ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

ngela Mara Guerrero

Geraldin Ramirez
Daniel Santiago Chvez Goyes
Cristian Hincapi
Mara Jos Bolaos Hernndez

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

PRESENTADO A: ARLEY CAMILO PATIO

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y ALIMENTARIAS
QUMICA FARMACUTICA
MEDELLN
2015

INTRODUCCIN
Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para
separaciones electroforticas, dado que renen una serie de propiedades idneas:
transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran
variedad de compuestos qumicos. La poliacrilamida se forma por
copolimerizacin de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'metiln-bis-acrilamida), en una reaccin iniciada por la tetrametiletilndiamina
(TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual
a su vez activa al monmero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de
poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formndose as una
red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las
condiciones de la reaccin y las concentraciones de los monmeros. Entre las
diversas tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas
en ingls "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la ms utilizada es
la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de
sodio (SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de protenas, como para ser
combinada con tcnicas de inmunoelectrotransferencia (Captulo 14). En la tnica
de SDS-PAGE, se mezclan las protenas con el detergente aninico SDS para
formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS
unido a las protenas es proporcional a su tamao: el SDS se une en una
proporcin aproximada de 1,4 g SDS/g protena. Los complejos protena/SDS
poseen una estructura elipsoide o de bastn, donde la cadena proteica es
distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relacin final carga/masa
queda constante para las distintas protenas (se anula su carga intrnseca), estas
van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus
diferencias de peso molecular (PM): a menor tamao, mayor movilidad de la
protena, y viceversa.

MARCO TEORICO
La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas cargadas por
migracin en un campo elctrico. Las molculas se separan en funcin de su
carga elctrica, desplazndose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad
cuanto mayor es la carga de la molcula. Cada molcula se desplaza en el campo
elctrico alcanzando una velocidad constante. En el estado estacionario, la fuerza
impulsora (fuerza del campo elctrico) se equilibra con la resistencia al avance
(fuerza de friccin hidrodinmica) en el medio en que se desplaza. Se define la
movilidad electrofortica como la velocidad de desplazamiento por unidad de
campo elctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente
movilidad de cada molcula define su comportamiento y separacin en el espacio.
Diferentes molculas tendrn diferente movilidad electrofortica en un medio
determinado. Hay tres tipos de electroforesis: De frente mvil. Zonal. Continua.
Se pueden utilizar diferentes medios de soporte para evitar perturbaciones
mecnicas y los efectos de las corrientes de conveccin en la separacin. Como
medios de soporte se pueden utilizar papel, acetato de celulosa, geles de almidn,
geles de agarosa o geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida son el
resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y
bisacrilamida. Controlando la concentracin de ambas obtenemos geles de
diferente grado de reticulacin (diferente dimetro de poro). Uno de los mtodos
de electroforesis ms comnmente aplicado para protenas es el que emplea
geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) en presencia
del detergente aninico dodecilsulfato sdico (SDS). Esta tcnica es conocida
como SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa vertical. En la preparacin
del gel, la polimerizacin de los monmeros de acrilamida produce cadenas
lineales. Al incluir bisacrilamida, sta da lugar a puntos de ramificacin en el
polmero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de
poliacrilamida. El tamao de los huecos o poros que forma la retcula del polmero
depende de la concentracin de acrilamida y del grado de entrecruzamiento (es
decir, de la proporcin de bisacrilamida con respecto al total). As, variando la
concentracin de acrilamida y bisacrilamida en la preparacin del gel se consiguen
distintos grados de porosidad y, por tanto, distintos intervalos de separacin de
protenas. Tambin se aade un tampn (comnmente Tris-HCl). Adems, se
aade un agente iniciador de la polimerizacn como el persulfato amnico, que al
disolverse en agua genera radicales libres que transforman la acrilamida en radical
libre y se inicia la polimerizacin. Tambin se aade al medio TEMED (N,N,N,Ntetrametil-etilenodiamina) como catalizador porque puede existir en forma de
radical libre. Las muestras proteicas se tratan, previamente a su fraccionamiento,
con SDS a 100 C. Como consecuencia de este tratamiento y de la presencia

posterior de SDS durante toda la separacin (tanto en el tampn de electroforesis

como en la composicin del gel), las protenas se mantienen desnaturalizadas. El
SDS tiene la propiedad de unirse a las cadenas polipeptdicas en una proporcin
masa:masa constante (1.4 g SDS/g de protena), de modo que en el complejo
SDS-protena la carga de la protena queda enmascarada por la de las mltiples
molculas de SDS y sta es proporcional al tamao (n de aminocidos). Esta
electroforesis es discontinua pues utiliza dos geles: Un gel concentrador con bajo
grado de reticulacin y pH 6,8 ( gel acumulador o stacking gel). Un gel separador
con grado de reticulacin mayor con valores entre 6% y 15%, pudindose tambin
utilizar gradientes de concentracin de acrilamida (gel separador). En la
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, la separacin de protenas se
hace en funcin de la masa molecular. Tanto es as que la representacin del
logaritmo de la masa molecular frente a la distancia migrada obedece a una lnea
recta para gran nmero de protenas. Para que esta dependencia sea correcta, es
preciso romper los puentes disulfuro intra- e intercatenarios, para lo cual es
frecuente aadir durante la preparacin de la muestra un agente reductor,
generalmente 2- mercaptoetanol. De este modo, la masa molecular observada
corresponde a la de cada subunidad de una protena, no a la protena completa, al
existir una relacin lineal. Para aplicar la muestra al gel, se le suele aadir un
agente que la haga ms densa, generalmente glicerina o sacarosa. Adems, para
seguir el avance de la separacin, se aade un colorante, como azul de
bromofenol, que sirve como referencia (tracking dye). ste tiene una movilidad
mayor que la de cualquier macromolcula y, por tanto, si se aplica corriente hasta
que el colorante est a poca distancia del extremo inferior del gel, se tiene la
seguridad de que ninguna macromolcula se ha salido del gel por avance
excesivo.

DATOS Y RESULTADOS

CONCLUSIONES

PREGUNTAS

CUAL ES LA INFLUECIA DE:

1. EL PH DE APILAMIENTO SOBRE LA CALIDAD DE LAS BANDAS?
El gel de apilamiento es un gel de poliacrilamida con tamao de poro
grande (4%T). Este gel est preparado con un tampn de Tris/HCl con
un pH de 6,8, dos unidades de pH menor que el tampn de electroforesis
(Tris/glicina). Estas condiciones proporcionan un ambiente para las
reacciones de Kohlrausch que determinan la conductividad molar, y como
resultado, las protenas recubiertas con SDS se concentran varias veces,
resultando as en pocos minutos una zona de inicio del orden de 19 m.
Este gel se coloca sobre el gel de resolucin. La altura de la zona
correspondiente al gel de apilamiento debe ser superior al doble de la altura
y el volumen de la muestra que va a ser aplicada.

2. LA CONSENTRACION DE MONOMERO EN EL GEL DE SEPARACION

SOBRE LA CAPACIDAD PARA DIFERENCIAR DOS PROTEINAS CON
(pl) MUY PARECIDOS:

BIBLIOGRAFIA