Manipulacin del ADN y transformacin de clulas vegetales.

Pasos en el desarrollo de un
sistema de transformacin.
Sistemas y estrategias. Transformacin estable y
transitoria. Elementos de un vector de transformacin. Promotores habituales.
Seleccin. Genes seleccionables, marcadores e informantes. Nuevas estrategias de
seleccin

-Cultivo de pices caulinares

-Cultivo de yemas axilares
-Morfognesis directa
-Semilla artificial
-Cultivo de meristemos
-Microinjerto

P
R
O
D
U
C
C
I
O
N

-Seleccin celular
-Seleccin somaclonal
Transformacin gentica

-Propagacin clonal
-Saneamiento del
material vegetal

-Obtencin de lneas puras

(diplo-haploides)

-Cultivo de anteras
-Cultivo de microsporas

-Cultivo embriones zigticos

-Fusin de protoplastos
-Hibridacin somtica

-Reproduccin vegetativa

M
E
J
O
R
A

Aprovechamiento de la
variacin interespecfica

Aprovechamiento de la
variacin somaclonal
(intraespecfica)

Transformacin gentica

Es la introduccin controlada de cidos nucleicos en un genoma receptor (Tacchini et al.

1987).
Organismo Modificado Genticamente: (OMG) es un "Organismo cuyo material gentico ha
sido modificado de una manera distinta del apareamiento y/o recombinacin natural".
Los genes de un organismo que son insertados en otro se denominan transgenes y tienen la
capacidad de conferirle a este ltimo una determinada caracterstica.
La transformacin exitosa depende de la incorporacin estable del gen nuevo en el genoma
de la planta receptora y su subsiguiente transmisin a sucesivas generaciones.

POR QUE TRANSFORMAR UNA ESPECIE?

INDUCCIN DE VARIABILIDAD GENTICA:

AUSENCIA DEL CARACTER FENOTPICO INVESTIGADO EN EL MBITO DE

LA ESPECIE.
EXPRESIN DE NUEVAS FORMAS ALLICAS DE GENES QUE YA ESTN
PRESENTES EN EL GENOMA DE LA PLANTA.
EXPRESIN DE SECUENCIAS CODIFICANTES PRESENTES EN EL GENOMA
PERO BAJO EL CONTROL DE NUEVAS SECUENCIAS REGULADORAS QUE
MODIFIQUEN SU NIVEL O PATRON DE EXPRESIN.
INHIBICIN DE LA EXPRESIN DE GENES RESIDENTES EN EL GENOMA.

COMPLEMENTO Y/O ALTERNITAVA A LOS PROGRAMAS DE MEJORA

GENTICA POR VA SEXUAL:

DIFICULTAD DE TRANSFERIR EL CARACTER ESTUDIADO DE UNA VARIEDAD

O CLON A OTRA, SIN RIESGO DE ALTERAR EL RESTO DE CARACTERSTICAS
FENOTPICAS.
EXCESIVA DURACIN Y COMPLEJIDAD DE LOS PROCESOS DE
CRUZAMIENTO Y SELECCIN.

MANIPULACIN DEL ADN Y TRANSFORMACIN DE CLULAS VEGETALES

MEDIADA: Mtodo Indirecto (Biolgico),

basado en un vector natural

Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes

Virus

DIRECTA:
Quimica
PEG
Fisica
Electroporacin
Biobalstica

TIPOS DE REQUERIMIENTOS BSICOS

EN UN PROCESO DE TRANFORMACIN

BIOLGICOS

Protocolos de Regeneracin- Clulas

Competentes
Protocolo de Transformacin- Clulas
Competentes
Protocolo de Seleccin y Regeneracin
de Plantas Transformadas

PRCTICOS

Disponibilidad de material vegetal

Protocolo de transformacin

Simple
Eficaz
Econmico
Reproducible
Seguro

FACTORES QUE AFECTAN A LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIN

Tipo de tejido

Estado fisiolgico del explanto

Mtodo de transformacin

Genotipo de la planta

Reduccin del stress, agente selectivo

PASOS EN EL DESARROLLO DE UN SISTEMA DE TRANSFORMACIN

Especies transformadas
relacionadas. Analizar.

Disponibilidad de
explantos competentes

Desarrollar el cultivo
in vitro de la especie
Medios de cultivo y
fitohormonas
Identificar clulas
regenerables

Protocolo de regeneracin.
Frecuencia

Agentes selectivos /
Estrategia de seleccin

Construccin de
plsmidos adecuados

Accesibilidad a
clulas regenerables

Transformacin
Seleccin de
transformantes

Optimizacin
parmetros
bombardeo

Optimizacin
infeccin con
Agrobacterium

Expresin transitoria
Regeneracin de
plantas transgnicas

Valoracin dao celular

Satisfactorio

Caracterizacin

Para valorar la idoneidad del cultivo diana, destacan:

- una elevada tasa de multiplicacin, que permita disponer
de material de partida en cantidad suficiente y con rapidez.
- una elevada tasa de regeneracin de planta, que
proporcione una frecuencia de regeneracin de individuos
transgnicos satisfactoria y favorezca la obtencin de
mltiples clones transgnicos.
- una simplicidad tcnica y un mnimo tiempo en cultivo, con
el fin de evitar la variacin somaclonal y reducir los costes
econmicos

Por otra parte, para estimar la validez del sistema de

transformacin hay que considerar que:

- el mtodo de seleccin de las clulas transformadas sea inequvoco.

- el protocolo de transformacin sea aplicable a varios genotipos.
- los transformantes no sean quimricos.
- se den patrones simples de integracin de los transgenes, para reducir la
probabilidad de interrupciones de genes endgenos por insercin y el
silenciamiento gnico asociado a la integracinde mltiples copias.
- los patrones de expresin sean estables, correspondindose con lo esperado
en funcin de las secuencias controladoras de los genes insertados.
- la variacin aleatoria para un fenotipo de inters no implique una
caracterizacin extensiva en campo de cada transformante hasta dar con el
deseado. De otro modo, el valor de la transformacin en la mejora se
restringira a caractersticas que no se pudieran obtener mediante mejora
convencional
-la sencillez y peligrosidad sean mnimas para el operador, a fin de reducir los
riesgos laborales
-Entre los factores citados, el ms importante es que existan gran cantidad de
clulas susceptibles de ser transformadas y que stas mantengan su capacidad
regenerativa, pues una elevada tasa de multiplicacin no implica necesariamente
un nmero importante de clulas competentes para la transferencia gentica.

Haciendo una planta transgnica

Identificacin del gen inters
Esta es una de las
etapas limitantes

Organismo
donador del gen

Modificacin del gen

Previas a su
introduccin en el
genoma de la planta

Conocemos muy poco de los genes especficos que determinan

Co
las caractersticas vegetales.
To
lor
r?
ler
o
?
b
an
a
cia
S
al
?
ca
ao
lor
m
a
T
?
Actualmente se estn realizando enormes esfuerzos de
secuenciacin y compresin de las funciones de los genes ,
particularmente aquellos de inters agronmico.

Extraccin
del DNA

Aislamiento
del gen

Para asegurar que el gen introducido se exprese

en el lugar y tiempo debidos es necesario que se
acople a un promotor adecuado.
En ocasiones es conveniente modificar la
secuencia del gen para optimizar su
expresin.

10

Principios generales
El cdigo gentico es universal, pero los elementos (secuencias)
reguladores no.
Cualquier gen podra expresarse, en mayor o menor grado, si tiene:
1. Un promotor adecuado y una seal de terminacin.
2. Unas seales de inicio de transcripcin y traduccin apropiadas.
3. Un cdigo de codones optimizado.

O P

Secuencia gnica

Genes mltiples tambin se pueden expresar simultneamente a

partir de un constructo, pero su prctica est limitada por:
1. El tamao del inserto, cuanto mas grande menos eficiente.
2. El tamao del vector, cuanto mayor sea mas difcil de manipular.

11

Seleccin

MCS
LB

Solo una pequea fraccin de

las clulas vegetales son
transformadas.

YFG

RB

kanR
ori

Para obtener plantas transgnicas es necesario cultivar

en unas condiciones que favorezca la regeneracin a
partir de las clulas transformadas, es decir una presin
selectiva.
SELECCIN:

POSITIVA
CONDICIONADA
NO CONDICIONADA
NEGATIVA

12

Gen: b-glucoronidasa
Sustrato: X-Glu

13

Transformacin indirecta
Agrobacterium-un ingeniero natural

Bacterias Gram negativo que se encuentran en el suelo.

Invaden heridas de diversas plantas e inducen a la planta a producir tumores
y molculas utilizadas por la bacteria.
Agrobacterium es una bacteria patgena para dicotiledneas y algunas
conferas.
Agrobacterium tumefaciens crown gall disease (tumors)
Agrobacterium rhizogenes hairy root disease (hairy roots)
Las Monocotiledneas presentan resistencia natural a Agrobacterium.
Agrobacterium es un ingeniero gentico natural(1983).
Es un mecanismo de transferencia entre reinos

14

 PlsmidoTi o plsmido Ri:

Genes de sntesis de opinas: responsables de la sntesis de
nuevas opinas.
Opinas: derivados de aminocidos o azcares producidos
por tejidos vegetales infectados que son metabolizados
Agrobacterium
como
nica
fuente
de
por
carbono/nitrgeno.
Clasificacin de los plsmidos Ti y Ri:
Plsmidos Ti: plsmidos nopalina
Octopine plasmid
Agropine plasmid
Succimanopine plasmid

Plsmidos Ri: plsmidos Manopina

Agropine plasmid
Cucumopine plasmid

15

Genes involucrados en la transferencia del T-DNA

- Secuencias de los bordes: LB y RB
Localizados en cualquier regin del plsmido Ti:
4. Genes de virulencia (A, B, D, G, H / C, E)
Localizados en el cromosoma de Agrobacterium (4 loci)
Sntesis de fibrillas de clulosa por Agrobacterium para cubrir la
superficie de la clula vegetal (irreversible). Clusters de Agro
son entrampadas en la red de fibrillas de celulosa.
chvA ychvB (linked): sntesis y excrecin de 1,2-glucan
cel locus: sntesis de fibrillas de celulosa
pscA locus: afectan la sntesis de cicloglicanos y cido
succinilglicano
att locus: afecta protenas de la superficie celular
Algunos de estos loci se encuentran conservados en otras
bacterias del suelo que se nter-asocian con plantas

16

4.4Kb

HindIII

HindIII

RB

LB
NOS-P

nptII

NOS-pA

Ubi1

PIV2

BglII

uidA-int

NOS-pA

3.3 Kb

pBINUbiGUSint

17

Vectores cointegrados vs. binarios

1. Desventajas: Se necesitan amplias regiones de homologa entre plasmido Ti y

vectores de clonacin en E. coli plasmids (pBR322).
2. Relativa ineficiencia de transferencia.

1. Desventajas: Depende de la orientacin. Plasmidos con dos origenes de replicacin

suelen ser inestables en E. coli
2. Ventajas: vectores pequeos, mayor eficiencia de transferencia de E. coli a
Agrobacterium. No se necesita recombinacin intermolecular.

18

PASOS EN EL DESARROLLO DE UN SISTEMA DE TRANSFORMACIN

Especies transformadas
relacionadas. Analizar.

Disponibilidad de
explantos competentes

Desarrollar el cultivo
in vitro de la especie
Medios de cultivo y
fitohormonas
Identificar clulas
regenerables
Protocolo de regeneracin.
Frecuencia
Agentes selectivos /
Estrategia de seleccin

Construccin de
plsmidos adecuado

Accesibilidad a
clulas regenerables

Transformacin

Seleccin de
transformantes

Optimizacin
infeccin con
Agrobacterium

Optimizacin
parmetros
bombardeo
Expresin transitoria

Regeneracin de
plantas transgnicas
Valoracin dao celular

Satisfactorio

Caracterizacin

19

TRANSFORMACIN GENTICA DEL ALCORNOQUE (Quercus suber L)

20

Transformacin
desafos:

va

Agrobacterium:

Uso de Agrobacterium para realizar recombinacin

homloga o sitio-especfica: frecuencia de intregracin
baja.
Expresin predecible de los transgenes en la planta:
efectos de posicin, cromatnicos y de integracin del
ADN-T sobre el silenciamiento gnico.
Modificacin del genoma de Agrobacterium: alteracin del
perfil de expresin de acuerdo con distintos hospedadores
vegetales.
Transformacin de hongos vegetales y animales mediante
Agrobacterium: transformacin de ms especies de hongos.
Transformacin de clulas animales y humanas mediante
Agrobacterium posibles usos en terapia gnica.

21

Especie/individuo de inters
Disponibilidad de explantos

Identificar especies relacionadas

que hayan sido transformadas

Eleccin del
vector de
transformacin

Desarrollo de un sistema de
cultivo eficiente en
proliferacin y frecuencia
de regeneracin

Determinacin de la mejor
combinacin de estrategia de
seleccin/agente selectivo

Medios de cultivo y fitohormonas

Protocolo de regeneracin
SATISFACTORIO

Accesibilidad a las
clulas regenerables
Diseo y desarrollo de
construcciones gnicas

Transferencia de los genes

Localizacin y seleccin de
las clulas transformadas
Empleo de genes delatores/
Bsqueda de genes de inters

Optimizacin de la
eliminacin de Agrobacterium
Expresin transitoria

Regeneracin
Caracterizacin

Valoracin del dao celular

SATISFACTORIO

22

Sensibilidad de los embriones somticos de la lnea M10 a la kanamicina

PFR

Kan (mg/L)
0
12,5
25
37,5
50
75

4
3

PFR acumulado
8
6

0
20

40

60

80

100

Tiempo (das)

20

40

60

80

100

Tiempo (das)

Se cultivaron tres rplicas de 200-500 mg de agregados embriognicos, en oscuridad y a 25 1 C, en placas Petri con
10 mL de medio slido MSSH con kanamicina en el rango de 0-75 mgL1. Los datos representan los incrementos de peso
fresco relativo (PFR, izquierda) y los incrementos de peso fresco relativo acumulado (PFR acumulado, derecha) entre
los subcultivos de 20 das.

23

24

Comparacin de la sensibilidad de los embriones somticos de las lneas M10,

Alm5 y Alm1 a la kanamicina

PFR

M10

Alm5

Alm1

0
12,5
25
37,5
50
75

4
3
2
1
0
-1
20

40

60

80

100 20

Tiempo (das)

40

60

80

100 20

Tiempo (das)

40

60

80

100

Tiempo (das)

Se cultivaron tres rplicas de 200-500 mg de agregados embriognicos, en oscuridad y a 251 C, en placas Petri con
10 mL de medio slido MSSH con kanamicina en el rango de 0-75 mgL1. Los datos representan los incrementos de
peso fresco relativo (PFR) entre los subcultivos de 20 das en tres lneas embriognicas de Q. suber (M10, Alm5 y
Alm1).

25

Sensibilidad de los embriones somticos de la lnea M10 al Finale

glufosinato
amnico (mg/L)

PFR

0
2,5
5
7,5
10

4
3

PFR acumulado
8
6

0
20

40

60

80

100

Tiempo (das)

20

40

60

80

100

Tiempo (das)

Se cultivaron tres rplicas de 200-500 mg de agregados embriognicos, en oscuridad y a 25 1 C, en placas Petri con 10 mL de medio slido
MSSH con Finale (forma comercial del herbicida glufosinato amnico), utilizando de 0 a 10 mgL1 de principio activo. Los datos representan los
incrementos de peso fresco relativo (PFR, izquierda) y los incrementos de peso fresco relativo acumulado (PFR acumulado, derecha) entre los
subcultivos de 20 das.
Los embriones y agregados embriognicos se
cultivaron en oscuridad y a 25 1 C, en placas
Petri con 10 mL de medio slido MSSH con Finale
(forma comercial del herbicida glufosinato
amnico), utilizando de 0 a 10 mgL1 de principio
activo. A, B, C, D y E, fotografas tomadas los das
0, 20, 40, 60 y 80, contando desde el inicio del
experimento; F, control sin Finale a los 80 das de
cultivo.

26

Especie/individuo de inters
Disponibilidad de explantos

Identificar especies relacionadas

que hayan sido transformadas

Eleccin del
vector de
transformacin

Desarrollo de un sistema de
cultivo eficiente en
proliferacin y frecuencia
de regeneracin

Determinacin de la mejor
combinacin de estrategia de
seleccin/agente selectivo

Medios de cultivo y fitohormonas

Protocolo de regeneracin
SATISFACTORIO

Accesibilidad a las
clulas regenerables
Diseo y desarrollo de
construcciones gnicas

Transferencia de los genes

Localizacin y seleccin de
las clulas transformadas
Empleo de genes delatores/
Bsqueda de genes de inters

Optimizacin de la
eliminacin de Agrobacterium
Expresin transitoria

Regeneracin
Caracterizacin

Valoracin del dao celular

SATISFACTORIO

27

Estructura y mapa de restriccin simplificado del plsmido binario pBINUbiGUSint (Humara et al. 1999)

4364 pb

Hind III Bgl II

Hind III

RB

LB
nos 5

nptII

nos 3

Ubi1

PIV2

uidA-int

nos 3

pBINUbiGUSint (~14,4 kpb)

RB y LB, bordes derecho e izquierdo, respectivamente, del ADN-T; nos 5, promotor de la nopalina sintasa; nptII, gen de la
neomicina fosfotransferasa II; nos 3, terminador de la nopalina sintasa; UbiI, promotor de la poliubiquitina de maz; uidA-int, gen
de la -glucuronidasa de Escherichia coli con el intrn PIV2 de patata. En el esquema se sealan los puntos de corte de las enzimas
de restriccin Hind III y Bgl II.

Explantos empleados en la transformacin gentica

A, embrin somtico aislado; B, agregado embriognico (barra, 1mm para ambas imgenes).

28

Etapas del proceso de transformacin gentica de Q. suber

Los explantos, embriones aislados y agregados embriognicos (A; barra, 4 mm), se inocularon con la cepa de A. tumefaciens AGL1
pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C. El cocultivo, de dos das, se realiz en placa Petri a 25 C y en oscuridad (B). Despus
de unos 2-3 meses subcultivndose en medio selectivo (500 mgL1 cefotaxima + 100 mgL1 kanamicina) se detectaron embriones secundarios
putativamente transgnicos (C, flecha), que se mantuvieron en medio selectivo durante dos subcultivos ms (D), antes de aislarlos como lneas
independientes. Las lneas putativamente transgnicas se subcultivaron durante un mnimo de cuatro meses ms en presencia de kanamicina,
pero sin cefotaxima, antes de realizar los ensayos histoqumicos y moleculares.

29

Cepas de Agrobacterium tumefaciens

Cepa
desarmada

Cepa
silvestre

Cromosoma
bacteriano

Tipo de opina

pTi

Resist.
cromos.

Resist.
pTi

Ref.

AGL1

A281

C58

L-L-succinamopina
nopalina

pTiBo542T

rif, carb

Lazo et al.
(1991)

EHA 105

A281

C58

L-L-succinamopina
agropina

pTiBo542T

rif

Hood et al.
(1993)

LBA 4404

Ach5

Ach5

octopina

pAL4404

rif

spec,
strep

Ooms et al.
(1981)

Rif, rifampicina; carb, carbenicilina; spec, espectinomicina; strep, estreptomicina. Los plsmidos Ti de AGL1 y EHA105 son
resultado de deleciones diferentes del ADN-T

EHA105

ineficaz

LBA4404

0,6 %

AGL1

4%

30

Desarrollo de las clulas transgnicas a lo largo del proceso de seleccin

Se inocularon con A. tumefaciens AGL1
pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) agregados
embriognicos y embriones somticos
aislados de Q. suber durante 20 min a 25 C,
que se cocultivaron en oscuridad a 25 C
durante dos das antes de transferirlos a
medio de cultivo selectivo. A las 3, 6, 8 y 10
semanas del momento de la inoculacin se
realiz un ensayo histoqumico que sirvi
para determinar el estado de desarrollo de
las clulas transformadas con el gen uidA.
Puede observarse que, aunque aparecen
eventos
de
transformacin
en
los
cotiledones, los puntos GUS se localizan
preferentemente en la zona del pice
radicular de los embriones. La aparicin de
embriones secundarios se da a las 8
semanas, coincidiendo con las descripciones
de Puigderrajols et al. (1996), y sugiriendo
que ni la kanamicina, ni las clulas no
transformadas, afectan sensiblemente al
crecimiento de las clulas transformadas;
cabe
destacar
que
algunas
clulas
transformadas no parecen continuar con su
desarrollo (8 semanas, flecha), lo que
sugiere que Agrobacterium podra no tener
una preferencia exclusiva por las clulas
meristemticas, suposicin apoyada por el
hecho de que en los cotiledones tambin
aparecen eventos de transformacin que no
dan lugar a embriones secundarios.
Finalmente, puede observarse tambin que
las quimeras son un fenmeno frecuente en
los primeros estadios de la seleccin (8 y 10
semanas), aunque tras un perodo de varios
meses de subcultivos con kanamicina puedan
obtenerse embriones homogneos (no
mostrado en esta imagen).

31

Deteccin de los genes nptII (700 pb) y uidA (1400 pb) mediante PCR Anlisis de Southern de los clones de alcornoque transformados
4364 pb

Hind III Bgl II

Hind III

RB

LB
nos 5

nptII

nos 3

Ubi1

PIV2

uidA-int

nos 3

pBINUbiGUSint (~14,4 kpb)

Geles de agarosa al 0,7% con los productos de PCR de los genes nptII (arriba) y uidA
(abajo). Calles: 1, 11, marcadores de peso molecular [PCR 100-bp low-molecular-weight
ladder (Sigma) arriba, lambda DNA/EcoRI+Hin dIII (Promega) abajo]; 2-7,
clones resistentes a kanamicina obtenidos tras la inoculacin con A. tumefaciens
AGL1 pBINUbiGUSint; 8, clon resistente a kanamicina obtenido tras la inoculacin
con A. tumefaciens LBA4404 pBINUbiGUSint; 9, clon no inoculado; 10, plsmido
pBINUbiGUSint.

Agregados embriognicos y embriones somticos aislados de Q. suber que se inocularon

con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600) durante 20 min a 25 C, y se
cocultivaron en oscuridad a 25 C durante dos das antes de transferirlos a medio de
cultivo selectivo (500 mgL1 cefotaxima + 100 mgL1 kanamicina). Los embriones
secundarios resistentes a kanamicina se siguieron subcultivando en presencia del
antibitico, y la expresin de -glucuronidasa (GUS) se ensay en una muestra de cada
lnea embriognica. Imagen A, explantos subcultivados durante cuatro meses en presencia
de kanamicina, que presentan diferentes niveles de expresin GUS, junto con un explanto
no transgnico barra, 1mm; B, detalle de un embrin probablemente quimrico
analizado tras un mes en presencia de kanamicina

Los ADNs de varios clones cuyo carcter transgnico (uidA+) se haba analizado
mediante PCR se digirieron con Hin dIII (a) o Bgl II (b) y se hibridaron con una
sonda marcada radiactivamente [32P]. La sonda se prepar a partir de un fragmento
del plsmido pBINUbiGUSint que contena el gen uidA, obtenido con Hin dIII (a) o
Hin dIII-Bgl II (b). En A, se indica el peso molecular en referencia al tamao de la
banda del control positivo; en B, se indica en referencia a un marcador de peso
molecular lambda DNA/EcoRI+Hin dIII no marcado radiactivamente.
a. Calles: 1-4, 6, 8-11, ADN de clones transformados de alcornoque; 5, clon no
transformado; 7, patata uidA+ (control positivo). El mismo tamao de todas las
bandas confirma que los clones contienen ntegra la construccin Ubi1-uidA-nos3'.
b. Calles: 3-8, clones transformados de alcornoque; 2, clon no transformado; 1,
patata uidA+ (control positivo). Puede observarse un nmero de inserciones variable
entre clones. Los clones de las calles 3, 4, 7 y 8 se obtuvieron de explantos
independientes; en cambio, los clones de las calles 5 y 6 surgieron del mismo
explanto y se establecieron por separado como lneas independientes, pero su
idntico patrn de hibridacin sugiere que se originaron probablemente en el mismo
evento de transformacin.

32

Efecto del tiempo de cocultivo y la densidad de inculo

bacteriano

Efecto del tipo de explanto inoculado

Densidad de inculo (DO600)

Cocultivo (das)
0,25

0,5

Explanto

kanR (%)

GUS+ (%)

agregado

27,5 29,7 a

87,1 10,0 c

embrin

3,3 2,6

87,5 17,7 c

20,8 16,92 b

16,7 8,4

bc

27,0 31,4 a

14,3 13,7 bc

11,4 13,6

15,4 8,1 bc

Los datos representan la media y el error estndar del porcentaje de tres ensayos
(n = 666) de explantos inoculados que produjeron lneas resistentes a kanamicina (100
mgL1) tras 4 meses de cultivo en su presencia. Los agregados embriognicos y
embriones aislados se inocularon con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (OD600 = 0,5)
durante 20 min a 25 C, y se cocultivaron con la bacteria en oscuridad durante 2 das a
25 C. Distinta letra acompaando a cada valor indica que se hallaron diferencias
estadsticas (p < 0,05) tras analizar los datos dos a dos con un test X2.

Efecto de la temperatura durante el cocultivo

Temperatura (C)

IG

GE

22

41,4 10,8

6,4 5,2

24

33,3 13,5

2,4 1,6

26

30,0 5,7

1,3 0,8

Los datos representan la media y el error estndar de tres ensayos (n =

186). Los agregados embriognicos y embriones aislados se inocularon con A.
tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C y se
cocultivaron en oscuridad durante dos das a tres temperaturas diferentes: 22, 24
y 26 C. Tres semanas despus de la inoculacin se realiz una prueba GUS,
anotndose el porcentaje de explantos inoculados que presentaban puntos GUS
(IG) y el nmero de puntos GUS por cada explanto GUS+ (GE). No se obtuvieron
diferencias significativas tras aplicar un test ANOVA (p > 0,05). A los datos
percentuales se les realiz una transformacin angular para ajustarlos a una
distribucin normal.

Los datos representan la media y el error estndar de dos ensayos (n = 300).

Cada tipo de explanto (i.e. agregados embriognicos y embriones aislados) se
inocul con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) durante
20 min a 25 C y se realiz un cocultivo en oscuridad durante 2 das a 25 C.
Al final del experimento (4 meses de cultivo en presencia de 100 mgL1 de
kanamicina) se anot el porcentaje de embriones inoculados que produjeron
lneas resistentes a kanamicina (kanR), en las que seguidamente se analiz la
actividad -glucuronidasa (GUS+). Distinta letra acompaando a cada valor
indica que se hallaron diferencias estadsticas en un test de X2 (p < 0,001).

Efecto de la luz durante el cocultivo

Tratamientos

kanR (%)

GUS+ (%)

luz

7,42,8ab

88,93,6c

fotoperodo

11,6 3,8 a

100,00,0c

oscuridad

5,4 3,5 b

100,00,0c

33

Efecto del momento de recoleccin de los explantos

Edad de los explantos

Rplica

20 d

27 d

34 d

IG

GE

IG

GE

IG

GE

29,6

7,5

31,6

4,5

47,8

5,0

64,7

9,5

28,6

4,0

6,9

1,0

47,1

8,8

27,8

6,6

4,8

2,0

total

47,1 2,4a

8,6 0,7

29,3 ,4ab

5,0 1,0

19,8 7,2b

2,7 1,5

Los datos representan la media y el error estndar de tres ensayos (n = 192). Se recolectaron embriones aislados y agregados
embriognicos 20, 27 y 34 das despus del subcultivo a medio fresco, que se inocularon con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint
(DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C y se cocultivaron en oscuridad durante dos das a 25 C. A las tres semanas se realiz una prueba
GUS de los explantos, anotndose el porcentaje de explantos inoculados que presentaban puntos GUS (IG) y el nmero de puntos GUS por
cada explanto GUS+ (GE). Distinta letra indica que los valores fueron significativamente diferentes en un test 2 (p < 0,05, aplicado a IG). No
se encontraron diferencias entre los GE en un test de Kruskal-Wallis.

34

Deteccin de la fluorescencia de sGFP

Se inocularon agregados embriognicos y embriones
somticos aislados con A. tumefaciens AGL1 pBIN19-sGFP
(DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C, que se cocultivaron
en oscuridad a 25 C durante dos das antes de
transferirlos a medio de cultivo selectivo (500 mgL1
cefotaxima + 100 mgL1 kanamicina). Unos 2-3 meses
despus comenzaron a aparecer embriones secundarios
resistentes a kanamicina, que se siguieron subcultivando en
presencia del antibitico durante dos meses ms. Al cabo
de este tiempo se analiz la expresin de GFP en una
muestra de cada lnea embriognica, mediante deteccin
de fluorescencia.
Las fotografas fueron tomadas unos 5 meses despus de
la inoculacin de los explantos. Arriba, imagen confocal de
fluorescencia (A) e imagen de transmisin (B) de un mismo
agregado embriognico. Centro, imgenes tomadas con un
microscopio de fluorescencia de un embrin en estado
cotiledonar (C) y de un agregado embriognico (D). Abajo,
imgenes confocales de fluorescencia GFP (E) y de
autofluorescencia (F) que revelan la presencia de tejidos
no transgnicos (zonas que no presentan fluorescencia en
E pero s en F) y, por lo tanto, que la muestra analizada es
quimrica

35

Expresin de PAT en las lneas transgnicas

HindIII

Ubi 1

uidA

EcoRI

Ubi 1

bar

nos 3'

nos 3'

pAHC25
2884 pb

D igestin con Hind III y

disgestin parcial con EcoRI

HindIII EcoRI
Ubi
bar1

HindIII LB

RB

nos 3'

pBIN19

Digestin con Hind III

y religacin

14
12
10
8

bar

pUCUbiBar (5534 pb)

nptII
nos5'

EcoRI

ePAT/pf (%)

HindIII

EcoRI

U/mg (pmolL-1s-1mg-1)
ePAT/pf (%)
1,0
U/mg pf
U/mg ePAT
0,8
0,6
0,4

4
Insercin direccional del
fragmento UbiBar en pBIN19

0,2

1,6 kpb

Hind III Bgl II

Bgl II

RB

LB
nptII

Ubi1

bar

0,0
M10 58 53

41 25

Lneas transgnicas

pBINUbiBar (14,661 kpb)

Esquema de la construccin del plsmido binario
pBINUbiBar. Las secuencias de inters (marcadas en lnea
continua) se extrajeron del plsmido pAHC25 y se
insertaron direccionalmente en el pBIN19. Ubi1, promotor
de la poliubiquitina de maz; uidA, gen de la -glucuronidasa
de Escherichia coli; bar, gen de la fosfinotricina
acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus; nos5,
promotor de la nopalina sintasa de A. tumefaciens; nos3,
terminador de la nopalina sintasa de A. tumefaciens; nptII,
gen de la neomicina fosfotransferasa de E. coli; RB, LB,
bordes derecho e izquierdo, respectivamente, del ADN-T.

Mediante una precipitacin diferencial (30-60%) en sulfato

amnico
se
realiz
un
enriquecimiento
en
fosfinotricina
acetiltransferasa (PAT) del extracto proteico extrado de ocho clones
transgnicos bar (58, 53, 3, 9, 41, 25, 4 y 7) y una muestra de
embriones no inoculados de la lnea M10. La actividad PAT se determin
mediante un ensayo enzimtico y se calcularon las unidades enzimticas:
U/mg pf (unidades por mg de peso fresco) y U/mg ePAT (unidades por
mg de protena determinada en el extracto enriquecido), normalizadas
ambas con respecto a la actividad detectada en el control. Asimismo, se
calcul el porcentaje relativo de extracto enriquecido obtenido a partir
del peso fresco inicial (ePAT/pf), con el fin de tener una idea
aproximada del nivel de expresin de PAT en las muestras.

36

Obtencin de plantas transgnicas de patata

Vector binario

A. tumefaciens LBA 4404

Transformacin

Seleccin y regeneracin

Aclimatacin

37

Deteccin de los genes VP60 y Npt II mediante PCR

M D C K2

VP60

K3 K3T7 UBI Tub2T7 M

D C1 C2 K2 K2 K3 K3 M
Kb

Kb

23,130
9,416

21,2
5,1-4,2-3,5

6,557
4,361 - 2,322
2,027
564

2-1,9
1,5-1,3

Npt II
VP60

0,94-0,83
0,56

23,130
9,416

Npt II

6,557
4,361 - 2,322
2,027
564

D.- Planta control sin transformar

C.- Control
K2.- Plantas transgnicas pK2-VP60
K3.- Plantas transgnicas pK3-VP60
K3T7.- Plantas transgnicas pK3T7-VP60
UBI.- Plantas transgnicas pKUBI-VP60
Tub2T7.- Plantas transgnicas pTub2T7-VP60
M.- Marcadores de ADN de tamao conocido.

38

Transcripcin del gen VP60

D

K3

K2

K3T7

Tub2T7

UBI

VP60

L700

IN

K2

K3

EX TUB IN

EX TUB IN

K3T7
EX TUB

Tub2T7
IN

EX

TUB

VP60

L700

D.- Planta control sin transformar

K2.- Plantas transgnicas pK2-VP60
K3.- Plantas transgnicas pK3-VP60
K3T7.- Plantas transgnicas pK3T7-VP60
UBI.- Plantas transgnicas pKUBI-VP60
Tub2T7.- Plantas transgnicas pTub2T7-VP60

IN.- Hojas (In vitro)

Ex.- Hojas (Invernadero)
TUB.- Tubrculo

39

Niveles del antgeno VP60 en los tubrculos

D 1 2 3 4

5 6 7 Vp60 M

D 1 2

VP60

Fresco
2
3

Homogeneizado
en H2O

Fresco

7 Vp60

kDa

kDa
- 94

- 67

- 67

- 43

- 43

- 30

- 30

Cuantificacin de la protena VP60 en

extractos de tubrculos frescos y liofilizados
VP60

Centrifugacin

1 Mes

- 94

Liofilizado
Homogeneizado
Conservacin
de la protena
VP60 en
2O
tubrculos almacenados a en
4H
C
1

3 4

3
2 Meses

Fresco

Sobrenadante
Liofilizado

40

Protocolo general de infeccin de cotiledones de Pinus pinea con cepas

desarmadas de Agrobacterium tumefaciens
Cubierta o
testa

Semilla

Asepsia

Pin

Placa con 10 ml 1/2LP1

y los cotiledones

Imbibicin 4C, 48 h.

Realizacin de las
heridas: Intacto
Raspado
Bombardeo
SAAT
Inoculacin: 5
o 30 minutos
Transferencia a medio
1/2LP1 slido

Cotiledones
aislados

COCULTIVO
(48-72 h, oscuridad)

41

EFFECT OF DIFFERENT DISARMED STRAINS OF A. TUMEFACIENS

HARBOURING THE PLASMID p35SGUSint ON UIDA EXPRESSION IN P. PINEA
COTYLEDONS

Agrobacterium
tumefaciens strain

EHA105
LBA4404
C58
Control

GUS positive
cotyledons (%)

5.1 a
0.4 b
0.4 b
0c

Mean SE number of
GUS foci/cotyledon

% Cotyledons
forming buds

2.05 0.73a
10.33 b
1 0.33 b
0c

42.5 ab
48 a
31 b
86.5 c

GUS activity and percentage of cotyledons forming buds were quantified 7 and 30 days after inoculation
respectively. Data presented as mean number of at least 4 different experiments " SE. In each column, values with
different letters are significantly different (P # 0.05).

42

EFECTO DEL TIEMPO DE COCULTIVO

Tiempo de
cocultivo (h)

Explantos que

Explantos que

expresan GUS

expresan GUS

tras 7 das de

tras 19 das de

cultivo

cultivo

Supervivencia
tras 21 das
de cultivo
(%)

(%)

(%)

72

15,5 a

34 a

23,6 a

96

8,7 a,b

14,3 b

17,9 a

132

4,6 b

13,9 b

17,9 a

Letras distintas indican diferencias significativas (P<0.05).

43

EFFECT OF BACTERIAL DENSITY AND COCULTURE TIME ON A.

TUMEFACIENS-MEDIATED UIDA GENE TRANSFER EFFICIENCY IN P.
PINEA COTYLEDONS

NUMBER OF GUS FOCI PER TREATMENT

Scraped cotyledons, EHA105 p35SGUSint strain

Data measured 7days after inoculation

1.4

1.2

e f

1.0

c f

0.8
bcd

0.6

c d

a b

0.4
0.2
0

0.25

4
3

0.5

5
2

Treatment

Coculture
(days)
Bacterial
concentration

Data presented as mean number of at least 4 different experiments. Values with different letters are significantly different (P # 0.05).

44

EFFECT OF DIFFERENT WOUNDING PROCEDURES ON A.

TUMEFACIENS-MEDIATED UIDA GENE TRANSFER INTO P.
PINEA

WOUNDING

PROCEDURE

NUMBER OF
ASSAYED
COTYLEDONS

NONE

338

16.6 a

4.1 0.73 a

SCRAPE

311

8.4
b
5.3
b
27.7
c
0
d

2.57 0.3 a

BOMBARDMENT
SAAT
CONTROL

281
318
153

PERCENTAGE OF
GUS-POSITIVE
COTYLEDONS

MEAN NUMBER
OF GUS FOCI
COTYLEDONSE

4.26 1.11 a
Diffuse staining

0b

Stone pine cotyledons with different types of wounds were inoculated with A. tumefaciens EHA105 p35SGUSint according to treatment 6
(inoculation for 5 min, bacterial concentration 1, coculture 3 d). Data were measured 7 days after infection and are presented as mean
number of at least 4 different experiments " SE. In each column, values with different letters are significantly different (P # 0.05).

45

EFFECT OF DIFFERENT WOUNDING PROCEDURES ON PERCENTAGE OF

COTYLEDONS FORMING BUDS
% SURVIVAL ONE MONTH AFTER INOCULATION

% cotyledons forming bud

100

ab

80
60
40
A

20

Intact

Scrape

Bombard.

SAAT

Wounding procedure

Non infected

Infected

Stone pine cotyledons with different types of wounds were inoculated with A. tumefaciens EHA105 p35SGUSint
according to treatment 6 (inoculation for 5 min, bacterial concentration 1, coculture 3 d). Cotyledons that were
not infected were used as controls. Data are presented as mean number of at least 4 different experiments.
Values with different letters are significantly different (P # 0.05).

46

EFFECT OF BACTERIAL DENSITY ON A. TUMEFACIENS-MEDIATED

UIDA GENE TRANSFER INTO P. PINEA COTYLEDONS

Number of
assayed
cotyledons

Percentage Mean SE
number of
of GUS
GUS
positive
foci/cotyledon
cotyledons

320

49.7 a

Manchas

0,5

376

27.7 b

Manchas

0,25

337

28.5 b

Manchas

0,1

350

23.1 b

10.2 1,5

0,01

328

13.4 c

6.25 1,03

Data were measured 7 days after inoculation

% Survival one month after

infection
50

% Cotyleons forming bud

Bacterial
concentration
(OD600nm)

40
30
20
10

b
c

0,1

0,25

0,5

0
Control 0,01

Bacterial concentration
(OD600nm)

Data presented as mean number of at least 4 different experiments. Values with different letters are
significantly different (P 0.05).

47

HindIII

uidA

Ubi 1

HindIII

EcoRI

HindIII

uidA

Ubi 1

bar

Ubi 1

Digestin con HindIII

Digestin con HindIII

HindIII

uidA

Ubi 1

nos 3'

pAHC25

pAHC25

HindIII

bar

Ubi 1
nos 3'

nos
' 3'

nos 3'

EcoRI

HindIII

HindIII

HindIII

HindIII

HindI

5534 pb

4175 pb

5534 pb
Religacin

pUC18
HindIII

HindIII

pBINUbiBar

bar

2884 pb

nos5'

HindIII
Eco RI

pBIN19
RB

pBIN19

LB

HindIII

Ubi 1

nptII
Eco RI

nos 3'

HindIII

p35SGUSint

uidA-int

HindIII

Digestin
HindIII

pUCUbiGUSint

HindII

uidA-int

Ubi 1
4364 pb

HindIII LB

RB
nos5'

nptII

MscI

LB

Digestin
SnaBI y MscI

Fragmento de 426 pb (intrn

PIV2 + 237 pb uidA)
SnaBI

HindIII

RB

Intrn PIV2
ui
dA
-in
t

pUCUbiGUS abierto

Ligacin

Digestin con
HindIII y
EcoRI

HindIII

PIV2

EcoRI

Ubi 1

Digestin
SnaBI y MscI

237 pb

EcoRI

HindIII

35
S

pUCUbiGUS

pUCUbiBar (5534 pb)

nos5'

uidA

Ubi 1

bar

pUC18 abierto
en HindIII y
defosforilado

HindIII

EcoRI

EcoRI

Ubi 1

HindIII

SnaBI
MscI

Digestiones
parciales
con EcoRI

bar

Ubi 1

uidA

Ubi 1

bar

Ubi 1

4175 pb

HindIII

HindIII

Ligacin

nptII
nos 3'

HindIII

pBIN19 abierto
y defosforilado

pBINUbiGUSin

48

RB
Bgl II

promotor Ubi 1
pBINUbiBar
14.610 pb

gen bar
EcoRI

Sph I
Kpn I
Sal I
Pst I

PIV2

Sal I

promotor Ubi 1

Pst I
Sal I
Xba I
BamHI

Xba I

Eco RI
Xba I

Xba I

Xba I
Sal I

HindIII
Sph I
Pst I

SacI
Eco RI
Hind III

Pst I
Sal I
Xba I
BamHI
SmaI

Xba I

Eco RI
Xba I

Xba I

Bgl II

Sal I

HindIII
Sph I
Pst I

Nuevos vectores binarios para la transformacinde Pinus pinea

pBINUbiGUSint
16.141 pb

Xba I

gen uidA-int

nos3'

nos3'

LB
RB

LB

500 pb

49

Structure and restriction map of a portion

of the T-DNA of pBINUbiGUSint

promotor Ubi 1

SacI
Eco RI
Hind III

Xba I
Pst I
Sal I
Xba I
BamHI
SmaI

Eco RI
Xba I

Bgl II
Xba I

Xba I

Sal I

HindIII
Sph I
Pst I

pBINUbiGUSint
16.141 pb

PIV2 -int

gen uidA

nos3'

Gene elements are drawn to scale. The pBIN19 portion of the plasmid is not shown.
Abbreviations: Ubi1, ubiquitin gene promoter; uidA-int, uidA gene with the intron PIV2
from potato; nos3', polyadenylation signal from the nopaline synthase gene; RB and LB,
right and left borders of the T-DNA.

50

Expresin del gen uidA (pBINUbiGUSint) mediada porA. tumefaciens en

cotiledones de Pinus pinea heridos por raspado
Cepa EHA105 p35SGUSint o pBINUbiGUSint. Protocolo B, infeccin 5 minutos y cocultivo 3 das.

Densidad de
infeccin
(A 600 nm)

0,01

1
Control

Plsmido binario

% Cotiledones
con respuesta
GUS +

Unidades
expresin /
cotiledn

p35SGUSint

0 a

0 a

25,9 2,3 a

pBINUbiGUSint

15,2 b

7,5 1,2 b

21,3 2,2 a

p35SGUSint

8,2 c

3,3 0,6 c

1,9 0,7 b

pBINUbiGUSint

41,4 d

7,1 0,6 b

2,4 0,8 b

-------

0 a

-----

% CFY al mes
de inoculacin

70,4 2,1 a

Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05).

51

EFFECT OF PLASMID P35SGUSint AND THE NEW DESIGNED VECTOR, PBINUBIGUSINT, ON UIDA EXPRESSION IN PINUS
PINEA COTYLEDONS SEVEN DAYS AFTER THE INOCULATION WITH AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA105

promotor Ubi 1

SacI
Eco RI
Hind III

Pst I
Sal I
Xba I
BamHI
SmaI

Xba I

Xba I

Bgl II

Nos

Xba I

gen uidA

Eco RI
Xba I

PIV2

Sal I

CaMV35S

HindIII
Sph I
Pst I

pBINUbiGUSint
16.141 pb

p35SGUSint

PIV2

gen uidA-int

nos3'

500 pb
LB

RB
500 pb

W ounding
procedure

Scrape

SAAT

--- Control

(1)

Binary plasmid

% of G US
positive
cotyledons

% of BFC (1) 30

M ean number of
GUS
foci/cotyledon "
SE

inoculation " SE

days after

p35SGUSint

0a

0a

25.9 " 2.3 a

pBINUbiGUSint

15.2 b

7.5 " 1.2 b

21.3 " 2.2 a

----- Control

0a

0a

70.4 " 2.1 b

p35SGUSint

2.1 a

1.2 " 0.4 a

1.5 " 0.6 a

pBINUbiGUSint

33.8 b

9.5 " 1.1 b

0.3 " 0.2 a

----- Control

0c

0a

58.1 " 2.3 b

Non-inoculated

----

89.8 " 2.2

BFC: Bud forming cotyledons.

Bacterial density used for inoculation (OD600nm) was 0.01. Data are presented as mean number of at least three
different experiments " standard error (SE). In the column and for each wounding procedure, values with different
letters are significantly different (P # 0.05).

52

Transformacin gentica mediada por virus

Obtencin de partculas virales quimeras
Pptido

+
Infeccin
Virus vegetal

Extraccin

Partculas virales
quimeras

53

Usos de los virus de plantas en biotecnologa e investigacin

1. Expresin de protenas en plantas

- Vector de expresin
-Protenas
virales
supresoras
transcripcional

del

silenciamiento

post-

2. Anlisis funcional de genes en plantas

- Vector de silenciamiento post-transcripcional

54

Transformacin
Electroporacin.
perspectivas.

gentica . Mtodos directos. Biobalstica.

Microinyeccin. Ejemplos. Estado actual y

55

 Sistemas de transferencia de ADN basados

en vectores biolgicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes
- Sistemas basados en virus vegetales
Sistemas de transferencia directa de ADN
- Transferencia por bombardeo de micropartculas o biobalstica
- Transferencia mediada por electroporacin y/o mtodos qumicos
- Transferencia con whiskers de carburo de silicio
- Transferencia por microinyeccin

56

 Ventajas
- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de
organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las clulas del organismo vector de los
tejidos o plantas transgnicas
- Requieren construcciones ms simples y pequeas
- Son apropiados para estudios de expresin transitoria
Desventajas
- Pueden resultar en un alto nmero de copias y/o copias truncadas
del transgn y del vector en varios sitios del genoma de las clulas
transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparicin de
re-arreglos en los transgenes
*Se recomienda tomar ciertas precauciones: a) reducir el nmero de transgenes a transferir, b) evitar el uso
de mltiples copias del mismo promotor o terminador y c) evitar el uso de promotores y transgenes con un
alto grado de similitud a promotores o genes endgenos.

57

Transferencia de genes mediante disparo de

partculas o Biobalstica
Biolistics: Partculas esfricas (0,4-1,2 m ) de oro o wolframio recubiertas con
ADN que se aceleran e impulsan a alta velocidad (3-600 metros/seg) con gas
comprimido (helio), impactando, atravesando las paredes de las clulas vegetales y
depositandose en el citoplasma y orgnulos (ncleo, mitocondrias y cloroplastos).
Se puede transformar un amplio rango de cultivos celulares y tejidos:, suspensiones,
callos, meristemos, embriones, coleoptilos y polen, especialmente de especies nos
susceptibles a Agrobacterium, como son las monocotiledoneas.

58

Bombardeo de micropartculas
1984. Sandford et al., describen la tcnica de bombardeo de micropartculas
para la transferencia directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).
Diseo del primer acelerador de micropartculas impulsadas por explosin
de plvora

59

Bombardeo de micropartculas
1987. Klein et al. demuestran la utilidad del mtodo al observar expresin
transitoria en clulas epidrmicas de Allium cepa usando un dispositivo de
impulsin a plvora y micropartculas de tungsteno recubiertas de ADN.
1988. Christou et al. demuestran la utilidad del mtodo para transferir
ADN biolgicamente activo en clulas vivas y obtener transformantes
estables.
1988. Johnston et al. logran transformar por primera vez microorganismos
y organelas.
1988. Wang et al., Mc Cabe et al., Christou et al. obtienen plantas
superiores transgnicas.
1991. Williams et al. demuestran la transformacin de animales in vitro e

in vivo.

60

La transformacin por biobalstica depende de factores

fsicos, qumicos y biolgicos
Parmetros fsicos y qumicos que influyen
en la transferencia del ADN
- Mtodo de aceleracin de las micropartculas
- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumen de las
micropartculas
- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracin del ADN
- Vaco y distancias de bombardeo
- Dimetro de apertura de la placa de retencin
- Nmero de bombardeos
Parmetros relacionados con la construccin
gentica utilizada
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
genes marcadores de seleccin

61

Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas

62

 La aceleracin de las micropartculas puede

generarse por:
- Explosin qumica de plvora seca
- Descarga de helio a alta presin
- Descarga de aire, CO2 o N2 comprimido
- Descarga elctrica de alto voltaje y baja capacitancia
o bajo voltaje y alta capacitancia
- Flujo de partculas o flujo de helio a baja presin por aspersin
- Flujo de helio con can de precisin

63

Modelo

comercial

actual
Medidor de presin de helio
Tubo de aceleracin de gas
Interruptoresde control
Medidor de vaco
Portador del disco
de ruptura
Portador del
macroproyectil
Ensamblaje del propulsor
de microproyectiles
Cmara de
bombardeo
Clulas blanco
Soporte del blanco

Vlvula de medicin
de helio
Controles del flujo
de aire y de vaco

Acelerador de micropartculas PDS 1000/He por descarga de helio a alta presin

64

La transformacin por biobalstica depende de factores fsicos, qumicos

y biolgicos
Parmetros fsicos y qumicos que influyen
en la transferencia del ADN
- Mtodo de aceleracin de las micropartculas
- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumen
de las micropartculas
- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracin
del ADN
- Presin, vaco y distancias de bombardeo
- Dimetro de apertura de la placa de retencin
- Nmero de bombardeos

Parmetros relacionados con la construccin

gentica utilizada
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
genes marcadores de seleccin

65

Caso prctico: Amplificacin de progenie en Pinus pinea.

Hay programa de mejora gentica.
De cada cruce controlado se pueden obtener cientos de semillas. De cada semilla un
rbol.
Con tcnicas de cultivo in vitro se pueden producir cientos de plntulas a partir de una
semilla.
Esterilizacin
Imbibicin
4 C, 48 h

Semilla

LPC

Elongacin 60 d

Embrin aislado

LPB

Cotiledones
excindidos

Induccin durante
2, 4, 8, 16 y 35 d

66

Transformacin de cotiledones de
Pinus pinea mediante bombardeo de
micropartculas
Cubierta o
testa

Semilla

ASEPSIA
(Perxido de hidrgenos 7,5
%, 45 minutos)

PION de

Pinus pinea

Placas de bombardeo
(1/2LP1)
Imbibicin 4C, 48 h.
Biolistic
He-1000

Escisin de los
cotiledones
1/2LP0

Cotiledones escindidos

Cultivo 24 h
oscuridad

Embrin aislado

67

PBI 121

CaMV35S

gen uidA

Nos

500 pb
Este gen GusA codifica para la enzima glucuronidasa cuya actividad se determina por los mtodos 1) histoqumico en
el cual la -glucuronidasa hidroliza al sustrato X-Glu produciendo una coloracin azul y 2) fluoromtrico donde la
glucuronidasa hidroliza el sustrato Metil Umbeliferil Glucuronido liberando el grupo fluorgeno Metil Umbeliferona
(MU).

68

EFECTO DE LA DISTANCIA Y LA PRESIN DE

BOMBARDEO SOBRE LA EXPRESIN DEL GEN gusA

4
3
2
1
0

FUENTE DE HELIO

6
9
DISTANCIA (cm)

% Explantos que expresan GUS

Unidades de expresin/explanto

CONDICIONES DE BOMBARDEO: DIMETRO ORO 1 m, CONCENTRACIN DE ADN 0.8 g /

DISPARO, PLSMIDO PBI121

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

6
9
DISTANCIA (cm)

Letras distintas indican diferencias significativas (P<0.05).

DISCO DE
RUPTURA

DISTANCIA
MACROCARRIER-RED DE
PARADA (6 mm)
DISTANCIA DE VUELO DE

MACROCARRIER
(ORO+ADN)
RED METLICA
DE PARADA

LAS MICROPARTCULAS
PLACA PETRI CON MATERIAL VEGETAL

CAMARA SOMETIDA A
VACIO

69

EFECTO DEL DIMETRO DE LAS PARTCULAS SOBRE LA

EXPRESION DEL GEN gusA
CONDICIONES DE BOMBARDEO: DISTANCIA 6 cm, PRESION 4,5 MPa, CANTIDAD DE ADN 0.8 g /
DISPARO.

Dimetro de
partcula (M)

N cotiledones
ensayados

%
Cotiledones
con respuesta

Unidades de
expresin /
cotiledn

344

85,7 a

7,10,4 a

1,6

377

65,3 b

3,50,3 b

Letras distintas indican diferencias significativas (P<0,05).

70

EFECTO DE LA CANTIDAD DE ADN POR DISPARO SOBRE LA

EXPRESIN DEL GEN gusA
CONDICIONES DE BOMBARDEO: DISTANCIA 6 cm, PRESION 4,5 MPa, DIAMETRO DE LAS
PARTICULAS 1 M

Cantidad de
ADN
(g/disparo)

% Cotiledones
con respuesta

Unidades de
expresin /
cotiledn

0,4

42,5 a

2,70,24 a

0,8

85,3 b

7,30,4 b

1,6

65,3 c

5,70,5 c

Letras distintas indican diferencias significativas (P<0,05).

71

EFECTO DEL PERODO DE CULTIVO DE LOS COTILEDONES

SOBRE LA EXPRESIN DEL GEN gusA
CONDICIONES DE BOMBARDEO: DISTANCIA 6 cm, PRESION 4,5 MPa, CANTIDAD DE ADN 0.8 g /
DISPARO, DIAMETRO DE LAS PARTICULAS 1 M.

Perodo de
cultivo

% Cotiledones
con respuesta

Unidades de
expresin /
cotiledn

85,4 a

7,10,4 a

71,8 b

4,60,3 b

55,4 c

3,50,4 c

14,7 d

1,5 0,2 d

Letras distintas indican diferencias significativas (P<0,05).

72

PBI 364

pRC 31
pRD 330

PBI221

pRC 30

500 pb

73

EFECTO DE LOS INTRONES Sh1-int1 Y Adh1-int1 SOBRE LA

EXPRESION DEL GEN gusA
CONDICIONES DE BOMBARDEO: DISTANCIA 6 cm, PRESION 4,5 MPa, DIAMETRO DE LAS
PARTICULAS 1 M, CANTIDAD DE ADN 0,8 g/disparo .

Plsmido
_
PBI221

Promotor

%Cotiledones
con respuesta

Unidades de
expresin/
cotiledn

pmolMU/mg *
protena min

control

0,10,006 c

35SCaMV

79,5 c

6,40,6 c

14,042,3 a

95,4 a

9,90,7 a

48,29,7 b

81,8 c

7,20,5 c

87,814,8 b

99,4 a

10,80,6 a

27026,1 d

5,3 b

1,10,1 b

0,80,5 c

pRC 30

35SCaMV-Sh1-int1

PBI364

35SCaMV-35SCaMV

pRC 31

35SCaMV-35SCaMV-Sh1-int1

pRD 330

35SCaMV-35SCaMV-Adh1-int1

Letras distintas indican diferencias significativas (P<0,05).

*Esta
enzima degrada el sustrato
4metilumbeliferil-B-D-glucornido (MUG)
;
formando
4-metilumbeliferona
la cual es
detectada por su fluorescencia en presencia de
luz UV de onda larga.

74

Vectores utilizados en el estudio del efecto de las secuencias promotoras

sobre la expresin transitoria del gen
uidA en cotiledones de Pinus pinea
PBI 121
PBI 364
pCGU

pA1GusN

35S35S

p35SGUSint

gen uidA

Adh 1

Nos

gen uidA

CaMV35S

Nos
Nos
Nos

gen uidA

Ubi1
Act1-D

Nos

gen uidA

Ub B1 delecionado

pAHC25
pAct1-D

gen uidA

CaMV35S

gen uidA

PIV2

Nos
gen uidA

Nos

500 pb

75

Efecto de las secuencias promotoras sobre la expresin transitoria del

gen uidA en cotiledones de Pinus pinea

Ensayo histoqumico

Ensayo fluoromtrico

570,6

70

45,9

316,7

26,4

30,3

pA
H
C2
5
p3
5S
GU
Si
nt

4
pC
GU

PB

36

1
12
I
PB

l
ro
nt
Co

ac
15,3

8,2

ac

100
11,5

pA
1G
us
N

8,9

200

-D

10

500
300

ct
1

40
20

50,8

50,5

400

50
30

600

55,1

pA

60

700

Picomoles MU / mg / min

Unidades de expresin / cotiledn

Parmetros: distancia 6 cm, oro 1 m, presin 900 psi, cantidad de ADN 0,8 g /
disparo.

Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05).

76

77

Nuevos vectores binarios para la transformacin de Pinus pinea

promotor Ubi 1

gen uidA -int

PIV2

nos3'

LB

promotor Ubi 1

gen bar

EcoRI

Kpn I
Sal I
Pst I

Sph I

Sal I

Pst I
Sal I
Xba I
BamHI

Xba I

Eco RI
Xba I

Xba I

Bgl II

pBINUbiBar
14.610 pb
Sal I

HindIII
Sph I
Pst I

RB

Xba I

RB

Hind III

SacI
Eco RI

Pst I
Sal I
Xba I
BamHI
SmaI

Xba I

Eco RI
Xba I

Bgl II

Xba I

Xba I

Sal I

HindIII
Sph I
Pst I

pBINUbiGUSint
16.141 pb

nos3'

LB

500 pb

78

Expresin del gen uidA del plsmido pBINUbiGUSint en cotiledones de

Pinus pinea : Comparacin con pAHC25 y p35SGUSint

pmol MU / mg / min

Parmetros: distancia 6 cm, oro 1 m, presin 900 psi, cantidad de ADN 0,8 g / disparo.

270,75

300
250
200
150
100
50
0

c
43,81
2,18

Control

9,86

b
pBINUbiGUSint

pAHC25

p35SGUSint

Plsmido bombardeado
Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05).

79

80

La biobalstica puede utilizarse con diversos fines experimentales

- Transferencia de genes a clulas, tejidos y rganos vegetales
- Transferencia de genes a microorganismos, clulas eucariticas y orgnulos
- Estudio de expresin transitoria
- Anlisis de promotores y de deleccin de genes
- Estudio de mecanismos de expresin y regulacin de genes
- Estudio de infecciones virales
- Transferencia de ARN viral
- Estudio de vas metablicas
- Estudio del desarrollo de plantas

81

Transferencia de ADN mediada por electroporacin y/o mtodos qumicos

Hoja
seccionada

Proliferacin
de callo

FILTRADO

Plsmido +
Ca(NO3)2

Ensayo GUS

Suspensin celular

Transformacin

82

AISLAMIENTO Y ELECTROPORACIN DE
PROTOPLASTOS DE Pinus nigra Arn

DIGESTIN

RESUSPENSIN
EN MANITOL

PLNTULAS DE 8 DAS

Fuente de alimentacin
Duracell

Protoplasto

ELECTROPORACIN

83

4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0

VIABILIDAD (%)

pmol MU/mg protena min

EFECTO DE LA CAPACIDAD Y EL VOLTAJE SOBRE LA

EXPRESION TRANSITORIA DEL GEN gusA EN
PROTOPLASTOS DE
Pinus nigra Arn.

200 300 400

CAPACIDADES

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

200 300 400

CAPACIDADES

FUERZAS DE CAMPO APLICADAS

500 V/cm
625 V/cm
750 V/cm

84

EFECTO DEL PROMOTOR SOBRE LA EXPRESIN DEL GEN

PROTOPLASTOS ELECTROPORADOS DE
Pinus nigra
Plsmido
control

gusA EN

Arn.

pmol MU / mg de protena min

7,8 1,9 e
225,2 29 d
27,3 2,7 b

4425,8 585 a
35,3 6,9 b
1434 340 c
22 3,5 b
Letras distintas indican diferencias significativas (P<0.05).

85

Transformacin de plastidios
Plantas transplastmicas

La clula vegetal tiene varios cloroplastos. (cientos o

decenas) y slo un ncleo.
Los cloroplastos expresan los genes bacterianos con
mayor facilidad debido a su origen procaritico.
La expresin del material gentico es ms estable.
Integracin por recombinacin homloga.
Evitamos el silenciamiento gnico.
Poseen ARNm policistrnico.
Se transmite, con excepciones (en ciertas conferas y
otras), por va materna.

86

Marcadores
-Genes dominantes de la resistencia a antibiticos:
- aadA (Spectinomicina)
- nptII (kanamicina)
-Genes recesivos que restauran el crecimiento de
fotoauttrofos.
- Alternativas para evitar la resistencia antibitica:
Gen productor de betaina aldehido deshidrogenasa
(BADH) y el gen GFP .

87

TRANSFORMACIN DE CLOROPLASTOS
1- Evitar contaminacin gentica por parte de las
plantas transgnicas a las silvestres.
2- Proteger a los consumidores de dichas especies
transgnicas de intoxicaciones.
3- Producir grandes cantidades de una protena
extraa interesante para el hombre.
4- Alcanzar el mximo rendimiento en la produccin
de plantas transgnicas.

88

La expresin de toxina Cry de Bacillus thurigiensis en cloroplastos

confiere amplia resistencia contra insectos

Protenas Cry de Bacillus thuringiensis

-Poseen potente actividad insecticida contra
Insectos lepidpteros, dpteros y colepteros.
Resultados:
Se obtuvieron altos niveles de expresin
de la toxina (aproximadamente 2-3 % de peso total soluble) asociados a una alta tasa
de mortalidad (~100 %) para Heliothis virescens, Helicover pazea y Spodopter
aexigua en los ensayos de infestacin.
La transformacin de cloroplastos podra ser un sistema apropiado para
acumular altos niveles de la -entomotoxina Cry debido al origen procariota del
gen.

89