Mtodos analticos de separacin

TRABAJO PRCTICO N 1 : Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).

Introduccin
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. En
cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la
fase fija.
La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la
cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la
fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia
en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de
los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase
mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la
cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:
1. Cromatografa de adsorcin.
La fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamente slice (slica) y en mucha menor medida
almina.
2. Cromatografa de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos qumicamente a un
soporte slido de slica. Se la subdivide en cromatografa en fase normal y fase reversa.
En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol)
y los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido qumicamente es un hidrocarburo
aliftico y se emplean fases mviles polares. En este caso, las sustancias ms polares eluyen
primero.
3. Cromatografa inica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio inico para separar y determinar iones.
4. Cromatografa de exclusin por tamao.
La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de
poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamao molecular. Las molculas de
tamao mayor son excluidas y eluyen primero, mientras que las ms pequeas que penetran en
los poros son retenidas ms tiempo.
Instrumental
Un equipo para cromatografa lquida de alta resolucin puede representarse por el siguiente
esquema:
FASE MOVIL

BOMBA

VALVULA
INYECTORA

COLUMNA

DETECTOR

REGISTRADOR
INTEGRADOR

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una
mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una
proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de mezclado. Cuando durante toda la
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separacin se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal
realizar un gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para mejorar la
eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de solvente tambin son realizados en
forma automtica por las bombas.
La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo, generalmente de acero
inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en una vlvula de seis vas que permite introducir
en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector. Este
produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia y esa seal es enviada al
registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma) como el que
se muestra en la figura 9.
Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la
muestra original. El integrador calcula adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es
proporcional a la cantidad de sustancia.

Figura 9. Grfico de intensidad de seal en

funcin del tiempo (cromatograma) para
tres compuestos sin solapamiento.
Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que
salen de l. De esta manera, dependiendo del tamao del loop de inyeccin y de la columna, y del
tipo de bomba, es posible realizar adems de separaciones analticas, cromatografas preparativas.
Parmetros relevantes
Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones cromatogrficas por HPLC son
idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa.
En HPLC, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la resolucin del
cromatograma, se cambia la composicin de la fase mvil a lo largo de la separacin utilizando
mezclas de entre dos y cuatro solventes.
Etapas del anlisis de una muestra
Son idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa.
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En lo que respecta a la optimizacin de las condiciones experimentales, en este caso es posible

realizar ensayos preliminares orientativos utilizando cromatografa en capa delgada con la misma
fase fija que contiene la columna.
Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas presiones, es
imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan obstruir los caos y la formacin de
burbujas que puedan deteriorar el relleno de las columnas y que produzcan inestabilidad en la seal
del detector.
Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran con membranas
de 0,45 a 0,22 m. Para evitar la formacin de burbujas, los equipos de HPLC cuentan con
desgasadores de solvente por vaco o por burbujeo con He y, en el caso de no contar con los mismos,
se deben desgasar los solventes por medio de ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de utilizarlos
como fase mvil.

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Seccin experimental
Objetivos
Realizar curvas de calibracin para distintos analitos.
Cuantificar el contenido de los mismos en muestras sintticas y comerciales.
Materiales a emplear
Equipo para HPLC con un detector de absorcin UV-visible de longitud de onda variable
Columna analtica C18 (fase reversa unida qumicamente formada por cadenas de
hidrocarburo lineal de 18 tomos de carbono)
Buffer fosfato 0.025 M; pH=3; calidad HPLC.
Metanol calidad HPLC.
Patrones de aspartamo, cafena y cido benzoico en agua, de diferentes concentraciones.
O

CO2H
H
N

H2N

CO2H

H3C

OCH3
O

CH3

aspartamo

aspartamo

CH3
N

cido
cido benzoico
benzoico

cafena
cafena

Figura 10. Estructura de los analitos que se

estudiarn mediante HPLC.
Muestra incgnita sinttica que contiene los tres analitos.
Muestras comerciales que contengan uno o varios de los analitos mencionados. Ej.: gaseosas
light (con aspartamo), gaseosas cola, edulcorantes a base de aspartamo (NutraSweet ), etc.
Todas las gaseosas tienen benzoato como conservante.
Microjeringa de 25 l.
Jeringa de 5 ml con soporte para membranas de 0.45 o 0.22 micrones. Filtros de nylon de 0,45
0,22 micrones.

Procedimiento
Cuando se desarrolla una tcnica analtica por HPLC, normalmente se elige en primer lugar una
fase fija adecuada y una fase mvil con una composicin tal que sea compatible con la fase fija, que
disuelva los componentes a analizar y que permita una buena separacin. Luego se optimizan las
condiciones de flujo de solvente, cantidad de muestra a inyectar y, en el caso de un detector de
absorcin como el que se emplear en este caso, se determinar la/s longitud/es de onda de
deteccin.

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Para el anlisis de la mezcla de aspartamo, cido benzoico y cafena se utilizar una columna de
fase reversa C18 y, como fase mvil, una mezcla formada por 45% de metanol y 55% de buffer
fosfato (acuoso) 0,025M de pH=3. Se inyectarn 10 l de cada solucin.
Buscar en bibliografa los valores de pKa para los tres compuestos y, en base al estado de
ionizacin de los mismos al pH de trabajo, predecir el orden de elucin.
En la figura 11 se presentan los espectros de absorcin de soluciones cidas (pH=2) de
aspartamo (18,7 mg/L); cido benzoico (6,55 mg/L) y cafena (7,83 mg/L).

Figura 11. Espectros de absorcin de

soluciones cidas (pH=2) de aspartamo,
cido benzoico y cafena.
Teniendo en cuenta los espectros, elegir la longitud de onda a utilizar en el anlisis.
Una vez elegidas las condiciones, se realizar la curva de calibracin para cada analito
inyectando 25 l de cada solucin patrn de modo de saturar el loop del inyector. Ajustar los valores
de velocidad de papel y atenuacin adecuados en el integrador y registrar los cromatogramas.
Graficar luego el rea de pico en funcin de la concentracin y verificar que se est trabajando
dentro del mbito lineal. Idealmente cada punto de la curva de calibracin se realizar por triplicado.
La siguiente tabla puede utilizarse para registrar las concentraciones de los distintos patrones
y las reas de pico obtenidas en las curvas de calibracin (recordar que las rectas deben pasar por el
origen).
[Aspartamo]
-1
/ mg ml

rea de pico

[c. benzoico] /
-1
mg ml

rea de pico

[Cafena] /
-1
mg ml

rea de pico

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Realizar el anlisis cromatogrfico de la muestra sinttica y de las muestras comerciales. La

muestra sinttica no requiere tratamiento previo mientras que las comerciales deben desgasarse al
vaco (especialmente las de bebidas gaseosas) y filtrarse antes de ser inyectadas. El filtrado se lleva a
cabo con una jeringa de 5 ml unida a un soporte conteniendo un filtro de nylon de 0,45 o 0,22
micrones; se descarta el primer mililitro de filtrado y luego se recoge el lquido en un recipiente
limpio.
Si fuera necesario, diluir la muestra para obtener valores dentro del intervalo de calibracin.
Para el caso de muestras slidas, preparar soluciones de concentracin adecuada y verificar que el
material se disuelva por completo.
Anlisis de los resultados
Una vez obtenidas las curvas de calibracin, comparar la sensibilidad del mtodo para la
determinacin de cada compuesto en las condiciones de trabajo. Relacionar la misma con los
espectros de absorcin y proponer mejoras en las condiciones experimentales para hacer ms
eficiente el anlisis.
Determinar las concentraciones de las muestras problema e informarlas con su error.
Comparar con los valores informados en literatura y con los declarados por los fabricantes de
las muestras comerciales.
Proponer un mtodo para evaluar el lmite de deteccin.
Discutir la necesidad de utilizar otros mtodos (estndar interno, agregado patrn) para
realizar la cuantificacin.

TRABAJO PRCTICO N 2: CROMATOGRAFIA GASEOSA

INTRODUCCION
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de
una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija y otra mvil. En cromatografa gaseosa, la fase mvil
es un gas que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. Esta fase fija puede ser un
slido poroso (cromatografa gas-slido o CGS), o bien una pelcula lquida delgada que recubre un
slido particulado o las paredes de la columna (cromatografa gas-lquido o CGL). En el primer caso,
el proceso que produce la separacin es la adsorcin de los componentes de la mezcla sobre la
superficie slida y en el segundo, la particin de los mismos entre las fases lquida y gaseosa. Por ser
la ms utilizada, la discusin que sigue se refiere a CGL.
INSTRUMENTAL
Un instrumento para cromatografa gaseosa puede representarse por el siguiente esquema:

El gas portador (fase mvil) proviene de cilindros provistos con vlvulas reductoras de presin. La
muestra se introduce en el inyector con una microjeringa a travs de un septum de goma. All se
produce la vaporizacin instantnea de la misma y su introduccin en la corriente de gas. La columna
se halla dentro de un horno de temperatura variable, lugar donde se realiza la separacin de los
componentes de la muestra. El detector produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de
materia a medida que cada componente separado fluye a travs de l. Esa seal es enviada al
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registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma) del tipo:

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra

original. El integrador (o el software de control) calcula adems el rea correspondiente a cada pico,
la cual es proporcional a la cantidad de analito.
PARMETROS RELEVANTES
Tiempo de retencin (tr) de un dado componente de la muestra es el tiempo transcurrido desde la
inyeccin de la misma hasta la aparicin del mximo correspondiente al pico de ese componente. Un
caso especial lo constituye un componente que no es retenido por la fase fija (no se reparte entre
fases), el cual saldr de la columna antes que cualquier sustancia a un tiempo llamado tiempo
muerto (t0). De esta manera, es posible definir tr como el tiempo que un cierto componente
permanece retenido en la fase estacionaria:
El factor de capacidad (k) de un dado compuesto se define como:

que, en funcin de la constante de particin (K), del volumen de la fase fija (VL) y del volumen de la
fase mvil (VG) se puede escribir como:

y en funcin de los tiempos de retencin:

Con respecto a la columna, se define como plato terico a una capa estrecha de la misma en donde
se produce el equilibrio de particin de un compuesto entre la fase fija y la mvil. Para una columna
de longitud L, el nmero de platos tericos (N) es:

siendo H la altura de plato terico, uno de los parmetros que determina la capacidad del proceso
cromatogrfico para separar dos compuestos dados, y W el ancho de los picos a la altura de la lnea
de base. A partir de las definiciones anteriores, es posible definir parmetros asociados a la
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separacin de dos sustancias A y B que caracterizan la eficiencia de una separacin. Siendo B la

sustancia con mayor tr estos parmetros son:
Factor de selectividad:

Resolucin:

Teniendo en cuenta que k, a, N y H dependen de la temperatura, tipo de fase fija, longitud de

columna y flujo de fase mvil, es posible mejorar una separacin optimizando estos parmetros
experimentales.
ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA
1. Optimizacin de las condiciones instrumentales.
2. Obtencin de los cromatogramas en condiciones ptimas (muestras y patrones).
3. Calibracin (diferentes tcnicas).
4. Cuantificacin del / los componentes presentes en la muestra.
5. Tratamiento de los resultados:
a. Se busca obtener como respuesta instrumental:
Picos bien resueltos.
Buena relacin seal / ruido.
Lnea de base horizontal (sin deriva).
Picos no distorsionados.
b. Normalmente suele realizarse una calibracin por estndar externo o utilizando un
estndar interno.
i. Estndar externo: Se preparan muestras de patrones de concentracin conocida que
se analizan y permiten construir una curva de calibracin para cada componente a cuantificar.
Con este mtodo es necesario medir exactamente los volmenes inyectados tanto de los
patrones como de la muestra incgnita.
ii. Estndar interno: En este caso se agrega a la muestra una cantidad conocida de un
compuesto que no est presente originalmente. En este caso, la calibracin se realiza
analizando patrones de concentracin conocida para cada componente a cuantificar a los
cuales se le agrega la misma cantidad del estndar interno que a la muestra incgnita. La
curva de calibracin se construye graficando el cociente entre la seal del analito incgnita y
el estndar interno en funcin de la concentracin del analito incgnita. Este mtodo elimina
el error cometido por la irreproducibilidad en el volumen inyectado.
c. Tanto para la medicin de la muestra como de los patrones, es conveniente estudiar la
reproducibilidad de la seal analtica y la de los tiempos de retencin del / los analitos. Para ello se
deben realizar varias inyecciones (n) de cada muestra y cada uno de los patrones y utilizar los valores
medios.
d. Se realizar el tratamiento de resultados siguiendo las indicaciones dadas en la gua de
trabajos prcticos.

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PARTE EXPERIMENTAL
Objetivos
Analizar la influencia de los diversos parmetros instrumentales en la identificacin y separacin de
los componentes presentes en una mezcla de steres metlicos.
Seleccionar las condiciones instrumentales ptimas para dicha separacin.
Resolver una mezcla de metil-steres de cidos grasos.
Materiales a emplear
Cromatgrafo de gases
Columna capilar
Patrn de steres metlicos de triglicridos de origen marino
Microjeringa de 10 mL.
Experimentos a realizar
Para resolver los componentes de la muestra se realizarn cromatogramas hasta optimizar la
resolucin variando distintas condiciones instrumentales como la temperatura del horno y el flujo del
gas portador.
Anlisis de los resultados
Discutir los resultados obtenidos. Informar las condiciones experimentales, los tiempos de retencin
de cada componente de la mezcla y la composicin porcentual de cidos grasos en las muestras.
Obtenga los parmetros que caracterizan la eficiencia de la columna para estos analitos en las
condiciones de trabajo (k, a, N y H).