GUA DE LABORATORIO MICROBIOLOGA INDUSTRIAL I

UBICUIDAD MICROBIANA Y TCNICAS DE AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS
1.

OBJETIVO

Reconocer la ubicuidad de los microorganismos mediante la toma de muestras de aire,

superficie y flora corporal empleando la tcnica de la placa expuesta.
2. MATERIALES
Cajas de petri con agar nutritivo
Mecheros de Alcohol
Alcohol antisptico
Jabn de Manos

3. PROCEDIMIENTO
PRIMERA ETAPA.

AISLAMIENTO.

Se evaluarn la esterilidad de varias zonas de laboratorio. Retire la tapa de la caja de petri

Grupo 1.
Grupo 2.
Grupo 3.
Grupo 4.
Grupo 5.

Cmara de Flujo Laminar y rea de lavado. Tiempo Exposicin 10 minutos

Dedos y manos.
Sople sobre una caja de petri con agar nutritivo. Batas de Laboratorio,
Mesones del Laboratorio

Incubar las cajas a 37C entre 24 y 48 horas.

SEGUNDA ETAPA. TINCIN Y PURIFICACIN (13 Septiemtre).

3.1 Tincin de Bacterias. Realizar un frotis de las bacterias, para ello tome con un asa un
poco de crecimiento bacteriano y sobre una lmina impregnada con una gota de agua esparza
la bacteria con ayuda del asa.
2.2. Deje secar a temperatura ambiente
2.3. Flamear con ayuda de un mechero rpidamente.
2.4. Realizar Coloracin de Gram
2.4.1. Esparcir sobre el frotis gotas de cristal violeta, y teir por 1 minuto. Lavar
suavemente con agua.
2.4.2. Esparcir sobre el frotis gotas de Lugol. Dejar actuar por 1 minuto. Lavar
suavemente con agua.
2.4.3. Esparcir sobre el frotis gotas de acetona, dejar actuar por 30 segundos
2.4.4. Esparcir sobre el frotis gotas de Fucsina de Gram. Dejar actuar por 1 minuto.
2.4.5. Escurra las lminas y observe al microscopio, primero en objetivo de 10X, 40X y
por ltimo en objetivo de 100X con aceite de inmersin.
3.2 Aislamiento de Bacterias. Tcnica de Siembra por Estras en Placa
3.2.1 Con un asa de platino, tome una pequea cantidad de bacterias y psela a la superficie el
medio de cultivo agar nutritivo y siembre en el medio por estra

Figura 1. Siembra en Placa por Aislamiento por el Mtodo de Dilucin por Estra
3.3 Tcnica
3.3.1 Con un lpiz graso divida la caja Petri en 3 sectores, de tal manera que al
destaparla para proceder a la inoculacin, se tenga como se indica en la figura:

3.3.2. En condiciones aspticas con un asa tome bacterias, a partir de los cultivos
bacterianos obtenidos.

3.3.3 Levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y descargar el material en el

sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector.
3.3.4 Cerrar la caja y esterilizar el asa flamendola y mientras que se enfra, girar la
caja 90 hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha.
3.3.5. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco
de material al sector 2 y las siguientes estras no deben tocar el sector. De esta forma se
diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras.
3.3.6 Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90 y ahora el sector 2 estar a la
izquierda y el 3 a la derecha.
3.3.7 Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el
sector 2, como se muestra en el dibujo:

3.3.8 Incubar a 37C por 24-28horas. Al cabo de este tiempo observar las colonias
aisladas.

4. OBSERVACIONES
4.1 Observe las cajas de petri con agar nutritivo, provenientes de los diferentes grupos,
describa macroscpicamente los tipos de colonias bacterianas observados. Tenga en cuenta
tamao, forma, textura, borde y color. (Figura 2).
FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide.
TAMAO: Estimar el dimetro en mm.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc.
ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada.
BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc.
ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa.
COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color
blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.
OPACIDAD: Transparente, opaca, brillante.
CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa. Usar el asa bacteriolgica
para determinar la consistencia.

Figura 2. Descripcin Macroscpica de Colonias Bacterianas

4.2 Describa el comportamiento que tienen las bacterias aisladas con respecto a la
coloracin de Gram, que microorganismos son ms predominantes?
4.3 Existen diferencias en morfologa macroscpica entre la microflora proveniente de los
diferentes tratamientos realizados por los grupos?
4.4 De acuerdo a los resultados que recomendaciones hara para el trabajo asptico en el
laboratorio de microbiologa.
PROCEDIMIENTOS DE TINCIN EN BACTERIAS
La coloracin en bacterias tiene como fin aumentar el contraste de las clulas con el medio que
las rodea. Lo que implica mejorar la visualizacin de las bacterias y permitir la distincin de
formas y tamaos, diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados
colorantes y revelar la presencia de distintas estructuras internas.
Los colorantes utilizados son sales en los que el anin o el catin es el responsable del color;
en el primer caso se trata de un colorante cido o aninico y en el segundo, bsico o catinico.
La clula bacteriana tiene una dbil carga negativa cuando el medio externo tiene un pH
cercano a la neutralidad. La diferencia de carga elctrica determina la afinidad entre el
colorante y la clula, las bacterias tendrn afinidad por los colorantes bsicos (ej: cristal violeta
y azul de metileno). En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, estas sustancia,
contribuye a la fijacin del colorante a la clula (ej: cido tnico, sales de Al, Fe).
Cuando se utiliza un solo colorante bsico el mtodo se denomina coloracin simple, mientras
que se llama coloracin compuesta cuando se usan dos o ms, la coloracin diferencial es un
caso particular de coloracin compuesta.
Existe tambin un tipo de tincin negativa o indirecta en este caso el colorante cido no se une
a las clulas cargadas negativamente, pero se deposita alrededor de ellas quedando as un
fondo coloreado donde contrastan las clulas incoloras.

COLORACIN DE GRAM
Es un tipo de tincin diferencial, por este mtodo se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram
positivos (Gram +) y Gram negativos (Gram -), en funcin de su reaccin frente a la coloracin.
Las clulas fijadas se tien con cristal violeta, se lavan y se tratan con lugol. El iodo
forma un complejo con el cristal violeta, que sirve para fijar ste a la clula. Se agrega un
agente decolorante (alcohol, acetona o mezcla de ambos) en el cual el complejo yodocristal violeta es soluble. Los microorganismos Gram son decolorados mientras que los
Gram + no. Luego de la decoloracin se aplica un colorante de contraste, generalmente
safranina, que hace visible los microorganismos Gram que haban sido decolorados.
Por tanto Gram positivos (Violetas), Gram negativos (Rosados).
Las bacterias Gram positivas poseen paredes gruesas de peptidoglicano, se deshidratan
por el alcohol, lo que provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el
complejo yodo-cristal violeta salga de la clula.
Las bacterias Gram negativas, la fina capa de peptidoglicano no evita el pasaje del
solvente, por lo que el complejo yodo-cristal violeta escapa de la clula
Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composicin qumica
diferente, se tien como Gram positivas.
NO SON LOS CONSTITUYENTES QUMICOS, SINO LA ESTRUCTURA FSICA DE LA PARED LO
QUE LE CONFIERE LA GRAM POSITIVIDAD.