Facultad de Qumica

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PRCTICAS DE BIOQUMICA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL
Y BIOLOGIA MOLECULAR

PRCTICA 1.1 : FSICOQUMICA DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

A) Separacin de glutamina y glutamato mediante intercambio inico

1) Se dispone de 3 columnas cargadas con aprox. 2 ml de resina de intercambio aninico DOWEX AG1-X8
equilibradas en agua. Cada una de las columnas se carga con 2 adiciones sucesivas de 1 ml de lo siguiente: a)
Glutamato 1 mM en tampn fosfato 0,1 M de pH 7,5 ; b) Glutamina 1 mM en el mismo tampn; c) una
mezcla a partes iguales de Glutamina y Glutamato 1 mM en el citado tampn. Se deja que eluya cada adicin
de 1 ml en una fraccin separada, recogindose por tanto dos fracciones de aprox. 1 ml (fracciones O1 y O2).
2) A cada columna se aaden 6 ml de agua destilada, mediante adiciones sucesivas de 1 ml recogiendo para
cada adicin el eluyente correspondiente en una fraccin separada (6 fracciones de aprox. 1 ml por cada
columna) (fracciones A1-A6).
3) A dada columna se aaden 6 ml de cido actico 2 N, y se procede igual que en el punto anterior
(fracciones B1-B6).
4) Aadir a cada fraccin eluda 2 ml del reactivo de Cd-Ninhidrina y calentar a 80 C durante 10 min,
manteniendo posteriormente los tubos en hielo 5 min.
PRECAUCIN: Usar guantes para evitar las manchas de ninhidrina en la piel!
Reactivo Cd-Ninhidrina: 0,4 g ninhidrina
1 g de acetato de Cadmio 2 H2O
80 ml de etanol absoluto
10 ml de actico
20 ml de agua destilada
5) Leer la absorbancia a 506 nm de cada tubo.
6) Representar los perfiles de elucin de cada columna (A506 frente a n de fraccin) e interpretar los
resultados obtenidos.
7) Responder a las siguientes cuestiones:
a) Se habran obtenido los mismos resultados si se hubiese utilizado aspartato en lugar de glutamina?
b) Se habran obtenido los mismos resultados si las muestras se hubiesen aplicado a pH=1?Y a pH=10?
c) Se habran obtenido los mismos resultados si se hubiese utilizado una columna de intercambio catinico?

B) Filtracin en Sephadex G-25

1) Se dispone de una columna cargada con aprox. 2 ml de Sefadex G-25 y equilibrada en agua destilada.
2) Se carga en dicha columna una mezcla de 125 l de citocromo c 5 mg/ml (preparado en Tris-HCl 10 mM
pH 7,5) + 125 l CuSO4 5 H2O al 40 % (p/v) en agua. Recoger el eluyente en una sola fraccin hasta que
deja de gotear (4-5 gotas aprox.).
3) Aplicar a la columna sucesivas adiciones de 250 l de agua destilada recogiendo el eluyente de cada
aplicacin (4-5 gotas aprox.) en una fraccin distinta. Comprobar la separacin progresiva de los colores rojo
y azul.
4) Aadir a cada fraccin 750 l de agua y leer las absorbancias a 409 nm (correspondiente al citocromo c) y
700 nm (para el SO4Cu). Representar los perfiles de elucin de ambas absorbancias para las distintas
fracciones, e interpretar los resultados obtenidos teniendo en cuenta que el intervalo de fraccionamiento del
Sephadex G-25 es 1.000 a 5.000 y el peso molecular del citocromo c es 13.400.
5) Responder a las siguientes cuestiones:
a) Se habran obtenido los mismos resultados en una columna de Sephadex G-100 (intervalo de
fraccionamiento 4.000 - 150.000).
b) En qu buffer o medio habr eludo el citocromo c? ; est a la misma concentracin que se aplic?.
c) Podra utilizarse este tipo de columnas para dializar extractos, es decir, separar las sales y otras
molculas de pequeo tamao de las protenas y componentes de alto peso molecular? Qu rango de
volumen de elucin habra que tomar?.
d) Cul ser el V0 y Vt de la columna?.

C) Espectroscopa UV-Vis de sistemas biolgicos redox

Cada grupo de 2 parejas efectua una de las siguientes opciones segn le indique el profesor:
1) Realizar un espectro de absorcin de una de las fracciones de citocromo c eludas de la columna anterior.
Aadir unos critales de ditionito y repetir el espectro para la protena reducida. Contrastar los mximos
de absorcin de la protena reducida y oxidada.
2) Realizar un espectro de absorcin de una preparacin de NADH 0,15 mM, y repetirlo para la forma
oxidada comercial NAD+. En base a los resultados explicar por qu los ensayos de muchas
deshidrogenasas se efectan midiendo la absorbancia a 340 nm.
3) Realizar un espectro de absorcin de una preparacin de FAD 40 M en ausencia y presencia de unos
cristales de ditionito, y establecer los parecidos y diferencias entre este flavn nucletido y el piridn
nucletido (NADH/NAD+) ensayado anteriormente.

HOJA DE RESULTADOS
(prctica 1.1.)

A)

Muestra
a) Glu
b) Gln
c)Glu+Gln

O1

O2

A1

A506 / fraccin
Elucin Agua
A2 A3 A4 A5 A6 B1

Elucin actico
B2 B3 B4 B5

B)

1
A409
A700

FRACCIN N
5
6
7

10

B6