Metabolmica

QUIMICA DE LOS PRODUCTOS NATURALES

Qu veremos?
Bases de la Metabolomica.

Limitaciones de Metablomica.
Puntos a considerar cuando usemos metabolomica para
nuestra investigacin.

Definiciones y Antecedentes.
Metaboloma = pool total de los metabolitos.
Todas las moleculas organicas que
tengan bajo peso molecular (< 2000
Da) en una muestra como hojas,
semillas, frutas, etc.

Azcares
Nuclesidos
Ac. Orgnicos
Cetonas
Aldehidos
Aminas

Peptidos
Lipidos
Esteroides
Terpenos
Alcaloides

Definiciones
Metabolmica: anlisis de alto rendimiento de los metabolitos.
Es el estudio cientfico sistemtico de molculas pequeas, llamadas metabolitos, y
que son el producto del metabolismo de seres. Este estudio deja seales de los
procesos celulares especficos en su paso (metabolitos)

Metabolito

1 kDalton de
tamao.

Excepciones:
Pueden
detectarse
con confianza en
estudios
metabolmicos
de
plasma a travs de la
espectroscopa RMN.

El metaboloma forma una gran red de reacciones

metablicas donde las salidas de una reaccin qumica
enzimtica son entradas para otras reacciones del mismo tipo.

Tipos de Metabolitos
En la metabolmica de plantas, es comn referirse a los metabolitos como
metabolitos "primarios" y "secundarios".

PRIMARIOS

SECUNDARIOS

Antecedentes.
Historia
Perfilado de metabolitos utilizando muestras de sangre y orina para la deteccin clnica
de las enfermedades humanas se ha llevado a cabo durante siglos.

En China se empleaba a
las
hormigas
como
sistema de deteccin de
niveles de azucar

1506 por Ullrich Pinder,

en su libro Epiphanie
Medicorum.
Nicholson, J. K. & Lindon, J. C. Nature
455, 10541056 (2008).

Antecedentes.
Historia
Tcnicas de separacin cromatogrficas avanzadas.
1960

1971

Linus Pauling:
"Anlisis cuantitativo de vapor de orina y aliento mediante
Cromatografia de particin Gas-Lquido

1973 - 1977

Chuck Sweeley ayud a desarrollar perfiles

metablicos mediante cromatografa de gases
/ espectrometra de masas (GC-MS)

1986-1994

Bioqumicos metablicos de la planta (por ejemplo, Lothar

Willmitzer) estaban entre otros los primeros lderes en el campo.

Antecedentes.
Tamao del Metaboloma en las Plantas.
Se estima que todas las especies vegetales contienen 90.000 - 200.000
compuestos.
Cada especie de planta contiene alrededor de 5.000 - 30.000 compuestos.
Ejemplo ~ 5,000 en Arabidopsis

~ 90% de las mutaciones knockout en Arabidopsis son

silenciosas- es decir, no tienen fenotipo visible y as no ofrece
ninguna pista a la funcin del gen.

PODER DE LA
METABOLMICA

Lo central es que ya no se aslan compuestos individuales, sino

que se realiza un anlisis ms o menos completo de un
organismo.

Definiciones y Antecedentes.
Limitaciones de la metabolmica
Alta Variacin biolgica en los niveles de metabolitos.
Amplia gama de estructuras qumicas y las propiedades. Sus pesos
moleculares abarcan dos rdenes de magnitud (20-2000 Da).

Las concentraciones de los distintos metabolitos pueden variar de mM

a concentraciones de pM.
Algunos metabolitos son lbiles y no sobreviviran para la extraccin y
anlisis.
Problemas con la cromatografa, la deteccin y anlisis de datos

Metabolomica
Pasos
Preparacin de la
muestra.

Extraccin

Cromatografa.

Anlisis de
Datos

Deteccin

Preparacin de la muestra
Tamao de muestra
Cultivar plantas en condiciones idnticas

Seleccin aleatoria de los grupos de tratamiento

Asegrese de que los efectos que est midiendo se deben a
la variable de prueba

Nmero de rplicas ... depende de lo que desea

Grandes diferencias = pequea replicacin
Pequeas diferencias = gran replicacin

En general, se necesitan seis

repeticiones para cada
tratamiento (debido a la alta
variabilidad biolgica)

Preparacin de la muestra
Coleccin de la muestra.

Tamaos de muestra uniforme (por ejemplo,

hojas perforadoras/daadas)

Sea consistente - tejido parecido

- La hora del da

Congelar rpidamente la muestra en nitrgeno

lquido y almacenarlo a -80C

Extraccin de la Muestra
Eleccin del metodo de extraccin.
No existe un mtodo universal de extraccin

Algunos disolventes pueden degradar ciertos compuestos.

Es bueno tener una idea de lo metabolitos que desea extraer.

Extraccin de la Muestra
El mtodo debe ser consistente y reproducible.

Una extraccin adicional puede ser necesaria (por ejemplo, la

extraccin en fase slida)

SPEX SamplePrep Grinder

Cromatografa
Introduccin
Inventado en 1900 por Mijail Tsvet (utilizado para separar pigmentos
de las plantas)
Hay varios tipos de cromatografa, pero todos consisten en una fase
estacionaria y una fase mvil. Los compuestos se separan sobre la base
de particin diferencial entre las dos fases.

Los tipos incluyen:

- TLC (cromatografa en capa fina)
- GC (cromatografa de gases)
Y
- LC (cromatografa lquida)

GC y LC se utilizan habitualmente en la
metabolmica

Cromatografa
Cromatografa Gaseosa
GC = good chromatography

Optimizado durante varias

dcadas
~ 5 columnas utilizan
rutinariamente
(5% de difenilo / 95% de siloxano
de metilo)
alta reproducibilidad

La identificacin basada en RT

limitaciones:
- Altas temperaturas pueden destruir compuestos
lbiles
- Compuestos polares no pueden "volar" en las
columnas de GC y primero deben ser derivados.

Cromatografa
Derivatizacin de la muestra
Paso 2) Sililacin

100

Abundance

Paso 1) metoximacin

115
96
340
207

91
107

231

128

50

147

193

163

141

371

218

177

283
244

267

312

356

298

388 401 415

383
415

0
298

244 257
189
141

96

50

91

163

435

457 475 489

356
312

271
283
205
218

107
128

231
371
100

m/z

115
80

110

340
140
170
200
estrone minor_RI 950990

230

260

290

320

350

380
410
440
estrone major_RI 948753

470

500

Ismero tienen el mismo espectro de masas

pero difieren 2 segundos en el tiempo de retencin

La cromatografa de gases requiere compuestos voltiles (dos derivatizacin

paso en vial)
1) metoximacin de grupos aldehdo y cetona (principalmente para la apertura de anillo de azcares
reductores)
2) La sililacin de hidroxi polar, tiol, grupos carboxi y amino con el agente de sililacin MSTFA
Un compuesto nico con mltiples grupos activos dar lugar a mltiples picos (1TMS, 2TMS, 3TMS)
Anal Chem. 2009 Dec 15;81(24):10038-48. doi: 10.1021/ac9019522.
FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry.
Kind T, Wohlgemuth G, Lee do Y, Lu Y, Palazoglu M, Shahbaz S, Fiehn O.

18

Cromatografa
Cromatografa lquida
LC = Lousy chromatography

Bastante nuevo,
avances recientes.
miles de columnas disponibles
Fase normal
Intercambio inico
Fase inversa

Infinidad de Sistemas de Solventes

posibles.
baja reproducibilidad

ventajas:
- El compuesto se puede recoger
despus de la separacin
- Lo es necesario la derivatizacin.
- Un protocolo de separacin puede
ser optimizado para casi cualquier
compuesto

Deteccin
Espectrometra de masas

Es una tcnica utilizada para

medir la masa de los iones (m/z)

Todas los espectrometros de masas realizan tres tareas principales

1)

Ionizan moleculas.

2)

Utiliza los campos

elctricos y magnticos
para acelerar iones y
manipular su vuelo.

3)

Detectar iones (convertir

en seal electrnica)

Deteccin
Espectrometra de masas.

relative abundance

Ejemplo del espectro de masas:

m/z

Deteccin
Espectrometra de masas.

Normalized
Intensity

100

Peak selector

Chromatogram (GC-MS)

75

50

25

0
0

Normalized
Intensity

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

100

22.00

Time [min]

166

Mass spectrum (EI)

75

97

129

83

61
50
47
25
35
70

0
30

40

50

60

70

112
80

90

100

110

119
120

130

140

150

160

170

m/z

Espectrmetro de masas.
Hay varios tipos de espectrmetros de masas:

TOF (tiempo de vuelo)

Q, QQQ (cuadripolo)
Ion Trap Orbitrap
FTICR (transformada de Fourier de resonancia ciclotrn de
iones)

Quad

TOF

Espectrometra de Masas
Propiedades de los diversos espectrmetros de masas.

TOF

Quad

Ion Trap

Orbitrap

FT-ICR

Resolucin

Muy bueno

razonable

razonable

Muy bueno

excelente

Rango Dinmico

Muy bueno

excelente

razonable

razonable

razonable

Sensibilidad

excelente

excelente

excelente

excelente

excelente

Velocidad

excelente

bueno

excelente

bueno

razonable

Costo

150-300K

100K

100K

500K

1M

Mantenimiento

Periodico

Periodico

Periodico

Periodico

Muy alto

Resonancia Magntica Nuclear

Es una tcnica empleada en la elucidacin de estructuras
moleculares, aunque tambin se puede emplear con fines
cuantitativos y en estudios cinticos y termodinmicos

Los ncleos deben tener un momento magntico distinto de cero.

Esta condicin no la cumplen los ncleos con nmero msico y nmero
atmico par (como el 12C, 16O, 32S). Los ncleos ms importantes en qumica
orgnica son: 1H, 13C, 31P, 19F y 15N.
Otros
ncleos
importantes: 7Li, 11B, 27Al, 29Si, 77Se, 117Sn,195Pt, 199Hg, 203Tl, 205Tl, 207Pb

Algunos ncleos atmicos sometidos a un campo magntico externo

absorben radiacin electromagntica en la regin de las frecuencias de
radio. Como la frecuencia exacta de esta absorcin depende del entorno
de estos ncleos, se puede emplear para determinar la estructura de la
molcula en donde se encuentran stos.

Por eso, uno de los ms tiles en la

elucidacin de estructuras es el 1H,
dando lugar a la Espectroscopia de
Resonancia Magntica Nuclear del
Protn. Tambin es importante en
qumica orgnica el 13C, aunque se trata
de un ncleo poco abundante y poco
sensible.

Anlisis de Datos
Objetivos
Identificar todos los picos
En la prctica esto es muy difcil, si no imposible.

Cuantificacin o Semi-cuantificacin de compuestos

A menudo implica la comparacin de muestras o grupos de muestras.

Diversas pruebas estadsticas para buscar diferencias en los grupos de tratamiento

por ejemplo ACP, ACM, ANOVA

Anlisis de Datos
Identificacin de picos
Tener el dato de la masa precisa puede ayudar a determinar la frmula qumica:

Ejemplo: sacarosa (C12H22O11)

Masa monoisotpico = 342.116211

Calculadora de peso molecular

http://www.alchemistmatt.com/mwtwin.html

Anlisis de Datos
La identificacin de los picos.
Las bibliotecas de EM pueden identificar los picos (en su mayora de GC / MS),
especialmente cuando se combina con la informacin RT (GC / MS solamente):
Ejemplo: biblioteca de NIST

Anlisis de Datos
Ejemplo del resultado de un experimento de la metabolmica.

Los estudios fitoqumicos han avanzado mucho en los

ltimos aos pero todava la informacin disponible es
insuficiente para evaluar la calidad, eficacia y seguridad de
la mayora de las plantas medicinales que se utilizan en los
sistemas mdicos locales y tradicionales.

Alguna Pregunta?
GRACIAS POR SU ATENCIN