INTRODUCCION:

El SIDA, se identific por primera vez en 1981, es una enfermedad

infecciosa inducida por un virus VIH y caracterizada por una inmunidad
fuertemente deprimida. El principal determinante de la patogenicidad
del virus es el tropismo por los linfocitos T y los monocitos, quien utiliza
la molcula CD4 como receptor para ingresar e infectar las clulas.
Una caracterstica importante del VIH es que su replicacin en algunas
clulas parece restringida lo que da como resultado su mantenimiento
en una forma latente (periodo de ventana). La infeccin latente permite
que el genoma del VIH est presente en las clulas T y los macrfagos,
en ausencia de la expresin de las protenas virales, lo que da como
resultado clulas infectadas de manera persistente que permanecen
invisibles para el sistema inmune del husped.
El SIDA representa un amplio espectro de afecciones clnicas.
Habitualmente se produce cierto nmero de infecciones oportunistas y
procesos malignos que constituyen el signo distintivo del sndrome, el
ms comn es el Sarcoma de Kaposi
El diagnstico se establece por medio de la combinacin del
reconocimiento de un sndrome clnico, la demostracin de anticuerpos
anti VIH sricos por medio de ELISA y el Wester blot.
El examen de ELISA es una de la pruebas ms eficaces, rpida, efectiva
y confiable para detectar el virus del VIH su nombre viene del trmino
ingls "Enzyme-linked immunoabsorbent assay", que quiere decir
Ensayo inmunoenzimtico ligado a enzimas". su sensibilidad y fiabilidad
de esta prueba es alta, aunque no al cien por ciento. Eso significa que,
en caso de un resultado positivo, el diagnstico debe confirmarse
mediante una segunda prueba. Por coincidencia, ELISA puede detectar
otros anticuerpos que no tengan nada que ver con el VIH y que estn
presentes en la muestra de sangre.
Para identificar los anticuerpos como anticuerpos "reales" del VIH, se
realiza una segunda prueba en la misma muestra de sangre mediante la
tcnica "Western Bloot". Esta prueba visualiza la reaccin de los
anticuerpos frente a protenas estructurales independientes del VIH
Otras pruebas de laboratorio para confirmar la presencia de anticuerpos
del VIH, incluyen la inmunoelectrotransferencia o examen de Western
Blot, la inmunofluorescencia y la radioinmnoprecipitacin o RIPA.
"El periodo de ventana" o periodo de espera es el tiempo que una
persona infectada tarda en desarrollar los anticuerpos al virus. Para el
97% aproximadamente de las personas infectadas, el periodo de
ventana es de 3 meses. Despus de 6 meses casi todas las personas
que tengan el virus habrn desarrollado anticuerpos al mismo. Un

resultado negativo 6 meses despus del ltimo riesgo es suficiente para

descartar la posibilidad de infeccin. .
El perodo de ventana con las ltimas pruebas ELISA de cuarta
generacin vara de 10 a 14 das. Este periodo puede prolongarse
mximo por 6 meses.
VIRUS VIH
II. COMPETENCIAS
Observa y reconoce el principio del inmunoanlisis enzimtico (ELISA)
para el diagnstico del VIH.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS:
PREPARACION DE LOS REACTIVOS:
SOLUCION DE LAVADO
Diluir el Reactivo 2 (R2) al 1:20 en agua destilada para obtener una
solucin de lavado lista para su uso.
1 ml. de Reactivo R2 en 19 ml. De agua destilada
SOLUCION DE TRABAJO: DEL CONJUNGADO 2
Agitar con suma delicadeza el vial de conjugado liofilizado 2 (R7a) sobre
la mesa de trabajo para eliminar cualquier sustancia del tapn de
caucho.
Con cuidado retirar el tapn y verter el contenido del vial diluyente del
conjugado (R7b) en el vial del conjugado liofilizado R7a.
Poner de nuevo el tapn y dejar que se asiente por 10 minutos ir,
agitando por inversin de vez en cuando para facilitar su disolucin.
SOLUCION DE DESARROLLO ENZIMATICO: (SOLUCION SUSTRATO)
Diluir al 1:11 el cromogen (R9) en el tapn sustrato (R8). La estabilidad
dura 6 horas en la oscuridad una vez preparada.
PROCEDIMIENTO DEL TEST:
Establecer con cuidado la distribucin de las muestras y el plan de
identificacin.
Preparar la solucin de lavado diluida
Preparar la solucin de trabajo del conjugado 2
Sacar las bandejas y las tiras (R1) de la bolsa protectora
Aplicar directamente, sin lavado previo de la placa y de forma sucesiva
lo siguiente:
25 uL de conjugado 1 (R6) en cada pocillo

75 uL de control positivo Ag VIH (R5) en el pocillo A1

75 uL de control positivo Ab VIH (R4) en el pocillo B1
75 uL de control negativo (R3) en los pocillos C1, D1 y E1
75 uL de muestra en el pocillo G1
Homogenizar la mezcla mediante un mnimo de 3 aspiraciones con una
pipeta de 75 uL agitando la microplaca despus del paso del pipeteado.
Cubrir la microplaca con pelcula adhesiva. Apriete firmemente por todas
partes de la placa para asegurar un buen precintado.
Incubar la microplaca a 37C por 1 hora
Quitar la pelcula adhesiva y realizar los lavados:
Aspirar el contenido de los pocillos en un contenedor para productos
biolgicamente peligrosos (solucin con leja).
Agregar en cada pocillo un mnimo de 0.370 ml de solucin de lavado.
Deje que se empaque al menos 30 segundos. Aspirar y eliminar de
nuevo (Lavado)
Repetir este procedimiento un mnimo de 3 veces (3 lavados)
El volumen residual debe ser inferior a 10 uL (si es preciso secar la placa
agitando de arriba abajo en papel secante)
Distribuir rpidamente 100 uL de la solucin de conjugado2 en todos los
pocillos. El conjugado se debe agitar antes de su uso.
Siempre que sea posible, cubrir la microplaca con una nueva pelcula
adhesiva e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a
30C).
Retirar la pelcula adhesiva y realizar 5 lavados como mnimo (paso 8)
Distribuir rpidamente en cada pocillo 80uL de la solucin sustrato
recin preparada antes de su uso. Incubar en oscuridad a temperatura
ambiente durante 30 minutos. No se use la pelcula adhesiva durante
este paso.
Agregar 100 uL de la solucin de deteccin (R10) usando la misma
secuencia y tasa de distribucin que en la solucin sustrato.
PRINCIPIO DEL TEST:
La Prueba de ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos
marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes
tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de
los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin
antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente
revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la
enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable
mediante el uso de un espectrofotmetro.
ELISA.

Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los
anticuerpos objeto de estudio.
Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos
reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales
reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior
y que se encuentran fijados a los antgenos.
Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
Las tcnicas de ELISA se realizan mediante la adicin secuencial de
todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada
una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas
o con equipamiento para la automatizacin de todas y cada una de las
etapas. Esta completa automatizacin se justifica por la necesidad de
procesar y analizar un gran nmero de muestras y necesitar una elevada
repetibilidad de resultados
La distribucin de la solucin de deteccin, que no es coloreada, se
puede controlar visualmente en este paso de la manipulacin. Despus
de la adicin de la solucin de deteccin la coloracin rosada del
sustrato desaparece (en la muestra negativas) o se vuelve un color entre
azul y amarillo (para las muestras positivas)

PROCEDIMIENTO

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Un resultado positivo significa:
Que la persona es VIH-positiva.
Que es portadora del virus y debe tomar precauciones para no
transmitirle el virus a alguien ms.
Un resultado positivo NO significa:
Que la persona tenga el SIDA.
Que necesariamente vaya a desarrollar el SIDA.
Que sea inmune al SIDA por tener los anticuerpos.
Un resultado negativo significa:
Que no se encontraron anticuerpos al VIH en la muestra de sangre.
Un resultado negativo NO significa:
Que la persona no tenga el HIV
Que la persona sea inmune al VIH o SIDA.
Que tenga resistencia a la infeccin.
Que nunca vaya a desarrollar el SIDA.
Un resultado "indeterminado" de la prueba Western Blot (poco
comn) significa:
Que todo el procedimiento de prueba debe repetirse con otra
muestra de sangre, normalmente varias semanas ms tarde.
CONCLUSIONES.

Hemos observado y reconocido el principio

enzimtico (ELISA) para el diagnstico del VIH.

del

Inmunoanlisis

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH-1

El diagnstico de la infeccin por el VIH solo puede establecerse de modo
definitivo por medios de laboratorio ya que las manifestaciones clnicas son
inespecficas en cualquier estado de la enfermedad. Las pruebas de
laboratorio utilizadas para reconocer las infecciones por retrovirus humanos
pueden clasificarse en directas e indirectas (Figura 3). Segn persigan
demostrar la presencia del virus o de sus constituyentes (Protenas y cidos
nucleicos) o bien la respuesta inmunitaria (Humoral o celular) por parte del
husped.
FIGURA 3 Clasificacin de los mtodos de laboratorio para diagnstico
de infeccin por VIH.
Mtodos Directos
Cultivo Viral
Deteccin de cidos Nucleicos: PCR, bDNA, NASBA.
Antigenemia (p24).
Mtodos IndirectosDeteccin de anticuerpos especficos.
Pruebas Rpidas: Oral test.
Pruebas de Screening: ELISA, Aglutinacin, Inmunocromatografa.
Pruebas de Confirmacin y Suplementarias: WB,IFI.
Investigacin de inmunidad celular especfica.

Notas: bDNA (branched-DNA), ELISA (Enzimoinmunoanlisis), IFI (Inmunofluorescencia indirecta),

WB (Western Blood), NASBA (Amplificacin en la transcripcin de cidos nucleicos), PCR (Reaccin
en cadena de la Polimerasa).

PRUEBAS SEROLGICAS
La investigacin de anticuerpos en suero es la metodologa ms
frecuentemente utilizada para la identificacin de los individuos de VIH. La
presencia de anticuerpos anti-VIH lejos de reflejar una exposicin erradicacin
inmune del virus en el pasado, indica ms bien el estado de portador actual.

Existen diferentes tipos de pruebas para la deteccin de anticuerpos frente al

VIH. El diseo de algunas de ellas permite realizar gran nmero de anlisis a la
vez son las denominadas pruebas de Screening. En cambio, otras son de
realizacin ms compleja aunque proporcionan mayor especificidad se utilizan
para la confirmacin de la reactividad en una prueba inicial de Screening. La
seropositividad define mediante la demostracin de anticuerpos frente a las
protenas virales con reactividad repetida en las pruebas de Screening y
adems, con algunas de las pruebas de confirmacin 1.

PRUEBAS DE SCREENING
El enzimoinmunoanlisis (ELISA) es el mtodo ms utilizado como prueba de
Screening los antgenos provienen del lisado viral de un cultivo (ELISA de
primera generacin) o bien corresponden a protenas recombinadas (ELISA de
segunda generacin), que reproducen epitopos de virus, los EIA de segunda
generacin son ms sensibles y , sobre todo, ms especficos que los de
segunda generacin. Adems, las pruebas de ELISA pueden estar diseadas de
modo indirecto o competitivo segn el mecanismo por el que se reconoce la
precisin de anticuerpos en la muestra problema. En general los ELISA
indirectos son ms sensibles y los ELISA competitivos son ms especficos.
En los ltimos aos se han desarrollado nuevas tcnicas de ELISA que son ms
sensibles y especficas que las ELISA iniciales. Utilizan como antgenos
especiales, protenas recombinantes o pptidos sintticos de 10 a 40
aminocidos especficos del VIH-1 (en ocasiones, en asociacin con otros del
VIH-2). Las dos tcnicas son ELISA de tipo sndwich (Tercera generacin) y
ELISA de captura (Cuarta generacin). Estas pueden detectar todas las
subclases de anticuerpos y no solo la IgG. Esto explica su mayor sensibilidad
para reconocer la primoinfeccin por VIH-1, cuando la IgM es el primer
marcador de la seroconversin, as como para el diagnstico de la infeccin
peditrica, que cursa con IgM e IgA solo si el nio est infectado. Adems del
ELISA de captura es un mtodo de gran especificidad. Permitiendo la deteccin
simultnea de antgeno y anticuerpos, con una media de 8 das antes que los
de tercera generacin.
En la actualidad existen ms de 130 pruebas comerciales para la deteccin de
anticuerpos frente al VIH-1 en suero. En general las pruebas aprobadas para
los bancos de sangre gozan de excelente sensibilidad superior al 99,5%.

PRUEBAS DE DETECCIN RAPIDA.

Existen diversos mtodos para la deteccin rpida de anticuerpos frente al VIH.
Las pruebas de inmunoadherencia (dot-blot) son ms frecuentes aunque
tambin se han desarrollado ensayos de aglutinacin. 2. En general todas ellas
gozan de buena sensibilidad, especificidad y fundamentalmente acortan
ventajas en aquellos lugares en donde los test diagnsticos habituales son de
difcil incorporacin. La gran mayora tienen la capacidad de detectar las
distintas variantes de VIH-1 y VIH-2, por lo que su uso en frica y Sud-Amrica
cada vez es ms extendido, especialmente para diagnsticos urgentes.

La FDA aprob hace pocos aos la utilizacin de ensayos OralQuick con saliva
para su distribucin de venta libre en farmacias, este ensayo aporta la ventaja
de que nicamente requiera la muestra
de la saliva para su uso, sin embargo no se pude olvidar que un diagnstico
positivo tiene que ser confirmado por ELISAs especializados.

PRUEBAS DE CONFIRMACION
El Western-Blood (WB) es el mtodo ms empleado para la confirmacin de
resultados obtenidos con las pruebas de Screening. Permite discriminar frente
a qu antgenos virales se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra
problema, Otras metodologas de confirmacin como la Inmunofluorescencia
indirecta (IFI) presenta gran complejidad y gran subjetividad, lo que dificulta su
utilizacin sistemtica como pruebas de confirmacin 1.
En 1990 la OMS redacta la nomenclatura vigente de las bandas de protenas
del western blood y estableci los siguientes criterios para su interpretacin: la
positividad en el WB para VIH-1 requiere la presencia de al menos 2 bandas de
la envoltura; la negatividad resulta de la ausencia de bandas y los restantes
patrones se consideran indeterminados. (Fig. 5).

FIGURA 5. Causas de Wester Blood Indeterminado para VIH-1.

Infeccin por VIH-2

Seroconversin para el VIH-1.
Pacientes en estados muy avanzados de la enfermedad.
Nios de madres seropositivas.
Reactividad inespecfica.

ALGORRITMOS DIAGNSTICOS PROPUESTOS PARA LA INFECCIN

POR VIH

Una prueba de ELISA reactiva en una ocasin para anticuerpos frente al VIH-1
debe ser repetida en la misma muestra antes de ser valorada como tal. Todas
las muestras de ELISA repetidamente reactivas deben ser confirmadas con WB.
Diversos estudios han demostrado que la sensibilidad y la especificidad del
ELISA comercialmente son superiores al 98%, si bien, el nmero de falsos
positivos en un grupo de bajo riesgo de infeccin (como los donantes) quiz no
sea insignificante. Estos falsos positivos se han descrito en especial en
individuos con enfermedades autoinmunes y en pacientes con historias de
mltiples gestaciones o transfusiones, relacionados con la existencia de

anticuerpos frente a algunos antgenos HLA de clase II. La utilizacin de

pruebas de ELISA diseados con antgenos recombinantes o pptidos sintticos
ha reducido de manera considerable las reacciones cruzadas y prcticamente
en la actualidad una prueba de ELISA positivo es diagnstico de infeccin por
VIH.
En la Figura 6. Se recoge el algoritmo diagnstico recomendado para el
diagnstico de la infeccin por el VIH, es necesario tener en cuenta el tipo de
poblacin estudiada, ya sea donantes de sangre o poblacin de bajo recurso ya
que se han descrito falsos positivos en el WB. Aunque dicha metodologa es la
ms generalizada para la confirmacin de la reactividad inicial en una prueba
de Screening puede considerarse otro tipo de estrategias diagnsticas como la
confirmacin mediante LIA, en casos con resultados indeterminados.
En la Figura 7. El diagnstico de la infeccin aguda por el VIH ha adquirido
una especial relevancia segn se ha ido avanzando en el conocimiento de la
enfermedad. El conocer por un lado las caractersticas virolgicas de las cepas
(fundamentalmente la presencia de mutaciones de resistencia y el subtipo
viral) que son responsables de las nuevas infecciones y por otro lado las
ventajas que representa la instauracin de terapia antiretroviral en este
perodo ha hecho que se adopten nuevas estrategias diferentes a fin de
diagnosticar estas infecciones. Estas incluyen adems de la realizacin de
viremia plasmtica para los casos previos a la seroconversin la utilizacin de
test de ELISA especiales y estndar para el diagnstico de la enfermedad ante
un accidente laboral o un contacto sexual de riesgo.

FIGURA 7. ALGORITMO DIAGNOSTICO DEL VIH EN LABORATORIO.

BIBLIOGRAFIA
BETANCUR, Julin; Correa, Ana; Estrada, Santiago; Orozco, Beatriz.
Fundamentos de Medicina: Manual de VIH/SIDA y otras Infecciones de
Transmisin Sexual. Segunda Edicin. CIB, Corporacin para
investigaciones bilgicas. Medelln, Colombia. 2007.
Vlez, H. Rojas, W. Borrero, J. Restrepo J. (2005). Manual de VIH/SIDA y
otras enfermedades de trasmisin sexual.Colombia: Corporacin para
investigaciones biolgicas.
Volk, W. (1997). Microbiologa Bsica. 7 ed. Editorial Harla. Mxico-D.F.
Koneman, E. (1999). Diagnstico Microbiolgico. Editorial Mdica
Panamericana. Buenos Aires- Argentina.