Cartografa fsica

Su finalidad es la de definir las distancias fsicas en pares de bases (pb) o cualquiera de sus
mltiplos. Por lo tanto es obvio que el mapa fsico de mayor detalle es la propia secuencia
del genoma. Pero antes de llegar a adquirirla, hay que elaborar mapas fsicos partiendo de
resoluciones bajas y avanzando hacia las resoluciones cada vez mayores. Los mapas fsicos
de menor resolucin son los cariotipos. Si bien los procesos citogenticos tienen sus
restricciones, no hay que olvidar que actualmente existen novedosas herramientas de
citogentica molecular (como las sondas fluorescentes in situ o FISH, la "pintura de
cromosomas", etc.) que permiten un mayor detalle y que, unidas a otras tcnicas aumentan
el arsenal de enfoques para el estudio de los genomas, de su dinmica y de sus alteraciones.
Estos mapas constituyen un paso decisivo en la identificacin estructural y funcional del
genoma. Se obtienen por diversos mtodos pero el ms conveniente es el ordenamiento de
grupos de clones superpuestos (contigs), ya sean estos clonados en fagos (P1), csmidos,
cromosomas artificiales de bacterias (BACs) o cromosomas artificiales de levaduras
(YACs). Los mapas fsicos de mayor resolucin se elaboran a partir de la genotecas en
BAC, utilizando dos estrategias, en cierto modo similar a la de ensamblar un
rompecabezas: se trata en ordenar los fragmentos del genoma con el fin de examinar
grupos de fragmentos con zonas en comn, es decir, ir hallando conjuntos de pares de
fragmentos parcialmente solapados. Ello conduce al concepto de contig: un conjunto de
fragmentos de un genoma que se han clonado por separado, pero que son contiguos y que
estn parcialmente solapados. Los actuales mapas fsicos han de recurrir pues al
ensamblaje de esos fragmentos dentro de un contig, y ulteriormente, los distintos contigs
correspondientes al mismo grupo de ligamiento han de ser ensamblados entre s: el objetivo
final (ideal) sera obtener un gran contig por cada cromosoma, que describiera
detalladamente la posicin y distancia fsica (en bases) entre distintos marcadores
(representados, por ejemplo, por dianas para enzimas de restriccin).
La metodologa de los mapas fsicos ha sido el desarrollo de una especie de "marcadores
fsicos universales", fcilmente generables, que permiten que los datos obtenidos en un
laboratorio sean rpidamente compartidos y asumidos por toda la comunidad investigadora:
se trata de los llamados "lugares etiquetados por su secuencia" (Sequence Tagged Site).
Consisten en trechos cortos de ADN de unas 300-500 pb de media, cuya secuencia exacta
se conoce y se sabe que es nica en todo el genoma. Su facilidad de uso y su aceptacin
como "lenguaje comn" estriba en que una vez que un investigador descubre una STS,
cualquier otro puede obtenerla por s mismo (ni siquiera hace falta el envo fsico de
muestras), simplemente fabricando in vitro los cebadores correspondientes a sus extremos y
amplificando la STS por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Los STS definen
puntos concretos nicos del mapa fsico, y constituyen magnficos "hitos" o balizas
fcilmente detectables.

Uno de los objetivos iniciales del PGH era la obtencin de mapas fsicos con unas 30.000
seales repartidas de modo ms o menos uniforme, de modo que cada dos marcadores
consecutivos estn separados una media de 100 kb. Este objetivo se acaba de cumplir, en
buena parte debido al empleo de los STS, que permiten elaborar mapas de contigs segn el
contenido de STS de los clones solapados. Estos mapas de STS permiten la integracin de
los mapas genticos y fsicos, hacen accesible la fase de secuenciacin y facilitan la
clonacin de genes implicados en enfermedades mediante la llamada estrategia de
clonacin posicional.
Existen varios puntos a tener en cuenta:
1. Antes de establecer contigs de YACs, BACs o P1 es importante confirmar que
cada molcula de ADN clonada representa realmente una secuencia inalterada y
derivada slo de un cromosoma. Dado que todas las bibliotecas genmicas (o
genotecas) son construidas con la misma estrategia (fragmentacin del ADN de alto
peso molecular con enzimas de restriccin y el posterior ligado de los productos a
un vector), es muy comn que, por azar, dos segmentos completamente
independientes sean empaquetados juntos en el mismo vector. El vector resultante
ser un mosaico y su uso puede llevar a resultados incongruentes. Una situacin
similar, pero an ms grave, puede ocurrir si un segmento de ADN queda
delecionado en el proceso de clonacin.
2. Para establecer contigs superpuestos de clones de YACs, BACs, csmidos o P1 es
necesario construir varias genotecas independientes con diversas enzimas de
restriccin, con digestin completa o incompleta.