INDICE

Pg.
I.

CUIDADOS EN EL LABORATORIO

02

II.

AMINOCIDOS Y PROTEINAS

04

01. Titulacin potencio mtrica de los aminocidos

04

02. Separacin e identificacin de aminocidos por electroforesis

09

03. Separacin de aminocidos por cromatografa

13

04. Determinacin del punto iz elctrico de una protena

17

05. Protenas: separacin y caracterizacin

20

06. Dosificacin de protenas de la leche por el mtodo fotocolorimtrico del Biuret

23

07. Ensayos con protenas

29

III. ENZIMAS

30

08. Enzimas: amilasa salival

30

09. Estudio de la polifenoloxidasa (ppo) extrada de la papa

33

10. Enzimas y su desempeo en los alimentos (CHO)

37

IV. CARBOHIDRATOS

39

11. Identificacin de carbohidratos

39

12. Polisacrido - aislamiento e hidrlisis

44

V.

46

LPIDOS

13. Qumica de los lpidos

46

14. Determinacin del valor de acidez de una grasa

51

15. Extraccin y caracterizacin de lpidos

54

VI. BIBLIOGRAFA

56

I - CUIDADOS EN EL LABORATORIO
1. Ejecucin de los trabajos prcticos
- Realizar todas las prcticas con atencin, rigor tcnico y disciplina.
- La falta de observacin de cualquiera de los requisitos tcnicos puede llevar a
errores que invalidan, parcial o totalmente, el trabajo realizado, sin llevar en
cuenta el desperdicio de material, reactivos y tiempo.
- Para que el alumno alcance la eficiencia deseada es necesario que el mismo sea
puntual, asista los laboratorios, ordenado, aseado y tenga conocimiento previo
del trabajo a ser ejecutado.
- Ser exigido de los estudiantes el mximo de cuidado con su local de trabajo y
con el respectivo material.
- Terminada la prctica, el estudiante deber proceder a la limpieza de su local y
material, dejndolo completamente limpios y en condiciones de ser nuevamente
utilizado.
- Colocar sobre el mesn solamente el material estrictamente necesario como
lpiz, borrador, lapicero, regla, gua de laboratorio. Dejar los bolsos y otros
objetos fuera del mesn donde ser realizado el trabajo prctico.
- No gastar soluciones intilmente. Retirar solamente la cantidad que va a
necesitar.
- No realizar experiencias "extras" en el laboratorio a ttulo de curiosidad. Los
"juegos" pueden llevar a riesgos inesperados.
2. Prevencin de accidentes
Todo laboratorio qumico es normalmente sitio de accidentes, la mayora de
pequea importancia, pero algunos de graves consecuencias, causados por
descuido o falta de atencin en el trabajo. En el sentido de prevencin de
accidentes desnecesarios, se recomienda la observacin rigurosa de las
precauciones indicadas a seguir:

- Trabajar siempre protegido por la bata.

- No fumar dentro del laboratorio.
- Al prender el mechero, tener el cuidado de no abrir la llave del gas antes de que
tenga a la mano la llama que debe prender el gas.
- No trabajar con sustancias inflamables (alcohol, ter) en las proximidades de la
llama.
- Jams calentar un sistema completamente encerrado.
- Es peligroso calentar o mezclar cualquier especie de reactivos prximo al rostro.
- Mantener el rostro tan lejos posible durante las operaciones de calentamiento o
de mezcla de reactivos.
- Evitar montajes no estables de aparatos, como: soporte de libros, lpiz, caja de
fsforos, etc.
- No degustar nada en el laboratorio, excepto sea especialmente orientado para
hacerlo.
- Al verter un lquido del frasco, evitar que escurra en el respectivo rtulo,
debiendo protegerlo debidamente.
- Los reactivos txicos o corrosivos, como lcalis o cidos, fuertes (cuando muy
concentrados), no debern ser medidos por pipetas pero medidos en probetas o
en algunos casos, en buretas, o con ayuda de una pera.
- Al transferir o manipular sustancias que desprendan humos txicos, hacerlo en
el interior de una campana extractora de gases o entonces en un local con buena
ventilacin.
- cido sulfrico concentrado debe ser adicionado al agua y no lo contrario.
- Para calentar soluciones, nunca utilizar, como recipiente, un frasco volumtrico.
- En caso de dudas en la ejecucin de cualquier trabajo prctico, buscar siempre
el instructor.

II. AMINOACIDOS Y PROTEINAS

1.TITULACION POTENCIOMETRICA DE AMINOACIDOS
I. OBJETIVOS
- Construir con datos experimentales la curva de titulacin de un aminocido.
- Establecer grficamente el punto ISOELECTRICO de los aminocidos.
- Interpretar correctamente la curva de titulacin de los aminocidos.
II. INTRODUCCION
Todos los organismos vivos contienen - aminocidos, los cuales comparten la
misma columna estructural.
tomo de carbono-
H3N+
Grupo - amino

COOGrupo - carboxlico

Se puede concluir que este tipo de estructura tiene 3 caractersticas comunes:

- Posee un grupo carboxilo . La letra alfa indica que este grupo est unido al
tomo de carbono central o alfa.
- Posee un grupo alfa amino.
- Contiene una cadena lateral o grupo R, que est enlazada con el carbono alfa.
Todos los aminocidos pueden clasificarse como cidos, neutros o bsicos, segn
sea la carga del grupo R a pH = 7.
Los grupos R cidos son portadores de una carga negativa a pH = 7 porque son
poderosos dadores. Los 2 alfa aminocidos cidos son el asprtico y el glutmico.
Los grupos R, bsicos llevan una carga positiva a pH = 7 porque reciben protones.
Los 3 alfa aminocidos bsicos comunes son la lisina, arginina e histidina.

Los aminocidos tienen un marcado carcter anftero debido a la coexistencia en

una misma molcula de grupos cidos y bsicos que se pueden disociar
dependiendo del pH.
En solucin cida, los aminocidos se encuentran en la forma con carga neta
positiva, y en la solucin alcalina en la forma con carga neta negativa segn
lo muestra la figura 1.

C
COOH

NH2

Forma no disociada

C COO
NH3+

OH

In doble

OH-

C COO
NH2

Forma cida
( predomina en medio bsico)
H

R C COOH

NH3+
Forma bsica
( predomina en medio cido)
Figura 1

A pH comprendido entre los 2 pKa, el aminocido se encuentra en la forma de

zwitterion o de un in doble que es la forma en que cristaliza y la que se obtiene al
disolverlo.
Cuando se titulan los aminocidos con NaOH y HCl puede observarse dos
mesetas cuyos valores corresponden a los pKa de los grupos alfa carboxilo y alfa
amino respectivamente, segn figura 2.
El punto de inflexin en esa figura corresponde al punto isoelctrico del
aminocido, pH al que las especies no aportan carga neta y por lo tanto, no migra
en un campo elctrico.

Figura 2
pH 14

14 pH

0
10

0
5

meq HCl consumidos

10

meq NaOH consumidos

Complete la siguiente grfica. Determine el pI del aminocido representado.

pH

14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

pKa3 = 11,8

pKa2 = 3,9
pKa1 = 2,1
10

20
40
Meq de NaOH 0,1 M

III. REACTIVOS
L- alanina 0,1 M

60

L- cido asprtico 0,1 M

L- arginina 0,1 M
L- glicina 0,1 M

Buffers estandarizados pH 3 y pH 9

IV. MATERIALES
Potencimetro
2 vasos de precipitados (50 y 100 ml)
1 agitador magntico

1 bureta (50 ml)

1 soporte de bureta
1 varilla de vidrio

V. MATERIAL DE PRUEBA
Soluciones de aminocidos
VI. PROCEDIMIENTO
1. Calibracin del potencimetro
Calibrar el potencimetro con dos soluciones estandarizadas.
2. Determinacin de un punto isoelctrico de un aminocido.
En un vaso de precipitados, medir 50 ml de una solucin de aminocidos (alanina,
arginina y asprtico). Medir el pH inicial del aminocido.
Proceder a titular con HCl 0,1 M adicionando lentamente y tomando el pH despus
de cada adicin, hasta que se haya consumido ms de 10 ml de cido.
Desechar el titulado, lavar el vaso y medir nuevamente 50 ml del mismo
aminocido y repetir el procedimiento con NaOH 0,1 M.
En el caso del cido asprtico se debe continuar adicionando NaOH hasta que se
hayan consumido ms de 20 ml de lcali.
Con los datos del pH frente al de los miliequivalentes (2ml = 1 mEq) de cido o
base consumidos, hacer figuras en las que el pH se grafique en las ordenadas y en
las abcisas, los miliequivalentes de cido (hacia la izquierda) y lcali (hacia la
derecha) consumidos. A partir de la figura, determinar el pH en el punto
isoelctrico (pI) y los valores de pK del aminocido con cido y con base.
VII. CONSULTA
a) Registrar en una tabla los resultados obtenidos.
b) Dibujar y determinar el pI del aminocido.

c) Determinar el pI de los aminocidos que aparecen en la tabla No. 1.

TABLA 1
Aminocido

pK1

pK2

pk3

Glicina
Alanina
Glutmico
Histidina
Treonina
Lisina
Asprtico

2,4
2,3
2,2
1,8
2,6
2,2
1,9

9,7
9,9
4,3
6,0
10,4
9,2
3,6

_
_
9,7
9,2
_
10,8
9,6

d) Determinar el pI de los siguientes aminocidos:

- Valina
- Triptfano
- Metionina

2. SEPARACION Y IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS POR

ELECTROFORESIS
I.

INTRODUCCION

La electroforesis es una tcnica analtica de separacin fundamentada en la

migracin de partculas cargadas cuando sobre la accin de un campo elctrico. Es
una tcnica utilizada para la separacin de mezclas de compuestos biolgicos,
siendo muy eficiente en la separacin de mezclas de aminocidos, pptidos o
protenas.
Sistema bsico de electroforesis
soporte

+ nodo

ctodo -

solucin tampn

solucin tampn

Fuente de alimentacin (Amperagen/Voltagen)

Una diferencia de potencial es establecida entre dos cubas, conteniendo solucin

tampn, por la conexin de dos electrodos a una fuente de alimentacin
(amperagen/voltagen). El circuito es completado por una tira de material poroso
saturado con solucin tampn (soporte) que tiene las extremidades sumergidas en
cada cuba. Compuestos cargados positivamente, en el pH de la solucin tampn
conocida irn migrar a travs del soporte para el ctodo (electrodo negativo),
compuestos cargados negativamente irn migrar para el nodo (electrodo positivo)
y compuestos elctricamente neutros permanecern en el punto de aplicacin
(origen). Estos movimientos pueden ser influenciados por la intensidad de corriente
elctrica, por la carga lquida de las molculas, por la forma y tamao de las
molculas, y por electrosmosis (dependiendo del soporte). La carga lquida de un
aminocido en un dado pH es una funcin de los valores de pK de sus grupos
ionizables. En una solucin con pH que corresponde al punto isoelctrico del
aminocido (pH en el cual el numero de cargas positivas se equivalen al numero de
cargas negativas) el aminocido se presenta elctricamente neutro y no hay
migracin en campo elctrico. El mismo comportamiento es presentado por
pptidos y protenas, donde todos los grupos ionizables de sus radicales
contribuyen para la carga total de la molcula.
Tipos de soportes ms usados en electroforesis de aminocidos y protenas: papel
de filtro, acetato de celulosa, gel de almidn y de policriamida.
II.

OBJETIVOS

- Separar una mezcla de aminocidos e identificar los componentes de la mezcla

por comparacin con estndares.
- Comprender sus propiedades inicas a travs del comportamiento
electrofortico de los aminocidos.
III. MATERIAL
- Tampn de cido actico/acetato
(pH 4,6)
- Solucin
de
glicina,
cido
asprtico, arginina y mezcla de
estos aminocidos
- Solucin de ninhidrina en acetona

Tiras de papel de filtro (2 x 15 cm)

Tubos capilares
Nebulizador
Estufa
Aparato de electroforesis

IV. PROCEDIMIENTO
- Marcar el centro de la tira de papel con una lnea sombreada a lpiz.

10

- Identificar una extremidad como polo + y la otra como polo -.

- Escribir el nombre de la muestra a ser aplicada en una de las extremidades del
papel.
Ejemplo: tira de papel donde ser aplicada una solucin de glicina
-

Gly +
lnea de aplicacin de la muestra

Cuidado!! Evite tocar con los dedos el papel.

- A seguir, aplicar la muestra (solucin de aminocidos) con ayuda del tubo
capilar, a lo largo de la lnea sombreada, buscando evitar que la solucin de
aminocidos se derrame en el papel.
- Repetir la aplicacin por ms dos veces.
Ejemplo:

rea de aplicacin de la muestra: mximo 0,5 cm de cada

lado de la lnea de cada
lado de aplicacin segn
esquema

Gly +
lnea de aplicacin de la muestra

- Dejar secar al aire.

- Embeber la tira en solucin tampn retirando el exceso con papel higinico.
- Colocar la tira de papel en el aparato de electroforesis, siendo que las
extremidades de la tira deben permanecer mergulladas en la solucin tampn
contenida en las cubas.
- Prender el aparato manteniendo el voltaje en 300V por hora.
- Retirar el papel y llevar a la estufa hasta que est seca.
- Pulverizar con solucin de ninhidrina (revelador de aminocidos) la tira de
papel.
- Llevar nuevamente a la estufa.
- Observar el surgimiento de lneas de color violeta evidenciando la migracin de
los aminocidos a lo largo de la tira de papel.
- Despus de la revelacin, identificar los componentes de la mezcla por
comparacin con los estndares.

11

- Explicar el comportamiento inico de cada aminocido en las condiciones

establecidas.
3. SEPARACION DE AMINOACIDOS POR

CROMATOGRAFIA
I. INTRODUCION
La identificacin de sustancias orgnicas tiene despertado el inters de los analistas
en el sentido de aprimorar tcnicas conocidas y desarrollar nuevos mtodos de
anlisis cada vez ms rpidos y eficientes.
La cromatografa es una tcnica de separacin de sustancias afines que tuvo sus
primeros ensayos hechos por el botnico ruso Tswett en 1900. An, solamente en
1906 que este investigador consigui la separacin de pigmentos de hojas. La
tcnica iniciada por Tswett para la separacin de sustancias coloreadas (cromos color) tambin es vlida para sustancias incoloras, desde que haya un revelador.
Este invento qued 25 aos olvidado, cuando en 1931 dos otros investigadores,
Kuhn y Lederer, usando la tcnica de Tswett conseguirn aislar el y -caroteno
de otros pigmentos foliares.
La cromatografa tiene evolucionado desde entonces y hoy contamos con diversas
tcnicas tales como:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa delgada
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin molecular
Cromatografa de fase gaseosa y lquida
Genricamente, podemos decir que los componentes de la mezcla son distribuidos
en dos fases, una estacionaria y otra mvil. La separacin puede ser efectuada de
tres modos:
Adsorcin: los componentes son diferencialmente retenidos en la fase
estacionaria por fuerza fsica superficial
Particin: los componentes son distribuidos entre un lquido existente en el
soporte slido (fase estacionaria) y otro en la fase mvil.
Intercambio inico: cuando se forman interacciones inicas entre la fase
estacionaria y el compuesto que se desplaza con el solvente (fase mvil).

12

La separacin es fundamentada en el coeficiente de particin entre las dos fases

(estacionaria y mvil). El coeficiente de particin () es definido como la relacin
entre la concentracin del soluto en la fase estacionaria y la concentracin del
soluto en la fase mvil.
S E
=

S M

En la cromatografa en papel y en capa delgada la distancia recurrida por la

muestra relacionada con la distancia recurrida por el solvente, nos da origen a un
factor llamado Rf, que es constante para una sustancia en las mismas condiciones
de trabajo.
Distancia recurrida por la muestra
Rf = ----------------------------------------------------------Distancia recurrida por el solvente
Rf 1
II. CROMATOGRAFIA EN PAPEL
Es un tipo de cromatografa que se basa en la particin lquido / lquido. El papel
acta como soporte para la fase estacionaria lquida (H 2O del papel). El papel debe
ser uniforme, o sea, sus fibras distribuidas en el mismo sentido; ser puro, con
ausencia de sustancias no celulsicas, siendo que el mas usado es el Whatman no. .
El solvente es escogido segn su polaridad. En orden creciente de carcter polar
tenemos: ter de petrleo, ciclo-hexano, benceno, n-butano, n-propano, H 2O y
piridina. En general se trabaja con un sistema de solventes que estn en
proporciones definidas. La muestra aplicada se distribuir de acuerdo su afinidad
por el H2O del papel (fase estacionaria) y el sistema de solvente (fase mvil).
La migracin de las sustancias podr ser ascendente donde verificase actuacin de
la fuerza de capilaridad, o descendente donde acta la fuerza de gravedad. La
migracin en una sola direccin es denominada corrida unidireccional. Podemos
tambin utilizar la corrida bidireccional. El solvente desplaza primero en una
direccin, se seca el papel, se da en el mismo un giro de 90, colocndolo
nuevamente en una cmara cromatogrfica con otro sistema de solvente diferente
del primero.

13

III. OBJETIVO
- La presente tcnica tiene como objetivo capacitar al alumno a ejecutar una
corrida cromatogrfica en papel.
- Calcular el Rf, interpretar el cromatograma e identificar las muestras.
IV. MATERIAL
- Papel de filtro (Whatman no. 1)
- Muestra (solucin de aminocidos)
- Soluciones
estndar
de
aminocidos (0,1 M)
- Solvente: mezclar en volmenes
100 partes de n-butanol, 30 partes
de cido frmico y 25 partes de
agua.

- Revelador: solucin de ninhidrina

al 0,1% en acetona
- Cmara cromatogrfica
- Tubos capilares
- Estufa a 100C
- Nebulizador

Nota: Evite tocar el papel con la mano.

V. PROCEDIMIENTO:
- Cortar el papel con las dimensiones 15 x 15 cm.
- Trazar con lpiz al largo de una de las extremidades a 2,5 cm de las bordas.
- Marcar puntos distintos con distancias adecuadas a lo largo de la raya para
aplicacin de la muestra y de los estndares.
- Aplicar crculos de solucin de aminocidos de 0,5 cm de dimetro usando
tubos capilares.
- Con auxilio de una grapadora dar la forma cilndrica al papel.
- Introducir el cilindro de papel en la cmara cromatogrfica, teniendo el cuidado
de no dejar el solvente tocar en las manchas formadas en los puntos de
aplicacin de las muestras.
- Sellar la cmara y dejar que el solvente se desarrolle hasta 1 hora o hasta
alcanzar 1 cm de la extremidad superior del papel.
- Retirar el cilindro de papel y marcar con lpiz la altura alcanzada por el solvente
(frontera del solvente).
- Dejar secar en estufa .
- Revelar con ninhidrina al 0,1% en acetona y secar. Despus de secado
aparecern las manchas que sealan la presencia de los aminocidos.
- Identificar los aminocidos de la muestra por comparacin con los estndares y
calcular los Rfs.
- Conclusin e interpretacin.

14

Nota: Evitar que la ninhidrina toque en su piel.

4. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE UNA

PROTENA
I. OBJETIVO Hallar el punto isoelctrico de la casena.
II. TEORIA
Las unidades fundamentales de una protena son los aminocidos, los cuales
contienen en sus molculas grupo amino y grupo carboxilo; por lo tanto tienen
propiedades cidas y bsicas.
Los aminocidos de las protenas se pueden obtener por hidrlisis cida o
enzimtica. Estos aminocidos son fcilmente solubles en agua y existen como
iones bipolares conocidos como zwitterion, no como molculas ionizadas.
Dependiendo del pH de la solucin, los aminocidos pueden tener carga positiva,
negativa o neutra; igual comportamiento tiene las protenas.
Existe un pH en el cual los aminocidos y las protenas forman especies sin carga;
en este valor de acidez estas molculas no migran en un campo elctrico, y este
valor se le llama punto isoelctrico o pH isoelctrico.
En el pH isoelctrico las protenas tienen la menor solubilidad, conductividad,
presin osmtica y la menor viscosidad.
III. REACTIVOS
- 0,25 g de casena
- NaOH 1N

- CH3COOH

IV. MATERIALES
- 9 tubos de ensayo
- Vaso de precipitado de 100 ml.
- 4 buretas
V. PROCEDIMIENTO

15

En un vaso de 100ml limpio y seco, pesar 0,25g de casena. Agregar luego con
exactitud 20ml de agua y 5 ml de NaOH 1N, agitar hasta obtener una disolucin
total. Adicionar 5ml de cido actico 1N. Determinar el punto isoelctrico de una
protena.
Pasar el contenido del beaker a un baln volumtrico de 50ml, lavando las paredes
del beaker con suficiente agua destilada y llevando el volumen hasta la marca.
Mezclar muy bien. La solucin deber quedar clara y limpia, de lo contrario debe
filtrarse o repetir el procedimiento.
Preparar cuatro buretas de 25 ml y rotularlas as:
- Bureta No. 1, agua destilada
- Bureta No. 2, cido actico 0,1 N
- Bureta No. 3, cido actico 0,01 N
- Bureta No. 4, cido actico 1 N
Las soluciones 2 y 3 se preparan por dilucin a partir de la solucin 1N.
Colocar en la gradilla los tubos de ensayo y preparar las siguientes soluciones:
Tubo No.
Agua destilada
Ac.actico ,01 N
Ac.actico 0,1 N
Ac. actico 1 N
pH resultante

1
8,4
0,62
5,9

2
7,75
1,25
5,6

3
8,75
0,25
5,3

4
8,5
0,5
5

5
8
1
4,7

6
7
2
4,4

7
5
4
4,1

8
1
8
3,8

9
7,4
1,6
3,5

Agregar a cada tubo 1ml de la solucin de casena; agitar el tubo inmediatamente y

dejar reposar 20 minutos.
Usando la escala de cruces, anotar el grado de turbidez de cada tubo; mirar el grado
de precipitacin de cada tubo y anotar el pH al que presenta mayor precipitacin.
Este pH en el cual se dio la mayor precipitacin, es el ms cercano al pI de la
casena.
VI. PREGUNTAS
1. Cual fue el pI hallado por usted en el laboratorio para la casena ?

16

2. Cul es el pI para la casena y en qu alimento(s) se encuentra en forma

abundante?
3. Un a.a. tiene los siguientes pK de acidez: 1,82
6
9,17
Seale si las informaciones son falsas o verdaderas, segn lo anterior:
a.
b.
c.
d.
e.
f.

El aminocido es bsico
El pI del aminocido es 3,91
El pI del aminocido es 7,59
El aminocido es cido
A un pH de 5, el aminocido se desplazar a ctodo
El pI de la arginina debe ser: ( tenga en cuenta su estructura )
- cerca de 7
- muy por debajo de 7
- muy por encima de 7

17

5. PROTENAS: SEPARACIN Y CARACTERIZACIN

I. INTRODUCCION
Diversas propiedades caractersticas de las protenas globulares en solucin pueden
ser utilizadas para separar mezclas de protenas tales como peso molecular,
solubilidad, carga elctrica, diferencias en las caractersticas de adsorcin y
afinidad biolgica por otras molculas. En ese sentido, varios mtodos de
separacin han sido desarrollados como, por ejemplo, centrifugacin, dilisis,
precipitacin isoelctrica, fraccionamiento por solventes, electroforesis,
cromatografa de intercambio inico, filtracin glica y otros.
Las protenas pueden ser clasificadas, de acuerdo con su solubilidad en diversos
solventes, en:
a) Albminas: protenas solubles en agua y soluciones salinas.
b) Globulinas: protenas ligeramente solubles en agua, solubles en soluciones
salinas diluidas.
c) Prolaminas: protenas insolubles en agua, pero solubles en etanol 70-80%.
d) Glutelinas: protenas insolubles en agua y etanol, mas solubles en cidos y
bases.
e) Escleroprotenas: protenas insolubles en solventes acuosos.
Segn esos criterios de solubilidad, se puede obtener informaciones preliminares
sobre las caractersticas de las protenas de un material biolgico.
El efecto de la temperatura tambin se puede observar en relacin a la solubilidad
de protenas, siendo por lo tanto utilizado como criterio de separacin. En
temperaturas de 0 a 40C, la solubilidad de las protenas globulares aumenta
progresivamente. En el rango de 40 a 50C la mayora de las protenas se tornan
inestables y empiezan a desnaturalizar con prdida de la solubilidad. Entre 60 a
70C las protenas presentan desnaturalizacin. La desnaturalizacin consiste en el
desenrollamiento de la estructura nativa caracterstica de las protenas globulares,
pasando a una cadena doblada al acaso. La estructura primaria se mantienen
inalterada siendo rotas los enlaces dbiles que estabilizan la estructura terciaria
nativa de una protena globular (puentes de H, atracciones electrostticas,

18

interacciones hidrfobas). La ocurrencia de estos fenmenos causa cambios en las

propiedades de las protenas como disminucin de la solubilidad y prdida de la
actividad biolgica. Entre los diversos agentes desnaturalizantes se pueden citar
variaciones bruscas del pH, temperaturas elevadas, solventes orgnicos,
radiaciones, urea, sulfato de amonio, cloruro de guanidina, etc.
Una vez aislada la protena, ella puede ser caracterizada por una secuencia de
mtodos para evaluar sus propiedades, como, peso molecular, composicin
aminoacdica, y la secuencia de aminocidos en la cadena, numero de cadenas
peptdicas, etc.
La caracterizacin o el reconocimiento de la porcin protica en un material
biolgico puede ser hecha, sencillamente, a travs de reacciones colorimtricas,
como la reaccin del Biureto, reaccin xantoprotica, etc.
II. TRABAJO PRCTICO
Separacin de las protenas de la clara del huevo por la solubilidad en agua,
identificacin de protenas por la reaccin xantoprotica.
La clara del huevo esta constituida principalmente por protenas (albminas y
globulinas). La albmina de la clara del huevo es la ovomucina. Agitndose la clara
del huevo con agua se consigue separar la ovalbumina (soluble en agua) de la
ovomucina (poco soluble en agua).
La reaccin xantoprotica ocurre cuando las protenas son calentadas con cido
ntrico concentrado, formando compuestos amarillos. El cido ntrico reacciona con
los compuestos bencnicos formando nitroderivados de color amarillo. En las
protenas tenemos aminocidos con anillo bencnico sustituido como la tirosina, el
triptfano y la fenilalanina. La reaccin ocurre, por lo tanto, a nivel de los radicales
de aminocidos que contiene anillos aromticos y que hacen parte de las cadenas
peptdicas de la mayora de las protenas. En medio alcalino la coloracin amarilla
se intensifica debido al comportamiento como indicador de los nitroderivados
formados. De esta manera, a travs de la reaccin xantoprotica, se puede hacer el
reconocimiento de la porcin proteica de un material biolgico.
III. MATERIAL
-

Clara de huevo
Erlenmeyer de 250 ml
Probeta de 250 ml
Embudo

19

Papel filtro
Beacker de 250 ml
Bastn de vidrio
Pipetas de 2 ml

- Tubos de ensayo
- Goteros
- cido ntrico concentrado
IV. PROCEDIMIENTO

- Hidrxido de sodio al 20%

- Solucin de tirosina

1. Tomar una clara de huevo en un beacker. Adicionar aproximadamente 200 ml

de agua destilada. Agitar con el bastn de vidrio. Dejar en reposo por algunos
minutos.
2. Filtrar un poco del sobrenadante; recoger el filtrado en un erlenmeyer (solucin
de ovoalbmina).
3. En un tubo de ensayo adicionar 2 ml de la solucin de ovoalbmina y en
seguida 5 gotas de HNO3 concentrado (cuidado: no pipetear el cido ntrico).
Observar y explicar los cambios cuando se le adiciona cido a la protena.
4. Tomar un beaker con un poco de agua. Colocar el tubo en bao mara y dejar
hervir por 2 minutos. Observar y explicar los cambios (reaccin xantoprotica).
5. Enfriar el material y, cuidadosamente, adicionar hidrxido de sodio en exceso.
Observar y explicar lo que ocurre.
6. Repetir el mismo test (a partir del tem 3) utilizando 2 ml de solucin de
tirosina. Apuntar y explicar los cambios observados.

20

6. DOSIFICACION DE PROTEINAS DE LA LECHE POR EL

METODO FOTOCOLORIMETRICO DEL BIURET
I.

INTRODUCCON

La determinacin cuantitativa de protenas puede ser hecha a travs de varios

mtodos. La escogencia del mtodo depender de varios factores tales como: la
naturaleza de la protena y de otros componentes en la muestra proteica, la rapidez,
la eficiencia y sensibilidad del mtodo. Entre los diversos mtodos se puede citar:
a) Mtodo micro-kjeldahl
Escogido para dosificar protenas en alimentos y muestras clnicas y agriculturas.
Es tambin usado para estimar nitrgeno no proteico de una muestra despus de la
precipitacin de protenas. La muestra es digerida con cido sulfrico concentrado
en presencia de catalizador, sob condiciones donde compuestos de nitrgeno son
convertidos a sulfato de amonio. Por destilacin a vapor en presencia de una base
fuerte (NaOH), el amonio es liberado y se puede estimar por varios medios. En
general case todas las protenas posee 16% de nitrgeno en su composicin, o sea,
1 mg de nitrgeno corresponde a 6,25 mg de protena. As, por la cantidad de
amonio formado de una conocida cantidad de muestra, se puede calcular la
cantidad de protena presente.
b) Mtodo de Lowry
Puede ser aplicado en material seco o en solucin. Es muy sensible, dosifica 5 g
de protena. El color formado es debido a la reaccin de la protena con el cobre
alcalino del reactivo y a la reduccin de las sales fosfomolibdato-fosfotungstato en
el reactivo por los aminocidos aromticos de la protena (Tyr y Trp). El color
producido es medido en el foto colormetro siendo proporcional a la cantidad de
protena en la muestra.
c) Mtodo de la Absorcin en el Ultravioleta
Muchas protenas absorben en el ultravioleta en la regin de 280 m debido a la
presencia de tirosina y triptfano. Como la cantidad de esos dos aminocidos es
generalmente constante en muchas protenas, se puede estimar la concentracin de

21

las protenas como siendo proporcional a la absorbancia a 280 m. Soluciones

puras de protenas conteniendo 1 mg de protena/ml presentan absorbancia en 280
m igual a 1,0 cuando en cubetas de dimetro de 1 cm. cidos nucleicos son
contaminantes en extractos proteicos y presentan fuerte absorcin en 260 m, que
enmascara la absorcin por la protena. Una frmula es usada para solucionar el
problema:
Concentracin de protena (mg/ml) = 1,55 . D.O.280 - 0,76 . D.O.260
d) Mtodo del Biuret
Est basado en el hecho de que compuestos conteniendo dos o mas enlaces
peptdicos forman un complejo con sal de cobre en soluciones alcalinas. El color
desarrollado es debido a un complejo de coordinacin entre el Ion cuprico y cuatro
grupos NH de dos cadenas peptdicas segn lo observado abajo:
................ NH - C - COO - NH - C - COO - NH - C - COO - NH .................

R
R
R
Cu++
............... NH - C - COO - NH - C - COO - NH - C - COO - NH ..................

R
R
R
El procedimiento de este mtodo es simples y rpido, adems de eso, ofrece una
buena estimativa de la cantidad de protenas en muestra analizada.
El mtodo es llamado mtodo del "Biuret", porque el Biuret resulta reaccin
positiva semejante a la protena cuando colocada en presencia de sal de cobre en
medio alcalino. La estructura del Biuret es la siguiente:
H2N - CO - NH - CO - NH2.
No hay prcticamente ninguna otra sustancia presente en materiales biolgicos y
que pueda interferir en esto mtodo. Adems el desarrollo del color no es el mismo
con todas las protenas y los resultados pueden ser afectados por la presencia de
lpidos, de ah la recomendacin de utilizarse muestras desengrasadas.

22

El mtodo puede ser usado para varios tipos de alimentos, adems de la leche, entre
ellos, carnes y cereales, observndose algunos cambios y adaptaciones.
II. TRABAJO PRCTICO
En este experimento ser hecho, inicialmente, la separacin de la casena (principal
protena de la leche), a travs de precipitacin isoelctrica.
Alcanzndose el punto isoelctrico de la casena (pH 4,6), esta se precipita,
restando en solucin la lactoalbmina y lactoglobulina, cuya proporcin en la
leche es considerablemente menor relacionado con la casena. La solubilidad de la
mayora de las protenas globulares esta influenciada por el pH del medio en que se
encuentran. El pH en que la protena tiene su menor solubilidad es en su pH
isoelctrico, definido como el pH en que la molcula no presenta carga elctrica
efectiva y es incapaz de desplazarse en un campo elctrico. En esas condiciones, no
existe repulsin electrosttica entre las molculas proteicas vecinas y ellas tienden a
coalescer y precipitar. Entretanto, en valores de pH arriba o abajo del punto
isoelctrico, todas las molculas poseen una carga efectiva de misma seal. Como
consecuencia, ellas irn repelar una con las otras, evitando la coalescencia de las
molculas aisladas en agregados insolubles. De ese manera, en valores de pH arriba
o debajo de su pH isoelctrico la solubilidad de las protenas se eleva
acentuadamente. Como las protenas presentan punto isoelctrico diferente, ellas
pueden ser separadas unas de las otras por precipitacin isoelctrica.
Despus de la separacin de las protenas de la leche, ser hecha la dosificacin
cuantitativa de las protenas basndose en la ley de Lambert Beer: "la
concentracin" es directamente proporcional a la absorbancia (A) o densidad ptica
(D.O.).
Despus la reaccin del reactivo de Biuret con la protena, la intensidad del color
desarrollado es medida en el fotocolormetro con una intensidad de onda de 540
m y comparada con patrones de protenas tratadas de la misma manera, usndose
los datos en la formula a seguir para determinar la concentracin de protena en la
muestra.
Absorbancia de la muestra
Conc. de la muestra =
x conc. del patrn
Absorbancia del patrn
Al efectuarse estos clculos se hace las debidas correcciones debido a las
diluciones de las muestras.

23

Debe considerarse an en este mtodo que su sensibilidad est alrededor de

concentracin de 1,0 a 5,0 mg/ml, por lo tanto muestras que contengan
concentraciones de protenas debajo de ese rango, no deben ser analizadas por este
mtodo, pus el resultado no ser real; muestras de concentracin arriba de ese
rango deben ser diluidas adecuadamente.
III. MATERIAL
-

Erlenmeyer
Bureta
Pipetas
Probeta
Embudo
Tubos de ensayo

- Reactivo de Biuret: *

- Fotocolormetro
- Papel de filtro
- Solucin estndar de
(concentracin 1 mg/ml)
- cido clorhdrico al 2%
- Leche descremada

casena

Sulfato de cobre cristalizado

Tartarto doble de sodio y potasio
Agua destilada
Hidrxido de sodio al 10%

IV. PROCEDIMIENTO
En esa prctica hay necesidad de preparar dos muestras de leche.
a) Preparo de muestra I:
- En un erlenmeyer adicionar 25 ml de leche y 25 ml de agua destilada.
- Homogenizar, acrecentar HCl, gota a gota, utilizndose una bureta, con
agitacin constante, hasta que la leche coagule. Anotar en volumen de cido
gastado, pues este dato ser utilizado en los clculos finales.
- Filtrar (papel de filtro) y usar el filtrado posteriormente para la dosificacin. En
esta muestra I tenemos entonces la lactoalbmina y lactoglobulina ya que la
casena fue separada por precipitacin isoelctrica.

24

El pH de la leche es aproximadamente 6.9 y al adicionarle HCl el pH va bajando

hasta llegar a 4.6 (punto isoelctrico de la casena) y en ese pH la casena precipita
separndose de la lactoalbmina y lactoglobulina.
b) Preparo de la muestra II
Diluir 1 ml de leche con 19 ml de agua destilada, hacindose por lo tanto una
dilucin 1/20. Homogenizar.
En esta muestra no ser separada ninguna de las 3 protenas tenindose por lo tanto
en ella las protenas totales.
c) Dosificacin de las muestras y estndar
Enumerar 4 tubos de ensayo y distribuir las soluciones segn el cuadro abajo:
Tubo
1 (blanco)
2
3
4

H2O
(ml)

Protena
Muestra I
estndar (ml)
(ml)

Muestra II
(ml)

3
3
3
3

Reactivo de
Biuret (ml)
12
12
12
12

- Mezclar el contenido de los tubos por inversin y dejar en reposo por 15 min
para que ocurra la reaccin de complejacin del ion cprico con las cadenas
peptdicas de las protenas.
- Hacer la lectura de las soluciones en el fotocolormetro a 540 m usando el
contenido del tubo 1 (blanco) para cerrar el equipo.
- Hacer los clculos usando la frmula citada anteriormente
hacer las
correcciones necesarias debido a las diluciones hechas en las muestras.
- Reportar los resultados en g de protena por 100 ml de leche y calcular el
porcentaje de casena por diferencia entre la muestra I y II.

25

7. ENSAYOS CON PROTEINAS

I. OBJETIVO
Identificar algunas reacciones de las protenas.
II. TEORA
Las protenas son molculas de alto peso molecular, que contienen carbono,
hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y con frecuencia azufre.
Las unidades fundamentales de las protenas son los aminocidos que son
compuestos orgnicos que contienen grupos amino y carboxilos, por lo tanto
poseen propiedades cidas bsicas.
Los aminocidos se unen por enlaces peptdicos para formar dipptidos,
tetrapptidos, oligopptidos y polipptidos.
Las protenas se consideran que estn formadas por polipptidos que
adquieren diferentes configuraciones espaciales, determinando as la
estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las protenas.
Las propiedades fisicoqumicas de las protenas estn determinadas por la
secuencia de aminocidos, su configuracin, las fuerzas interinicas, puentes
de hidrgeno, etc.
III. PARTE EXPERIMENTAL
Preparacin de la muestra*:
- Batir una clara de huevo y acrecentar 6 veces su volumen de agua.
1- Desnaturalizacin
- A 3 tubos de ensayo (A, B Y C), adicionar 3 ml solucin albmina.
- Al tubo A caliente hasta coagulacin, al tubo B adicione 1 gota de HCl
concentrado y al tubo C adicione 1 gota de NaOH.
- Anotar observaciones.
* CADA GRUPO DEBE TRAER UN HUEVO.

26

2 - Solubilidad en Etanol
- A un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina y 5 ml de etanol.
- Observar lo ocurrido.

3- Reaccin de Biuret
- En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina, 1 ml de NaOH al
10% y 1 gota de CuSO4.al 1%.
- Anotar observaciones.

4- Reaccin de precipitacin de cationes

- En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina y 3ml CuSO 4 al
10%.
- Anotar observaciones.

27

III. ENZIMAS
8. ENZIMAS: AMILASA SALIVAL
I. OBJETIVOS
- Comprobar la accin de la amilasa salival sobre el almidn.
- Analizar los factores que afectan la velocidad de reaccin de las enzimas.
- Comprobar la accin de la amilasa con reactivos de Fehling y de Lugol.
II. TEORIA
Las enzimas son protenas conjugadas, generalmente de estructura globular. Su
principal propiedad es ser catalizadores biolgicos. Al ser catalizador, no interviene
en el producto final.
Las enzimas poseen un sitio activo en forma de hendidura donde reacciona con el
sustrato por medio de enlaces covalentes. Otro aspecto importante de las enzimas
es su especificidad, en cuanto a sustrato, temperatura y pH. Cada enzima tiene
condiciones ptimas para su funcionamiento.
Las enzimas necesitan una coenzima o cofactor. Este cofactor, es generalmente un
compuesto orgnico: un nucletido libre, aunque puede ser un mineral.
III. PARTE EXPERIMENTAL
a)
- Calentar agua a 40 C en un beaker, y tomar un poco en la boca.
- Enjuagar muy bien.
- Recoger el enjuagado, y repetir el proceso 2 veces.
- Filtrar la solucin obtenida
b)
- Tomar 3 tubos de ensayo y marcarlos: A, B y C
- Agregar a cada uno 5 ml de solucin de saliva
- Al tubo A, hervir por 5 minutos y enfriar
- El tubo B, no se le echar nada.
- Al tubo C, acrecentar 2 ml de HCl 1M.

28

Mezclar bien el contenido de todos los tubos.

Adicionar 5 ml almidn 2% a cada tubo.
Realizar pruebas de Fehling y Lugol a los 3 tubos.
Colocar los tres tubos a 40 C.
Agitar cada 5 minutos.
Realizar pruebas de Lugol y de Fehling a cada 10 minutos hasta observar
cambio.

NOTA: Realizar las pruebas de lugol en vidrio de reloj.

29

9. ESTUDIO DE LA POLIFENOLOXIDASA (PPO) EXTRAIDA

DE LA PAPA
I.

INTRODUCION

Las enzimas son protenas sintetizadas en la clula viva, que catalizan o aceleran
una reaccin qumica. Una de las caractersticas principales de la clula es su
capacidad de hacer con que las reacciones complejas se procesen rpidamente a la
temperatura del medio circundante. Estas transformaciones se deben a las protenas
llamadas enzimas, que son los catalizadores biolgicos. Las enzimas comparadas a
los catalizadores no proticos tales como Pt, H +, Cu++, se destacan por la notada
especificidad a los sustratos debido a su compleja estructura protica. Muchas
veces una enzima exige un componente adicional para que pueda ejercer su
funcin, estos componentes son los cofactores que pueden ser: grupos prostticos,
coenzimas y activadores metlicos. Las enzimas estn sujetas a influencia de varios
factores como: pH, calor, cidos y bases fuertes, pudiendo perder su actividad
biolgica "desnaturalizndose". Para su perfecto funcionamiento es necesario, que
todos los factores arriba mencionados sean bien definidos. Se evala la actividad de
una enzima rutinariamente por el surgimiento de los productos o por el
desaparecimiento del sustrato.
II. OBJETIVOS
- Extraer la PPO de la papa.
- Verificar su especificidad en lo relacionado a diversos compuestos.
- Testar la influencia de la temperatura sobre su actividad.
La PPO es una enzima cprica con un pH ptimo alrededor de 6 a 7, presentando
su mayor actividad enzimtica a 37C. Esta enzima cataliza la reaccin de varios
difenoles, en la posicin orto y para, llevando estos sustratos a quinonas
correspondientes con surgimiento de color.
Tales reacciones comnmente ocurren en vegetales promoviendo el oscurecimiento
enzimtico de ciertos frutos y hojas como: pera, durazno, manzana, hojas de tabaco
y caf, cuando su tejido es magullado (herido). Estos oscurecimientos poden alterar
el sabor, apariencia y hasta mismo el valor nutricional. Algunos alimentos por

30

tradicin son deseados el oscurecimiento como: caf, cervezas, t, etc. La

formacin de estas quinonas es dependiente de la enzima y del oxgeno, siendo que
la intensidad de la reaccin es verdaderamente evaluada por el consumo de
oxgeno. La industria busca prevenir estos oscurecimientos adicionando productos
como: CH3I, CH3OH, (CH3)2SO4, cido ascrbico, SO2, a pesar de traer ciertos
inconvenientes el uso de algunos de estos (SO2, CH3OH), o an, alterando el pH y
la temperatura.
En esta prctica varios compuestos sern tratados con el extracto conteniendo PPO,
con la finalidad de verificar la especificidad de esta enzima con varios sustratos,
que podr ser observada con el aparecimiento del color oscuro. "Sustratos" como:
tirosina, cido qunico, clorognico, cido glico, hidroquinona, glucosa, sern
testados para nuestra observacin.
Los meta difenoles raramente son sustratos para las fenolasas y en algunos casos
otros sustratos debern antes seren hidroxilados para transformaren en las quinonas
correspondientes.
H2N

- C -COOH

H2N

CH2

- C -COOH

H2N

CH2

CH2

O2
PPO

OH
Tirosina

- C -COOH

OH

O2
PPO

O
O

OH
3,4 dihidroxifenilalanina

3,4 benzoquinonilanina

Dentro de los sustratos recomendados los difenoles en posicin orto presentan

oscurecimiento enzimtico ms rpido y acentuado.
III. MATERIAL Y REACTIVOS
-

cido cafico
cido clorognico
cido quinico
Glucosa

31

Floroglucinol
Resorcinol
cido glico
Catecol

Fenol
Tirosina
Hidroquinona
Buffer fosfato 0,1 M pH 6,5
Tubos de ensayo
Bao mara
Pipetas

Licuadora
Tela de lino o gaza
Papa
Termmetro
Vasos
Erlenmeyer

IV. PROCEDIMIENTO
a) Especificidad
- El extracto de PPO es preparado licuando una porcin de papa con 150 ml de
buffer fosfato 0,1 M pH 6,5.
- Filtre en tela de lino o gasa, deje decantar (5 minutos), retire el sobrenadante
que es la fuente de PPO.
- Enumere los tubos de 1 a 12, y en cada tubo adicione 1 ml del extracto de PPO,
1 ml de sustrato, homogeneice, colocando en bao mara a 37C, durante 5
minutos.
- El tubo 1 ser el blanco y contendr a penas 1 ml de agua y 1 ml del extracto de
PPO. A mayor especificidad ser observada en los tubos donde aparezca el color
ms oscuro el que demuestra la especificidad de la enzima por el sustrato
resultando en las quinonas correspondientes.
- Comente su observacin y justifique.
b) Influencia de la temperatura
- Tome cerca de 3 ml del extracto conteniendo PPO y le de un ligero
calentamiento.
- A seguir, coloque en un tubo de ensayo 1 ml de este extracto y 1 ml del sustrato
que mejor reacciono con PPO en la prueba anterior. Deje por 5 minutos a 37C.
- Comente su observacin y justifique.
- En otro tubo de ensayo coloque 1 ml del extracto de PPO y deje en bao de
hielo por 5 minutos. Adicione 1 ml del mismo sustrato tambin mantenido a
0C. Homogeneice. Deje descansar por 5 minutos en bao de hielo.
- Comente su observacin y justifique.
- En cul temperatura (0C, 37C, calentamiento) la enzima presento mayor
actividad?

32

10. ENZIMAS Y SU DESEMPEO EN LOS ALIMENTOS (CHO)

I. INTRODUCION
La saliva es producida por las glndulas partidas submaxilares y sublinguales, as
como tambin por las glndulas bucales y membranas mucosas de la boca, garganta
y esfago.
La saliva contiene un 99% de agua. El material slido que contiene, incluye ptialina
(amilasa salivaria), varias protenas y otras sustancias como urea, cido rico,
colesterol, calcio, sodio, potasio, fosfato, etc. El pH promedio es de 6,8.
PARTE A
Determinacin del pH ptimo en la accin de la ptialina.
II.
PROCEDIMIENTO
- Coloque en una gradilla 5 tubos de ensayo y mrquelos pH 8; 7,4; 7,0; 6,8; 5,2.
- Aada a cada tubo 5 ml de la solucin amortiguadora de su respectivo pH. A
continuacin aada a cada tubo 2 ml de almidn al 1%, 1 ml de cloruro de sodio
al 0,1 M, 1 ml de saliva diluida* y 3 gotas de lugol.
- Coloque todos los tubos numerados, en un bao de agua a 38 C y determine cual
tubo alcanza el punto acrmico ( sin color ).
* 1 ml de saliva en 9 ml de agua destilada.
III. PREGUNTAS
a) Cul es el pH ptimo para la Ptialina?
b) Cmo explica la accin incontinua de la Ptialina en el estmago?
c) Qu ocurre cuando se alcanza el punto acrmico?
PARTE B
Influencia de la temperatura sobre la accin de la Ptialina.
II. PROCEDIMIENTO
- Tome 4 tubos de ensayo y reprtalos as:

33

El primero No. 1, en mezcla de agua-hielo

El segundo No. 2, temperatura ambiente
El tercero No. 3, en bao mara a 38 C.
- Aada a cada uno de los 3 primeros tubos, 5 gotas de saliva diluida ( 1:9 ) y 2 ml
de solucin de almidn al 1% y mezcle bien. Al cuarto tubo aada 2 gotas de
saliva diluida que haya sido calentada en agua hervida por 5 minutos, mas los 2
ml del almidn al 1%.
- A intervalos de 5 minutos, saque una muestra de cada tubo y pruebe con 2 gotas
de yodo 0,01M y note la velocidad de digestin en cada tubo; cuando no haya
color, se da por terminada la reaccin.
III. PREGUNTAS
a) Cul tubo alcanza primero el punto acrmico?
c) Qu significa que los otros tubos permanezcan iguales?

34

IV. CARBOHIDRATOS
11. IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
I. OBJETIVOS
Al finalizar esta prctica, el estudiante estar en capacidad de:
- Reconocer la presencia de carbohidratos en una sustancia orgnica, utilizando
reactivos de Molisch Antrona.
- Diferenciar un carbohidrato reductor de otro no reductor, de acuerdo a la
formacin de un precipitado de color amarillo o rojo ladrillo, en presencia del
reactivo de Fehling, Benedict o Tollens.
II. MATERIAL Y EQUIPO
-

Tubos de ensayo
Esptula
Beaker
Bao de Mara
Antrona
Molisch
Acido sulfrico concentrado
Hielo
Agua
HCl concentrado
Fehling

Lugol
Tollens
Seliwanoff
Acetado de sodio
HCl 10%
- NaOH 10%
- Sacarosa 5%
- Glucosa 5%
- Fructosa 5%
- Almidn en polvo
- Clorhidrato de fenilhidrazona

II. TEORIA
Los hidratos de carbono son compuestos que contienen adems de carbono,
hidrgeno y oxgeno en proporcin de 2 a 1. Este nombre tambin se usa para
algunos de sus derivados en los que la definicin dada no se cumple estrictamente.

35

Los carbohidratos ms simples contienen C, H, O pero muchas de las que existen

en la naturaleza contienen tambin P, S y/o N.
Cx(H2O)y
Han sido definidos como polihidroxialdehidos o polixidroxicetonas.
Segn el grupo carbonlico que presenten, se clasifican como aldosas y cetosas.
Se dividen en 4 grandes grupos:
a. Monosacridos: aquellos carbohidratos que no son hidrolizables a compuestos
ms simples. Ej: glucosa
b. Disacridos: un carbohidrato que por hidrlisis da dos molculas de
monosacridos. Ej: sacarosa, maltosa, etc.
c. Oligosacridos: son los carbohidratos que por hidrlisis, generan entre 2 y 10
unidades de monosacridos. Ej: rafinasa, estaquiosa.
d. Polisacridos: al hidrolizarlos se obtiene ms de 10 unidades de monosacridos.
Ej: Almidn, celulosa.
Los carbohidratos y sus derivados se encuentran en casi todas las partes de la
clula, desempeando papeles tanto estructurales como funcionales.
Estos compuestos son de importancia fundamental en la biosfera y se elaboran
durante la fotosntesis. Por fotosntesis las plantas verdes y las algas pueden usar la
energa solar, para sintetizar hidratos de carbono a partir de bixido atmosfrico y
agua. Muchas plantas almacenan grandes cantidades de hidratos de carbono, que en
algunos casos, son consumidos por el hombre y los animales para su alimento.
Despus de que los carbohidratos complejos han sido ingeridos, la molcula se
rompe en el estmago e intestinos, dando glucosa, la cual es luego oxidada a CO 2 y
H2O, o es almacenada temporalmente como glicgeno en el hgado y los msculos.
En el hombre ms del 60% de los requerimientos totales de energa proviene de la
oxidacin de los hidratos de carbono.
En esta forma los animales, que no pueden realizar fotosntesis, pueden aprovechar
la energa solar.
CO2 + H2O
Energa solar
CO2 + H2O

CO2 + H2O
Energa

Cx(H2O)y

Cx(H2O)y

36

Plantas verdes

Animales
O2

O2

Ciclo del carbono en la biosfera

IV. PARTE EXPERIMENTAL
1. Reacciones Genricas de los Carbohidratos
1.1. Reaccin de la Antrona
El H 2SO4 concentrado, hidroliza enlaces glicosdicos para dar
monosacridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus
derivados. Estos productos se combinan con antrona dando un complejo
azul-verdoso.
El procedimiento es el siguiente: en tubos de ensayo a aproximadamente 2
ml de las soluciones problemas, agregue 5 gotas del reactivo de Antrona;
agite lentamente y observe el cambio de color.
1.2. Reaccin de Molisch
El fundamento es similar al de la reaccin de antrona, excepto que el furfural
se combina con - naftol sulfonado, originando un complejo prpura.
El procedimiento es el siguiente: agregue 2 gotas de la solucin de - naftol
a 2 ml de la sustancia problema. Aada cuidadosamente por las paredes del
tubo aproximadamente 1 ml de H2SO4 concentrado hasta que se formen dos
capas , observe cuidadosamente cualquier cambio de color en la interfase de
los dos lquidos.
Repita el procedimiento para cada una de las muestras problemas
disponibles, y tambin con el agua en vez de la muestra problema.
1.3. Reacciones de los Azcares Reductores
En la prctica se usa una solucin alcalina de una sal de cobre y un
compuesto orgnico, que contiene OH alcohlico bajo estas condiciones, el

37

cobre forma un complejo soluble y el reactivo es estable; ste complejo en

presencia de sustancias reductoras y calor se precipita a xido cuproso de
coloracin parda, as:
2 Cu(OH)2

CU2O + H2O

Los carbohidratos que poseen un aldehdo libre o potencialmente libre o un

grupo cetnico, tienen propiedades reductoras en solucin alcalina.
1.3.1. Reaccin de Fehling
En tubos de ensayo mezcle 2 ml de la solucin A de Fehling con 2 ml de la
solucin B de Fehling, agregar 2 ml de la solucin problema. Introduzca los
tubos en bao Mara previamente calentado, contine el calentamiento,
registre el tiempo necesario para la aparicin de un precipitado rojizo.
Caliente como mximo 25 minutos.
1.3.2. Reaccin de Tollens
Coloque en un tubo de ensayo 1 ml de reactivo de Tollens, aada 2 ml de la
solucin problema, caliente en bao Mara 10 15 minutos. Observe si hay
formacin de espejo de plata.
1.4. Reaccin de Seliwanoff
Mezcle 1 ml del reactivo con 1 ml de la solucin problema al 5%. Caliente la
mezcla a ebullicin, el desarrollo de un color rojo en 2 minutos, es indicativo
de que la prueba es positiva, para presencia de cetosas.
1.5. Preparacin de Ozasonas
En un tubo de ensayo, coloque 0,2 g de clorhidrato de fenilhidrazona y 0,3 g
de acetato de sodio disueltos en 3 ml de agua, agregue 1 ml de la solucin
problema. Caliente por 20 minutos, enfre y observe. Mida el tiempo de
formacin de cada osazona.
1.6. Hidrlisis de la Sacarosa

38

Tres tubos de ensayo, conteniendo cada uno 4 ml de solucin acuosa de

sacarosa al 50%, se colocan en bao Mara y se les agrega igual volumen de
agua al primero, al segundo HCl al 10%, y al tercero de NaOH al 10%. Se
calientan y despus se ensaya una porcin de cada uno de ellos con el reactivo
de Fehling. Qu grado de hidrlisis observ en cada caso?
1.7. Hidrlisis del Almidn
Mezcle 1 g de almidn molido con 10 ml de agua fra, y vierta esta
suspensin en 200 ml de agua hirviendo. Enfrie 5 ml de esta solucin, y
agregue 4 gotas de lugol.
Al resto de la solucin aada 10 ml de HCl concentrado y lleve a ebullicin.
A cada 5 minutos, tome 2 porciones de 3 ml cada una y haga la prueba de
Fehling en una y en la otra, previo enfriamiento con bao de hielo, la prueba
del lugol.

39

12. POLISACARIDO - AISLAMIENTO E HIDROLISIS

I. OBJETIVO
Al finalizar la prctica, el estudiante estar en capacidad de :
- Identificar monosacridos a partir de una hidrlisis de polisacridos,
mediante las pruebas caractersticas de carbohidratos.
II. MATERIAL Y EQUIPO
- Hgado
- cido tricloroactico (TCA) 10% en
agua
- Etanol absoluto
- Etanol al 95%

ter etlico
cido clorhdrico
Hidrxido de sodio
Hielo

III. TEORIA
El glicgeno es un polisacrido de almacenamiento en las clulas animales. A
menudo se le designa como almidn animal, tiene una estructura ramificada con
unidades de cadena lineal de 11 a 18 -D- glucopiranosas, las cuales presentan una
unin glucosdica en (1-4) con ramificacin, mediante uniones glucosdicas en
(1-6).
El glicgeno no es reductor y con el yodo toma un color rojo.
IV. PARTE EXPERIMENTAL
1. Aislamiento

40

El hgado fro deber ser pesado. Luego, macere el hgado en un mortero

preenfriado con TCA 10% (1ml de TCA por gramo de hgado). Centrifugue el
homogeneizado por 5 minutos; pase el sobrenadante a un tubo de ensayo, se agrega
lentamente 2 volmenes de etanol 95%, mezcle bien y deje decantar el precipitado;
si esto no ocurre agregue una pizca de sal y caliente de nuevo el tubo hasta que el
precipitado flocule, centrifugue despus por 3 minutos.
Descarte el sobrenadante, el precipitado es el glicgeno.
Disolver el precipitado en 5 ml de agua, adicione luego 2 volmenes de etanol al
95%, centrifugue, lavar el precipitado con 3 ml de etanol 95%.
Saque la preparacin en un vidrio de reloj y pese el glicgeno.
2. Hidrlisis cida de glicgeno
Haga una solucin de glicgeno de 8 mg/ml, tome un volumen de 5 ml, rotule 4
tubos de ensayo. Deje el tubo 1 con 0,4 ml de agua como blanco, al resto de los
tubos coloque 0,4 ml de la solucin de glicgeno y aada 0,6 ml de HCl 2 N; a los
tubos 1 y 2 agregue 1 ml de NaOH 1,2 N; colquelos en un bao de agua hirviendo,
lo mismo haga con el tubo 3 , al cabo de 10 min neutralice el cido en el tubo 3 con
1 ml de NaOH 1,2 N; el tubo 4 djelo 25 minutos, y luego neutralice con 1 ml de
NaOH 1,2 N.
Determine la glucosa liberada mediante algn mtodo conocido (antrona-Molisch).
Determine por el mtodo de lugol, la presencia de glicgeno.

41

V. LIPIDOS
13. QUIMICA DE LOS LIPIDOS
I. OBJETIVO
Al finalizar esta prctica, el estudiante estar en capacidad de identificar la
presencia de lpidos en un compuesto orgnico o alimento, mediante la
comprobacin de diferentes propiedades fsicas.
II. MATERIAL Y EQUIPO
-

Tubos de ensayo
Beacker
Agua destilada
Cloroformo
ter
Alcohol
Aceite de algodn
Sales biliares

- Solucin saponificada (grasa y

KOH etanlico al 20%)
- Cloruro de calcio 10%
- cido ntrico concentrado
- cido esterico 5%
- cido oleico
- Aceite de oliva

III. TEORIA
Los lpidos son un grupo grande y heterogneo de biomolculas orgnicas,
presentes en las clulas, solubles en solventes orgnicos no polares, por ejemplo
(benceno, cloroformo, ter, tetracloruro de carbono) y son insolubles en agua.
Los lpidos pueden clasificarse en complejos y simples, segn que por hidrlisis
alcalina generan o no sales de cidos grasos (jabones).
Los lpidos simples como esteres de cidos grasos son diversos alcoholes (grasas y
ceras).

42

Tenemos como ejemplo derivados de lpidos como terpenos, esteroides y

prostaglandinas.
1. Acilglicrido
Son esteres de los cidos grasos y del alcohol glicerol, son los ms abundantes
dentro de los lpidos, sobre todo los de reserva en los seres vivos, la estructura se
representa as:
O
CH2 - O - C
O

R1
C - O - C - H
R2

O
CH2 - O - C
R3
O
Los grupos acilo ( R - C
) pueden ser iguales o diferentes y los R forman
R1
parte de cidos grasos de cadena lineal larga; estas cadenas completamente
saturadas constituyen las grasas y con insaturaciones, los aceites.
2. Fosfoglicridos
Son componentes esenciales de las membranas biolgicas. Los fosfoglicridos y las
esfingomielinas se consideran fosfolpidos o fosftidos, porque contienen el grupo
fosfato en la molcula.
OCH2 - O - C
O
R1
C - O - CH
R2
OH
CH2 - O - P O - X
La X constituye grupos de cabeza polar, provenientes de amino alcoholes, inositol,
glicerol, carbohidrato y componentes ms complejos.
Se encuentran principalmente en las membranas celulares del tejido nervioso.
Los esfingolpidos se dividen en esfingomielina y glucoesfingolpidos.

43

4. Ceras
Son esteres de cidos grasos saturados superiores, con alcoholes monohidroxlicos
o con esteroles y son insolubles en el agua: el principal constituyente de la cera de
abejas es el palmitato de miricilo.
O
CH3 - (CH2)14 - C
O - ( CH2)29 - CH3
Las ceras forman pelculas protectoras en la superficie de las hojas, frutos, piel,
pelo y plumas.
5. Terpenos
Son compuestos lineales o cclicos constituidos por dos o ms unidades de
isopreno.
CH2 = C - CH = CH

CH3
Los terpenos y terpenoides se encuentran en las plantas en la forma de aceites
esenciales, resinas, pigmentos, caucho, etc. Ej: geraniol, limoneno, eucaliptol,
alcanfor, carotenides, vitaminas A, E, K, y la coenzima Q.
6. Esteroles
Son derivados del ciclopentano perhidrofenantreno.

44

Los esteroles son alcoholes esteroides cuyo miembro representativo es el colesterol,

el cual se encuentra normalmente esterificado con los cidos grasos, otros ejemplos
de esteroides son los cidos biliares, hormona corticales y sexuales y la vitamina D.
7. Prostaglandinas
Son derivados cclicos de cidos grasos, no saturados de 20 tomos de carbono que
actan en la regulacin metablica.
IV. PARTE EXPERIMENTAL
1. Solubilidad de los lpidos
Preparar 4 tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema:
TUBOS No.
ml agua destilada
ml cloroformo
ml ter
ml alcohol
Gotas de aceite de algodn
Agitar los tubos y observar los resultados.

1
2
5

2
2
5

3
2
5

4
2
5

2. Emulsin de los lpidos.

Preparar 2 tubos de acuerdo al siguiente esquema:
TUBOS No.
ml de agua destilada
ml sales biliares
Gotas de aceite de algodn
Agitar los tubos y observar los resultados.
3. Saponificacin de las grasas
Preparar 3 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

45

1
7
3

2
5
2
3

TUBOS No.
ml solucin saponificada
ml cloruro de calcio al 10%
ml cido ntrico (gota a gota)
Agitar los tubos y observar los resultados.

1
5
-

2
5
1
-

3
5
1

Solucin saponificada: Tome 10 g de grasa en un erlenmeyer, aada 30 ml de KOH

etanlico (20%), colquelo por 1 hora en bao de Mara, agregue luego 30 ml de
agua destilada.
4. ndice de Yodo
Preparar 4 tubos de ensayo segn es siguiente esquema:
TUBOS No.
ml cloroformo
Gotas de cido esterico al 5%
Gotas de cido olico
Gotas de aceite de oliva

1
5
-

2
5
2
-

3
5
2
-

4
5
2

A cada tubo aada solucin de HUBL, gota a gota, con agitacin, hasta reproducir
el color desarrollado en el tubo No. 1, comparar las cantidades de solucin de
HUBL gastadas en cada caso.
Explicar los resultados.
5. Consultar:
a)
b)
c)
d)
e)

Qu es ndice de Yodo?
Qu es ndice de saponificacin?
Qu es cido graso?
Qu es glicolpido?
Qu es lipoprotena?

46

14. DETERMINACIN DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA

GRASA
I. FUNDAMENTO
Las grasas almacenadas pueden enranciarse debido a la oxidacin de los dobles
enlaces, para formar perxidos; y, a su hidrlisis por microorganismos, con
liberacin de cidos grasos. La cantidad de cidos grasos da, por tanto, un ndice
de la frescura y la calidad de la grasa.
Se sugiere que cada par de estudiantes escoja un lpido y haga un ensayo de:
- Una muestra seca.
- Una que haya sido expuesta al aire por un tiempo.
Compare sus resultados con los obtenidos por otros grupos para diferentes
lpidos.
El valor de acidez es el numero de miligramos de KOH requerido para neutralizar
los cidos grasos libres presentes en 1g de grasa.
II. MATERIALES
1. Aceite de oliva, mantequilla y margarina (usar una muestra fresca y otra que se
ha dejado al aire por varios das.
2. Solvente de grasa (volmenes iguales de 95% v/v de alcohol y ter) neutralizado
a la fenolftalena.
3. Fenolftalena (10 g/l en alcohol).
4. KOH (0,1 mol/l).
5. Buretas (5 ml y 25 ml).
III. METODOLOGIA

47

1. Determinacin de la acidez
Pesar cuidadosamente 10 g de la sustancia problema, y suspenderla, despus de
derretirla, en 50 ml de un solvente de grasa. Agregar 1 ml de solucin de
fenolftalena; mezclar cuidadosamente y titular con KOH 0,1 mol/l, hasta que el
color rosado plido permanezca por ms de 20-30 s. Anotar el nmero de
ml de lcali que necesita, y calcular el valor de acidez de la grasa.
Nota: 0,1 mol/l KOH contiene 5,6 g/l o 5,6 mg/ml.
2. Prueba del fro
Utilizar aceite de girasol, algodn, oliva y manteca de cerdo.
Rotular 3 tubos de ensayo y poner 5 ml de cada aceite en cada tubo segn la
rotulacin.
Colocar los tubos sumergidos en un bao de hielo dentro de una nevera, a
intervalos vayan observando para determinar si se produce enturbiamiento del
aceite por cristalizacin de sus glicridos y anoten el tiempo en que ella se
produce.
3. Pruebas de insaturacin
Esas pruebas son aplicadas en la caracterizacin y el control del procesamiento de
tales productos para transfrmalos en mantecas vegetales.
a) Prueba de adicin de yodo
- Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo rotulado.
- Agregar 3 gotas de solucin de yodo o lugol a la muestra de aceite, agitar con
vigor y observar el color rojizo de la mezcla.
- Calentar con suavidad y observar si el color va cambiando hasta desaparecer
por completo.
- Enfriar, agregar 5 gotas de solucin de almidn, agitar y observar si no hay

48

yodo libre en la mezcla.

- Repetir la prueba con otra muestra del mismo aceite, pero agregando lugol
hasta que su coloracin rojiza persista en la mezcla y observen la coloracin
azul que se produce con el almidn, lo cual indica que ya hay yodo libre en la
prueba.
b. Prueba de adicin de bromo
- Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo rotulado.
- Disuelve 2 ml de bromo en 50 ml de tetracloruro de carbono.
- Gota a gota, con ayuda de una pipeta graduada, vaya agregando solucin de
bromo a cada muestra de aceite, con agitacin despus de cada gota de reactivo,
hasta cuando el bromo se decolore por completo.
- Anotar el volumen o el numero de gotas de solucin de bromo requeridas para
que el reactivo deje de decolorarse, con el fin de comparar entre los aceites
ensayados.
Trate de explicar los resultados obtenidos, con inclusin de las correspondientes
reacciones.

49

15. EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE LIPIDOS.

I.

OBJETIVOS

- Extraer e identificar los lpidos de la yema de huevo: triacilglicridos,

fosfolpidos, colesterol.
II. MATERIAL
-

Yema de huevo
Beacker
Erlenmeyer
Pipetas
Condensador de reflujo
Plancha de calentamiento
Papel de filtro
ter sulfrico
ter etlico
Cloroformo

- cido sulfrico concentrado

- KOH 10% etanlico
- Solucin de cloruro de calcio
saturada
- Acetato de cadmio o zinc
- Acetona
- Acetato de plomo
- Bastn de vidrio

III. PROCEDIMIENTO
- Tome una yema de huevo en un beacker de 200 ml juntamente con 50 ml de ter
etlico, agitando con un bastn durante 5 minutos.
- Deje reposar hasta que se forme buen volumen de sobrenadante.
- Retire el sobrenadante para un vaso de 100 ml y abandone el precipitado.
a) Prueba para Fosfolpido
- Adicione 20 ml de propanona sobre el sobrenadante.
- Filtre en papel de filtro, reservando el filtrado para las siguientes etapas.
- Pase por el papel de filtro en uso 10 ml de etanol y recoja 2 ml en un tubo de
ensayo.

50

- Adicione algunas gotas de acetato de cadmio; la formacin de un precipitado

blanco confirma la presencia de fosfolpido.
b) Reaccin de Saponificacin
- Al filtrado reservado adicione 20 ml de KOH etanlico al 10%, en un baln
acoplado a un condensador de reflujo y calentado con la plancha.
- Mantenga el calentamiento (ebullicin) por 15 minutos.
- Transfiera todo el material del baln para el embudo de separacin con 30 ml de
ter de petrleo y 30 ml de agua.
- Agite cuidadosamente dejando en reposo sobre el soporte para la separacin.
Pruebas para confirmacin del jabn
- Recoja de la fase inferior (fase acuosa) 2 ml en un tubo de ensayo con 3 ml de
agua y agite obstruyendo la boca del tubo con el dedo. Observe lo que ocurri.
- Recoja 2 ml en otro tubo y adicione algunas gotas de solucin saturada de
cloruro de calcio, observe lo que ocurri.
- Repita el mismo ensayo para la solucin de acetato de plomo.
c) Prueba para Colesterol
- Recoja un poco (3 ml) de la fase etrea del embudo de separacin en un beacker
y, a seguir, pngalo en una plancha de calentamiento para que todo el ter se
evapore hasta que se seque (cuidado con esta operacin).
- Cuando el beacker estuviere fro adicione 2 ml de cloroformo, agitando con un
bastn de vidrio.
- Retire 2 ml para un tubo de ensayo y con este inclinado adicione a lo largo de la
pared 1 ml de H2SO4 concentrado.
- El aparecimiento de un anillo rojo confirma la presencia de colesterol.
16. BIBLIOGRAFIA
ALEMANY, M. y FONT, S. Prcticas de Bioqumica. Espaa: Alhambra, 1983.
BOHINSKI, R. C. Bioqumica. Bogot: Addison-Wesley Iberoamericana, 1991.
COOPER, T. C. Instrumentos y Tcnicas de Bioqumica. Espaa: Revert, S.A.
1984.

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GONZALEZ, J. M. et alli. Problemas de Bioqumica. Espaa: Alhambra, 1979.

MACARULLA, J. M. y MARIO, A. Bioqumica cuantitativa. Espaa: Revert,
S.A. 1988.

UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
PROGRAMA DE INGENERIA DE ALIMENTOS

BIOQUIMICA GENERAL
GUIAS DE LABORATORIO

PROF. CLAUDIA DENISE DE PAULA

M.Sc. CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

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MONTERIA, 2000

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