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pH: El pH es otro factor que influye en la actividad enzimtica, Cada enzima realiza su
accin dentro de un determinado intervalo de pH, dentro de este intervalo habr un pH
ptimo donde la actividad enzimtica ser mxima. Por debajo del pH minimo o por encima
del pH mximo el enzima se inactiva ya que se desnaturaliza. En la mayora de las enzimas
el pH ptimo est prximo a la neutralidad, aunque hay excepciones
Agitacin: Es importante no agitar en exceso las soluciones de enzimas (o protenas en
general) ya que estas forman espuma lo que puede causar problemas en los
procedimientos que se quiera realizar y adems puede denaturar la enzima.
La forma correcta de homogenizarla es mover ligeramente la solucin sin crear espuma, y
succionar con la micropipeta varias veces.
Glucosa Oxidasa
La glucosa oxidasa es una oxidorreductasa que cataliza la oxidacin de la glucosa para
formar perxido de hidrgeno y D-glucono--lactona (Acido glucnico ?). Es ampliamente
utilizada para la determinacin y cuantificacin de glucosa libre en los fluidos biolgicos,
tales como sangre y orina
La glucosa se oxida por accin de la glucosa oxidasa para dar cido glucnico y
perxido de hidrgeno.
El perxido de hidrgeno reacciona en presencia de peroxidasa con fenol y 4aminoantipiridina para dar lugar a un tinte de quinonimina rojo. La intensidad del
color formado es proporcional a la concentracin de glucosa y se puede medir
fotomtricamente entre 460 y 560 nm (mximo de absorcion a los 505 nm)
Es conveniente analizar junto con las muestras sueros controles valorados para
Glucosa por este mtodo
*se obtiene de Aspergillus niger recombinante
Alcohol Desidrogenasa
El etanol se puede oxidar a acetaldehdo por el NAD en presencia de la enzima alcohol
dehidrogenasa (ADH) para producir NADH. El NADH producido se determina
espectrofotomtricamente a 340nm
Etanol + NAD+
Acetaldehdo + NADH + H+
Primero se us la polimerasa de la E. coli, El problema es que las hebras una vez copiadas
tenan que separarse ponindolas a ms de 90C para poder permitir que volvieran a
copiarse y la enzima se desnaturaliza. Posteriormente se aisl la Taq polimerasa que
resiste altas temperaturas, sin embargo se utiliza la AmpliTaq que es la polimerasa de la
E. coli, es recombinante, ya que contiene el gen de la Taq y logra ser ms pura, y fcil de
cultivar.
PCR:
La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica in vitro utilizada para amplificar
enzimticamente una regin determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN
cuya secuencia se conoce. Se basa en el proceso de replicacin (DNA polimerasa).
el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a
enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos repetitivos de:
desnaturalizacin del ADN por fusin a temperatura elevada, a fin de convertir el
ADN bicatenario en ADN monocatenario; se utilizan de 93 a 96C. La temperatura
depende del tipo de disolvente, de la concentracin salina , del pH utilizado y de la
concentracin de G-C respecto de T-A.
unin (anillamiento) de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores, al ADN diana;
extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir de los cebadores
utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+.
Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son
diferentes entre s y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el
segmento de ADN diana que debe amplificarse.
Las mismas cadenas producidas luego pueden ocuparse como molde.
qPCR:
La sensibilidad de la tcnica de PCR es muy alta pero presenta algunos inconvenientes,
como son que no es una tcnica cuantitativa, para solventar el problema de la
cuantificacin se han generado unas variaciones sobre el esquema inicial de la PCR,
dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa o PCR en tiempo real.
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real la
amplificacin de nuestro genoma de inters. Para llevar a cabo esta deteccin existen
varios mtodos pero casi todos basados en la utilizacin de otro fragmento de ADN
(sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar. Esta
sonda lleva adherida una molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta
fluorescencia ("quencher"), de tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su
sitio por accin de la ADN polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del
"quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser. La cuantificacin de la
fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR ser proporcional a la cantidad de
ADN que se est amplificando.
Transcriptasa reversa: La funcin de la enzima es convertir el mRNA en DNAc. La
transcriptasa inversa procede de retrovirus y usa como molde una cadena sencilla de
ARN para dar lugar a una cadena sencilla de ADNc. La transcriptasa inversa emplea
ARNm maduro como molde y por tanto el ADNc no contiene los intrones que poseen los
genes eucariotas. As la secuencias de ADNc corresponden nicamente secuencias
codificadoras de protenas.
Endonucleasas de restriccin: Son protenas bacterianas que cortan fragmentos de la
molcula de DNA reconociendo una secuencia especfica de nucletidos, cortando el
DNA donde esta combinacin ocurra.
Es una tcnica muy frecuentemente utilizada en los estudios moleculares, y consiste en
la combinacin de dos mtodos bsicos en el trabajo molecular. En primer lugar se
realiza una amplificacin por PCR del gen que queremos estudiar, y posteriormente se
realiza la digestin (o corte en fragmentos) del producto amplificado con enzimas de
restriccin, para ver los fragmentos resultantes o fragmentos de restriccin de ese
gen. Este mtodo es til para detectar pequeas inserciones o deleciones en
determinados fragmentos de restriccin de un gen, ya que el tamao de los mismos se
ver aumentado o disminuido, respectivamente. En otros casos, ciertas mutaciones
puntuales en un gen, que alteran la secuencia de nucletidos del mismo, pueden crear
nuevos sitios de restriccin o hacer desaparecer aquellos presentes en el gen normal, lo
que alterar el patrn de los fragmentos de restriccin observables en electroforesis.
Cuando las secuencias son polimrficas dan el mismo resultado en la electroforesis.
DNAsas:
Los sistemas reconocen pequeas secuencias especficas de DNA y quiebran, ya sea
dentro o a una determinada distancia pequea de la secuencia de reconocimiento,
produciendo fragmentos especficos de cadena doble con 5 fosfatos terminales.
Si tratamos de obtener RNA, el DNA se elimina por las DNAsas, que produce pequeos
segmentos dializables, susceptibles de ser separados por dilisis.
Inmunoblot
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada, para el estudio de
protenas. Este mtodo permite la deteccin de una sola protena dentro de una muestra
ELISA
La tcnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada para la deteccin
de muy diversas molculas biolgicas, basndose en la especificidad del reconocimiento
antgeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimticas.
En el caso del antgeno unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo antiantgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un
secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la
Elisa indirecto
(voy a explicarlo con la pura imagen ) C:
Inmunohistoqumica :D
Esta tcnica sirve para detectar la presencia de una protena especfica en una clula de un
tejido. La especificidad se da mediante la relacin antgeno anticuerpo y la la deteccin se
realiza mediante un anticuerpo unido a enzima que puede catalizar una reaccin con un
sustrato cromgeno.
Primero se toma la muestra del tejido y se fija con formalina, parafinna y todas esas cosas
msticas que hacen los morfo.
Luego se agregan anticuerpos espcificos para marcar la protena de inters y
posteriormente anticuerpos secundarios que van a estar conjugados con enzima, al agregar
posteriormente el sustrato, ste reaccionar con la enzima generando las manchas cafs
que se ven en la imagen lo cual nos da informacin sobre la cantidad de protena presente
en la celula
*lo que no recuerdo con exactitud es si se poda hacer solo con un anticuerpo con enzima o
era como lo escrib (primer anticuerpo de marcacin y luego el secundario con enzima)