortiguador 3 l
DNTPs
Factor de dilucin: 2/15= 13.3 l

30 l
=2.25 l
13.3 l
MgCl2: Marca Sigma Catalogo M8 787-1
Factor de dilusin: 25 Mm/10=2.5 Mm

30 l
=12 l
2.5
Primer

30 l
=0.6 l
50 l
DNA

30 l
=0.6 l
50 l
Preparacin de la Mezcla

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Amortiguador
DNTPs
Primer
DNA
Taq Polimerasa
MgCl2
Agua
Total

3 l
2.25 l
0.6 l
0.6 l
1.5 l
12 l
10.05 l
30 l

8. Referencias
Yeates,C., METHODS FOR MICROBIAL DNA EXTRACTIOM FROM SOIL FOR PCR
AMPLIFICATION, 1998
Miller,

D., EVALUATION AND OPTIMIZATION OF DNA EXTRACTION AND

PURIFICATION PROCEDURES FROM SOIL AND SEDIMENTS SAMPLES, 1999

Clria, J., HERRAMIENTAS BSICAS DE ANLISIS GENTICO,
Afseth

G.1997.

PCR

primer,

stategies

to

improve

results

http://www.biotechlab.nwu. edu/pe/ , accesado 08/03. Casas Ciria F.J, 2003.

Microbiologa

qumica

en

la

http://www.microbiologiaclinica.com/generalidades.htm, accesado 08/01.

www