ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS

La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una

partcula cargada cuando se ve sometida a la accin de un campo
elctrico. La partcula se desplazar hacia el electrodo de carga opuesta.
As pues, una partcula cargada positivamente (catin) se desplazar
hacia
el ctodo (polo con carga negativa). Una partcula cargada
negativamente (anin) se desplazar hacia el nodo (polo con carga
positiva). Como conclusin general, en una solucin acuosa, las
partculas se
movern ms deprisa cuanto mayor sea su carga, y ms despacio
cuanto
mayor sea su tamao. En la separacin de macromolculas, como las
protenas, la carga qp es muy baja en relacin a su masa. Para conseguir
la
migracion habra que aumentar mucho el campo elctrico y se
producira la
hidrlisis del agua. Se generaran altas concentraciones de OH- en el
nodo
y H+ en el ctodo, lo que provocara un gradiente de pH que afectara a
la
carga de la partcula. Tambin habra cambios en la viscosidad del medio
debidos a la generacin de calor por una diferencia de potencial muy
elevada.
Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en
un gran volumen de medio tamponado. An as la relacin carga/masa
sigue siendo muy baja y la macromolcula migra muy lentamente con lo
que el problema de difusin se hace muy importante. Para aumentar la
velocidad de la macromolcula se aumenta la fuerza inica del medio y
para evitar la difusin se realiza la electroforesis en soportes slidos
inertes
denominados de geles porosos.
La electroforesis es la tcnica ms utilizada en estudios analticos, sobre
todo de componentes moleculares, utilizndose frecuentemente en el
laboratorio para la separacin de protenas y de cidos nucleicos. La
separacin de protenas se realiza habitualmente mediante gel de
poliacrilamida en presencia de SDS. El gel se organiza en una red o
malla a
travs de cuyos poros circulan las protenas a separar. Se obtiene
mediante
la formacin de polmeros lineales de acrilamida que se entrecruzan por
reaccin con bis-acrilamida. El tamao de los poros depende de la
concentracin absoluta y de la proporcin de acrilamida y bis-acrilamida
del gel. La polimerizacin es promovida por el persulfato amnico y
estabilizada por el TEMED.

Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Ctodo (carga negativa).

Polo
inferior: nodo (carga positiva).

Los pesos moleculares de las protenas se pueden determinar midiendo

su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia de un agente
desnaturalizante, el detergente dodecilsulfato sdico (SDS). Esto es
debido a
que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una
protena es proporcional al peso molecular del polipptido y es
independiente de su secuencia. A saturacin, se une aproximadamente
1.4 g de detergente por gramo de protena. Existe una relacin lineal
entre la distancia que una protena recorre en un gel y el logaritmo de su
peso
molecular. As pues, si tenemos una serie de protenas de las que
conocemos su peso molecular podemos utilizarlas como patrn y
midiendo la distancia que recorren en el gel, podemos construir una
recta que nos permita calcular el peso molecular de nuestras protenas
problema interpolando la distancia que han recorrido.

MATERIALES Y REACTIVOS.

1.- Stock de acrilamida-bisacrilamida 30%-0.8%

La ACRILAMIDA es un compuesto altamente NEUROTOXICO. Est
terminantemente prohibido continuar la prctica sin GUANTES ,
o
pipetear la disolucin con la boca.
2.- Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
3.- Tris-HCl 3 M pH 8.8
4.- SDS 10%
5.- Persulfato amnico 10%
6.- Tampn de electroforesis (Tris 25 mM pH 8.3, glicina 192 mM, SDS
0.1%)
7.- Tampn de ruptura (Tris 313 mM pH 6.8, SDS 10%, glicerol 25%,
mercaptoetanol 25%, azul de bromofenol 0.02%)
8.- Cristales, separadores, peines, pinzas-marco para sujecin de
cristales y
accesorio formador de geles. Cubeta para electroforesis con soporte
para
geles y formador de cmaras. Fuente de alimentacin.
9.- Marcadores de peso molecular de protenas
10.- Solucin de tincin o solucin de Coomassie (Coomassie brilliant
blue R
0.05 %, actico 10% e isopropanol 25%)
10.- Solucin de revelado (cido actico 10%

MTODO

Preparacin del gel

En esta prctica se va a preparar un gel
discontnuo compuesto por el gel de separacin
o resolucin (parte inferior) y el gel de
concentracin o empaquetamiento (parte
superior, con pocillos). Las cantidades de cada
gel se muestran en la tabla adjunta. Limpiar
perfectamente los cristales (uno grande y otro
pequeo) con agua y jabn, aclararlos muy bien con abundante agua.
Utilizar un poco de etanol 70% y secar los cristales con papel
secamanos.
Montar el gel siguiendo meticulosamente las instrucciones del profesor.
Preparar la solucin del gel de separacin (7.5 ml por gel) teniendo en
cuenta que el persulfato amnico y el TEMED se aaden al final. Verterlo
rpida y cuidadosamente entre los cristales hasta 1-2 cm por debajo del
nivel
que ser ocupado por el peine formador de los pocillos. Colocar un poco
de
agua destilada cuidadosamente sobre el gel y dejarlo polimerizar a
temperatura ambiente. Una vez polimerizado, retirar el agua y preparar
la
solucin del gel concentrador. Verter esta solucin sobre el gel de
separacin hasta llenar el espacio entre cristales y colocar un peine de
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pocillos previamente lavado con agua y etanol, evitando que queden
burbujas entre el peine y el gel. Dejarlo polimerizar a temperatura
ambiente.
Gel de separacin
gel de concentracion
Agua
Acrilamidabisacrilam
Tris HCl 3 M pH 8.8
Tris HCl 0.5 M pH 6.8
SDS
Persulfato amnico
TEMED

3.9 ml
2.5 ml
0.95 ml
-------75 l
30 l
10 l

Preparacin de la muestra

1.75 ml
0.31 ml
-------0.625 ml
27.5 l
15 l
5 l

En esta prctica se van a analizar mediante electroforesis en gel de

poliacrilamida con SDS las muestras provenientes de la precipitacin
fraccionada. Se incluir tambin un carril con marcadores de peso
molecular, que consisten en una mezcla de protenas de peso molecular
conocido que nos servirn de referencia. Las muestras a analizar son las
siguientes:
1.2.3.4.5.-

Suero de Ternera diludo 1/5.

Fraccin 1 (precipitado obtenido con 30 % de sulfato amnico).
Fraccin 2 (precipitado obtenido con 40% de sulfato amnico).
Fraccin 3 (precipitado obtenido con 60% de sulfato amnico).
Muestra tras dilisis.

Rotular 5 microtubos, uno para cada muestra. Mezclar en cada uno de

ellos 20 l de su muestra correspondiente con 20 l de tampn la emli.
Desarrollo de la electroforesis
Una vez polimerizado el gel de concentracin, retirar el peine con
cuidado de no romper los pocillos reservados a las muestras. Montar el
gel en
la cubeta de electroforesis siguiendo las instrucciones del profesor.
Aadir
tampn de electroforesis y cargar las muestras anotando el orden. Las
cantidades cargadas de cada muestra se deducirn durante el desarrollo
de la prctica en funcin de la cantidad de protenas determinada
anteriormente en el ensayo tipo Bradford. Una vez cargadas las
muestras, se
conectan los cables correctamente (polo positivo rojo abajo y negativo
negro arriba) y se corre la electroforesis al amperaje que indique el
profesor
hasta que el frente azul est a punto de salir de la parte inferior.
Cuando el frente est a punto de salir, se desconecta la corriente, se
separan con mucho cuidado los dos cristales, se retira el gel y se coloca
en
un recipiente donde se aade la solucin de fijacin (dependiendo del
desarrollo de la prctica consultar con el profesor los tiempos de
fijacin), se
retira la solucin de tincin y se aade la solucin de revelado, donde se
deja hasta que el gel est completamente desteido.