SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI

LABORATORIO CENTRAL DE SADE PUBLICA

Dr. COSTA ALVARENGA.

POP N
25.1.01.03.034

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRO - POP

TTULO: IDENTIFICAO DE COCOS GRAM POSITIVOS

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ELABORADO POR:

REVISADO POR:

Gildevane Vieira do
Nascimento
Farmacutica Bioqumica

Ismania Maria Ramalho

Farmacutica Bioqumica

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APROVADO POR
Ronaldo Costa
Gerente Tcnico

Data: _____ / _____ / ______

1.0 OBJETIVO
Este procedimento operacional padro (pop) padroniza condies e procedimentos para
isolamento de cocos gram positivos de amostras clnicas.
2.0 CAMPO DE APLICAO
Este POP se aplica identificao do patgeno isolado das amostras clnicas
3.0 REFERNCIAS
3.1. Normativas
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)

3.2. Complementares
No se aplica
4.0 DEFINIES E SIGLAS

BACTE Bacteriologia Geral

POP Procedimento Operacional Padro
CGP Cocos Gram Positivos
NA No Aplicvel
AS gar Sangue
BHI Brain Heart Infusion Broth
CLED Cistina-Lactose-Eletrlitos-Deficiente
TSA Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (Antibiograma)
DNASE Desoxirribonuclease
NaCl Cloreto de sdio
HCl cido clordrico
H2O2 Perxido de Hidrognio (gua oxigenada)
1N Uma normalidade ( 1 Normal)
UFC Unidade Formadora de Colnia
UFC/ml Unidade Formadora de Colnia por mililitro
mm milmetro
ml - mililitro

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alfa
beta
gama
g / mcg micrograma
UI Unidades Internacionais
OP Optoquina
PB Polimixina B
SXt /SUT Sulfametoxazol-Trimetoprim
B Bacitracina
NV Novobiocina

5.0 RESPONSABILIDADES
Farmacuticos Bioqumicos e tcnicos em patologia
6.0 PROCEDIMENTO
Para efeito deste POP, aplicam-se as seguintes definies:
6.1 Da amostra
Colnias com crescimento de 24 horas, isoladas de meios prprios e cujo resultado da
colorao de Gram foi Coco Gram Positivo;
6.2 Das amostras inadequadas
Colnias aglomeradas, ou seja, sem isolamento adequado;
Colnias velhas, ou seja, com crescimento superior a 24 horas.
6.3 Dos limites de deteco
A semeadura de grandes quantidades de amostra, nos meios de identificao, pode causar
a identificao incorreta;
Meios de cultura e reativos sem controle interno de qualidade podero apresentar resultados
incompatveis
7.0 - SINONMIA
Identificao manual dos CGP
8.0 DEFINIES
Para efeito deste POP, aplicam-se as seguintes definies:
8.1 Da amostra
Colnias com crescimento de 24 horas, isoladas de meios prprios e cujo resultado da
colorao de Gram foi Bacilo ou Cocobacilo Gram Negativo;

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8.2 Das Amostras Inadequadas

Colnias aglomeradas, ou seja, sem isolamento adequado;
Colnias velhas, ou seja, com crescimento superior a 24 horas.
8.3 Dos limites de deteco
A semeadura de grandes quantidades de amostra, nos meios de identificao, pode causar
a viragem do pH dos meios e no permitir a identificao correta;
Meios de cultura e reativos sem controle interno de qualidade podero apresentar resultados
incompatveis

9.0. PRINCPIO DO MTODO

A identificao das amostras identificadas pela colorao de GRAM como CGP baseada,
principalmente, na determinao da presena ou no das diferentes enzimas do material
gentico bacteriano. Estas enzimas regulam o metabolismo das bactrias ao longo das
diversas vias metablicas.
Atravs dos meios de triagem e bioqumicos, juntamente com um sistema indicador,
identificar as amostras isoladas a nvel de gnero e, se possvel, espcie.
9.1 Reagentes e material
Ala e Agulha de nquel-cromo;
Ala ou agulha de platina;
Pilot para Retroprojetor;
Bico de Bunsen;
Reativos: cido Clordrico a 1N (para DNAse), H2O2 a 3% (para catalase)
Coagulo-plasma
Ltex para Identificao de estreptococos dos grupos A,B,C,D,F e G de Lancefield
Meios de triagem e bioqumico: Bile Esculina, BHI com NaCl a 6,5%, DNAse
Discos antimocrobianos de Polimixina B de 300 UI, Novobiocina de 05 g, Bacitracina de
0,04 UI, Sulfametoxazol-Trimetoprim de 25 g, Optoquina de 05 g
Salina
Mueller Hinton com e sem 5% de sangue de carneiro
Jarra de CO2 (microaerofilia)
Tubos de vidro
Placa descartvel
Palito de plstico
Hipoclorito de sdio a 2%;
lcool a 70%;
Gaze em compressa;
Papel toalha.
9.2 Equipamentos
Cmara de segurana biolgica;

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Estufa bacteriolgica aferida com a temperatura 35-37C;

Refrigerador.
9.3 Preparao dos Reagentes e Insumos
As placas e os demais meios devem estar com o meio (gar) em temperatura ambiente
antes da semeadura. Se necessrio, fazer um pr-aquecimento colocando as placas e os
tubos na estufa bacteriolgica por aproximadamente cinco minutos. No caso das placas, a
parte inferior da placa (parte contendo o meio) deve ficar em contato com a placa de
aquecimento da estufa e a tampa um pouco aberta.
Os meios no podem estar com gua de condensao no gar, com contaminao (fungos,
colnias bacterianas), com o meio desidratado (ressecado).
Os reativos devem estar em temperatura ambiente.
10.0 PROCEDIMENTO ANALTICO
Antes de iniciar, limpar a bancada de trabalho com hipoclorito e lcool 70 %;
Numerar as placas e tubos com o nmero do laboratrio com o auxlio do pilot;
Sempre dentro da rea de segurana do bico de Bunsen:
Observar o tipo de Hemlise
Na placa de gar sangue observar o tipo de hemlise:
Alfa hemoltico ()- halo de hemlise parcial, com colorao esverdeada ao redor da colnia.
Beta hemoltico () halo de hemlise total ao redor da colnia.
No hemolticos ou gama hemoltico () ausncia de halo de hemlise ao redor da colnia.
Prova de Catalase
Este teste empregado para diferenciar os dois grandes grupos: Micrococcus spp /
Staphylococcus spp de Streptococcus spp / Enterococcus spp
Colocar na placa de vidro, 1 gota de H2O2 a 3%
Com auxlio da agulha de nquel-cromo flambada e fria, retirar uma colnia da amostra e
encostar sobre o reativo e verificar resultado;
Resultado:
Positivo formao de bolhas suspeita de Micrococcus spp ou Staphylococcus spp (itens
3.3, 3.4, 3.5 e 3.6)
Negativo ausncia de bolhas suspeita de Streptococcus spp ou Enterococcus spp (itens
3.7,3.8,3.9,3.10 e 3.11)
OBS: Para este teste no se recomenda a retirada da colnia do meio de gar sangue, pois
pode haver resultado falso positivo
.
Teste da Coagulase livre (teste em tubo):
Seguir as instrues do fabricante para reconstituir o coaguloplasma
Em um tubo de vidro colocar 0,5 ml (ou conforme instrues do fabricante) de
coaguloplasma. Com auxlio da agulha de nquel-cromo flambada e fria, retirar colnias da
amostra suspeita e descarregar (esgotar) todo o material no tubo com coaguloplasma (fig 1)
Incubar por 3 horas em estufa bacteriolgica aferida com a temperatura 35-37C. Aps este
perodo de incubao, realizar a primeira leitura.
Resultado:
Positivo formao de cogulo

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Negativo ausncia de cogulo

Se negativo, re-incubar por mais 3 horas e realizar nova leitura. Repetir este processo at
completar 24 horas de incubao. Somente aps 24 horas de incubao o resultado pode
ser liberado como negativo
OBS: a leitura no pode ser apenas aps 24 horas de incubao, pois pode haver resultado
falso negativo.
Prova de DNAse
Na placa de petri contendo o meio de DNAse, com auxlio de agulha ou ala de nquelcromo flambada e fria, semear colnia da amostra suspeita de forma circular (spot) e
densa.
Semear juntamente com amostra suspeita, o controle positivo (Staphylococcus aureus)
Incubar, por 18 24 horas, a(s) placa(s) em estufa bacteriolgica aferida com a temperatura
35-37C.
Aps perodo de incubao, colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1N at banhar
totalmente a superfcie do meio.
Aguardar aproximadamente 3 minutos ou at que o meio fique opaco
Resultado:
Positivo aparecimento de qualquer halo transparente ao redor do spot bacteriano
Negativo no h aparecimento de halo transparente ao redor do spot bacteriano
OBS: Comparar com controle positivo
Teste com o disco impregnado com Bacitracina de 0,04 UI, Polimixina B de 300 UI e
Novobiocina de 05 g
Fazer uma suspenso da cepa com salina estril at atingir a concentrao 0,5 da escala de
Mac Farland,
Semear, com auxlio de um swab estril, em 3 direes em meio de Mueller Hinton (fig 3 a
5)

Fig 3

Fig 4

Fig 5

Esperar 10 a 15 minutos e com o auxlio de uma pina flambada e fria, colocar os discos de
Bacitracina, Polimixina B e Novobiocina
Incubar por 18 24 horas, em estufa bacteriolgica aferida com a temperatura 35-37C
Aps o perodo de incubao, realizar a leitura do halo, com auxlio da rgua milimetrada
(leitura do dimetro) (fig 6)

Fig 6

mm

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Bacitracina
Sensvel halo 10 mm
Resistente halo 10 mm
Novobiocina
Sensvel halo 16 mm
Resistente halo 16 mm
Polimixina B
Sensvel halo 12 mm
Resistente halo 11 mm
OBS: Este teste poder ser realizado no Antibiograma
Teste do BHI com NaCl a 6,5%
Este teste empregado para diferenciar as espcies de enterococos dos estreptococos do
grupo D no enterococo
Com auxlio de agulha ou ala de nquel-cromo flambada e fria, apenas esgotar a agulha ou
ala com a amostra (fig 1)
Incubar por 18 24 horas, todos os meios em estufa bacteriolgica aferida com a
temperatura 35-37C
Resultados, aps perodo de incubao:
Positivo crescimento bacteriano com turvao do meio
Negativo sem crescimento bacteriano
Teste do Ltex
Para as amostras com beta hemlise, poder realizar o teste de ltex com o Kit para a
identificao dos grupos A,B,C,D, F e G de Lancefield.
Realizar o teste conforme as instrues do Kit existente no setor.
Teste do CAMP
Este teste empregado para identificao presuntiva dos estreptococos do grupo B
Em meio de gar sangue, fazer, com auxlio de uma agulha de nquel-cromo flambada e fria,
uma estria central com uma cepa de S.aureus produtor de beta hemlise no meio do gar
(fig 7).
Com auxlio de uma agulha de nquel-cromo flambada e fria, semear transversalmente as
amostra teste, sem encostar na estria de Staphylococcus. (fig 8)
Incubar por 18 24 horas, em estufa bacteriolgica aferida com a temperatura 35-37C e
em atmosfera de 3 a 5% CO2 .

Fig 7

Aps o perodo de incubao observar o resultado:

Fig 8

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Positivo Formao de halo de hemolise em forma de seta, na interseco da semeadura

(fig 9)
Negativo Sem halo de hemlise, sem Formao de halo de hemolise em forma de seta,
na interseco da semeadura

Fig 9

Teste da Bile-Esculina
Este teste empregado para identificao presuntiva de espcies de enterococcus e de
estreptococos do grupo D
Com auxlio de agulha ou ala de nquel-cromo flambada e fria, retirar uma colnia (ou
parte) e semear no meio de Bile esculina bisel (fig 10)

Fig 10
Incubar por 18 24 horas, todos os meios em estufa bacteriolgica aferida com a
temperatura 35-37C
Resultados, aps perodo de incubao:
Positivo escurecimento do meio (castanho marrom)
Negativo colorao do meio inalterado
Teste com o disco impregnado com Sulfametoxazol-Trimetoprim de 25 g (para diferenciar
os estreptococos dos grupoa A e B dos demais grupos), Bacitracina 0,04 UI (para
identificao presuntiva do estreptococo do grupo A) e Optoquina de 05 g (para diferenciar
S.pneumoniae de outros estreptococos viridans)
Fazer uma suspenso da cepa com salina estril at atingir a concentrao 0,5 da escala de
Mac Farland,
Semear, com auxlio de um swab estril, em 3 direes em meio de Mueller Hinton com 5%
de sangue de carneiro (fig 3 a 5)
Esperar 10 a 15 minutos e com o auxlio de uma pina flambada e fria, colocar os discos de
Sulfametoxazol-Trimetoprim, Bacitracina e Optoquina
Incubar por 18 24 horas, em estufa bacteriolgica aferida com a temperatura 35-37C e
em atmosfera de 3 a 5% CO2 .
Aps o perodo de incubao, realizar a leitura do halo, com auxlio da rgua milimetrada
(leitura do dimetro) (fig 6)
Sulfametoxazol-Trimetoprim e Bacitracina
Sensvel qualquer halo ao redor do disco
Resistente sem formao de halo ao redor do disco
Optoquina

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Sensvel halo 14 mm
Resistente halo 14 mm
OBS: Este teste poder ser realizado no Antibiograma
Ao final do trabalho: flambar as alas, deixar esfriar e guardar. Limpar a bancada com
hipoclorito e lcool 70%
Com os resultados das provas, identificar o gnero e, se possvel, a espcie da bactria com
auxlio das Tabelas disponveis no livro Diagnsticos Clnicos e Conduta Teraputica por
Exames Laboratoriais JB Henry
3.12 Realizar o antibiograma segundo o POP de Antibiograma
11.0 EXPRESSO DE RESULTADOS
A identificao bacteriana
O antibiograma (TSA)
12.0 INTERFERENTES
O uso de colnias no bem isoladas pode ocasionar a inoculao de mais de umtipo de
bactria na srie de triagem e bioqumica, resultando em identificaes errneas ou
interpretveis.
13.0 ESTABILIDADE E ARMAZENAMENTO
13.1 Da Amostra
Estvel por at 06 meses se mantida em meio de gar simples e em refrigeradores (2 a 8C)
Cepas de estreptococos devem ser armazenadas em meios com 5% de sangue.
13.2 Dos Reativos, Corantes e Insumos.
Verificar data de validade descrita nos rtulos dos reativos, corantes e insumos (meios antisoros, etc).
Armazenamento:
Corante temperatura ambiente
Reativos conforme descrito nortulo
Discos impregnados com antimicrobianos freezer ou congelador (-10 a -20C).
Meios e anti-soros refrigeradores (2 a 8C)

14.0 EPI/EPC
14.1 Equipamentos de proteo individual (EPI)
culos de
descartveis.

segurana,

mscara

descartvel,

jaleco,

14.2 Equipamentos de proteo coletiva (EPC)

Chuveiro de emergncia, lava olhos, e extintores de incndio.

calados

fechados,

luvas

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15.0 VALORES DE REFERNCIA

No se aplica
16.0 CONTROLE DE QUALIDADE
Controle de qualidade interna das cepas enviadas pela rede microbiana do ministrio da
sade.
17.0 TRATAMENTO E/OU DESCARTE DE RESDUOS
Materiais perfurocortantes, restos de tubos coletores tambm podem ser desprezados
diretamente em caixas de papelo especialmente fabricadas para esta finalidade. Ao final do
dia de trabalho, essas caixas devem ser encaminhadas para autoclavao. Colocar os
materiais e resduos em sacos prprios para autoclavao e aps a esterilizao,
acondicionar em sacos plsticos de cor branca devidamente identificada com o smbolo de
risco biolgico.
.