Facultad de Qumica

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Spain
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DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL

Y BIOLOGIA MOLECULAR

PRACTICAS DE BIOQUIMICA
PRACTICA 1.2. CINETICA ENZIMATICA
Ensayo de actividad de la fosfatasa alcalina: Vmax
La fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP) es una glucoprotena (PM = 138.000)
con un 12 % (p/p) de carbohidrato, y a la vez una metaloenzima que tiene dos subunidades
idnticas con 2 Mg++ y 1 Zn++ cada una de ellas. La funcin fisiolgica de la enzima es
hidrolizar, a pH alcalino, el enlace fosfoster de compuestos orgnicos fosforilados, liberando
fosfato inorgnico (Pi):
R-O-PO3= + H2O R-OH + HPO4= (Pi)
Como sustrato de esta enzima utilizaremos un compuesto artificial, el p-nitrofenil-fosfato
(NPP), que puede ser reconocido por la enzima puesto que posee una estructura orgnica a la
que se encuentra unido el grupo fostato:
NO2-C6H6-O-PO3= + H2O NO2-C6H6-OH + HPO4=
El nitrofenol absorbe caractersticamente a 410 nm, siendo el coeficiente de extincin 16 mM-1
x cm-1. Esto nos permite seguir cuantitativamente su aparicin en el transcurso de la reaccin
enzimtica. Por otra parte, el otro producto de la reaccin (Pi) ejerce un efecto inhibidor sobre
la enzima, lo que permite detener su accin en cualquier momento sin ms que aadir una
concentracin suficientemente alta del propio fosfato.
El ensayo de actividad lo iniciaremos por adicin de una alcuota de la preparacin
enzimtica (V ml) a una disolucin de sustrato en tampn Tris-HCl 100 mM (pH 8)
conteniendo MgCl2.6H2O 1 mM y ZnCl2 0,1 mM, que suministra el pH alcalino necesario
para la reaccin, la fuerza inica adecuada y los cofactores apropiados (tampn de trabajo en
lo sucesivo) Tras incubar la mezcla de ensayo a la temperatura idnea (30 C) durante un

cierto tiempo (t min), la reaccin se para por la adicin de fosfato potsico (K2HPO4)
concentrado (1 M). Los micromoles de nitrofenol (n moles) se calculan a partir de la ley de
Lamber-Beer, teniendo en cuenta el volumen final de la mezcla de ensayo (V ml):
A=ExLxC
A = Absorbancia
E = Coeficiente de extincin (16 mM-1 x cm-1 a 410 nm)
C = Concentracin (mM)
L = Paso de luz (1 cm)
n (moles) = C (moles/ml) x V (ml) =

A
xV '
16

A partir de los valores obtenidos se puede calcular la actividad enzimtica:

Actividad (U) =

A
1
n
A V '
= xV ' x (
x )
t
16
t
t 16

Actividad (U/ml) =

Actividad (U )
V (ml )

Si el ensayo se ha realizado a saturacin de sustrato y en condiciones ptimas, la actividad

obtenida es la Vmax. Las condiciones estndar de ensayo son las siguientes:
NPP 1,5 mM en el tampn de trabajo..................................................................3ml
Fosfatasa alcalina (suspensin de 20 g protena/ml en el tampn de trabajo)...0,1 ml
(Incubar 15 min a 30 C)
K2HPO4 1 M .......................................................................................................0,5 ml
y se lee la absorbancia a 410 nm frente a un blanco (ensayo sin preparacin enzimtica o
ensayo parado a tiempo cero).

Formacin de producto con el tiempo de reaccin y con la cantidad de enzima

Para la aparicin de producto con el tiempo seguir el siguiente protocolo:
Reactivo
NPP 1,5 mM (ml)
Fosfatasa alcalina (ml)
Incubacin a 30 C (min)
K2HPO4 1 M (ml)
A410 nm

Blanco
3,0
0,1
0
0,5
0

1
3,0
0,1
5
0,5

2
3,0
0,1
10
0,5

3
3,0
0,1
15
0,5

4
3,0
0,1
20
0,5

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-4) frente al blanco. Representar los
valores de absorbancia obtenidos (ordenada) frente al tiempo de incubacin (abscisa). Calcular
la actividad enzimtica en U, U/ml y U/mg protena. Calcular tambin la actividad molar o
nmero de recambio en min-1 (kcat) y el tiempo de ciclo cataltico.
Para ver el efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de reaccin
(aparicin de producto en funcin de la cantidad de enzima) seguir el siguiente protocolo:
Reactivo
NPP 1,5 mM (ml)
Tampn de trabajo (ml)
Fosfatasa alcalina (ml)
Incubar 5 min a 30 C
K2HPO4 1 M (ml)
A410 nm

Blanco
3,0
0,4
0

1
3,0
0,3
0,1

2
3,0
0,2
0,2

3
3,0
0,1
0,3

4
3,0
0
0,4

0,5
0

0,5

0,5

0,5

0,5

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-4) frente al blanco. Representar la
actividad de la enzima en U (ordenada) frente a la cantidad de preparacin enzimtica (ml)
usada en cada tubo (abscisa). Calcular el valor de la pendiente de la recta obtenida y explicar
su significado.

Clculo de la Km para el nitrofenolfosfato y de la Ki para el fosfato

Seguir el siguiente protocolo para el clculo de la Km para el nitrofenolfosfato:
Reactivo
NPP 1 mM (ml)
NPP 25 M (ml)
Tampn de trabajo (ml)
Fosfatasa alcalina (ml)
Incubar 15 min a 30 C
K2HPO4 1 M (ml)
A410 nm

B1 1
B2 2
B3 3 B4
2,5 2,5 1,5 1,5 0,5 0,5 0,1
0
0
0
0 0
0 0
0,6 0,5 1,6 1,5 2,6 2,5 3,0
0 0,1 0
0,1 0
0,1
0

4
0,1
0
2,9
0,1

B5
0
2,5
0,6
0

5
0
2,5
0,5
0,1

B6
0
1,5
1,6
0

0,5 0,5
0

0,5 0,5
0

0,5

0,5 0,5
0

0,5 0,5
0

0,5 0,5 0,5

0
0

6
0
1,5
1,5
0,1

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos(1-6) frente a su respectivo blanco.
Calcular la velocidad de la reaccin enzimtica (moles/min) para cada una de los
concentraciones de sustrato utilizadas (806, 484, 161, 32, 20 y 12 M respectivamente ) y
hacer la representacin de dobles inversos. Calcular Km y Vmax.
Seguir el siguiente protocolo para el clculo de la Ki para el fosfato:
Reactivo
NPP 1 mM (ml)
NPP 25 M (ml)
K2HPO4 5 mM (ml)
Tampn de trabajo (ml)
Fosfatasa alcalina (ml)
Incubar 15 min a 30 C
K2HPO4 1 M (ml)
A410 nm

B1 1
2,5 2,5
0
0
0,1 0,1
0,5 0,4
0 0,1

B2 2
1,5 1,5
0
0
0,1 0,1
1,5 1,4
0
0,1

B3
0,5
0
0,1
2,5
0

3
0,5
0
0,1
2,4
0,1

B4
0,1
0
0,1
2,9
0

4 B5
0,1 0
0 2,5
0,1 0,1
2,8 0,5
0,1 0

5
0
2,5
0,1
0,4
0,1

B6
0
1,5
0,1
1,5
0

0,5 0,5
0

0,5 0,5
0

0,5 0,5
0

0,5
0

0,5

0,5

0,5 0,5
0

0,5
0

6
0
1,5
0,1
1,4
0,1

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos(1-6) frente a su respectivo blanco.
Calcular la velocidad de la reaccin enzimtica (moles/min) para cada una de los
concentraciones de sustrato utilizadas (806, 484, 161, 32, 20 y 12 M respectivamente) y
hacer la representacin de dobles inversos. Deducir el tipo de inhibicin y calcular la Ki para
el fosfato, as como el porcentaje de inhibicin para la concentracin de fosfato utilizada (160
M) y para una concentracin de sustrato 32 M.

Temperatura ptima y estabilidad trmica de la enzima: clculo de la energa de

activacin (Ea) y del tiempo de vida media (T1/2)
Para calcular la temperatura ptima seguir el siguiente protocolo:
Reactivo

B1

B2

B3

B4

NPP 1,5 mM (ml)

Tampn de trabajo (ml)
Fosfatasa alcalina (ml)
Incubar 10 min (C)
K2HPO4 1 M (ml)
A410 nm

3,0
0,1
0
20
0,5
0

3,0
0
0,1
20
0,5

3,0
0,1
0
30
0,5
0

3,0
0
0,1
30
0,5

3,0
0,1
0
40
0,5
0

3,0
0
0,1
40
0,5

3,0
0,1
0
50
0,5
0

B5

3,0
0
0,1
50
0,5

3,0
0,1
0
60
0,5
0

3,0
0
0,1
60
0,5

B6

B7

3,0
0,1
0
70
0,5
0

3,0
0
0,1
70
0,5

3,0
0,1
0
80
0,5
0

3,0
0
0,1
80
0,5

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-7) frente al blanco. Representar la
actividad de la enzima en U (ordenada) frente a la temperatura (abscisa) para deducir la
temperatura ptima. Calcular la energa de activacin (Ea) a partir de la representacin de
Arrhenius.
Para calcular el tiempo de vida media (T1/2) incubar la preparacin enzimtica a 60 C y
realizar el ensayo estndar cada 15 min:
Reactivo
NPP 1,5 mM (ml)
Tampn de trabajo (ml)
Fosfatasa alcalina (mlmin)
Incubar 10 min a 30 C
K2HPO4 1 M (ml)
A410 nm

B
3,0
0,1
0
0,5
0

1
2
3,0 3,0
0
0
0,10 0,115
0,5

0,5

3
3,0
0
0,130

4
3,0
0
0,145

5
3,0
0
0,160

0,5

0,5

0,5

(100%)

Leer la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos (1-5) frente al blanco. Representar el
porcentaje de actividad residual de la enzima el log de dicho porcentaje (ordenada) frente al
tiempo de incubacin (abscisa) para deducir T1/2 y la constante de inactivacin kd a 60 C.
Comprobar la estabilidad de la enzima a 0-4C durante 24 h.

Reactivos y material especfico necesario

-Preparacin enzimtica (fosfatasa alcalina de intestino de ternera de Roche-Biomol, Grado II,
Ref. 108 162, 100 mg-10 ml) diluda 500 veces en el tampn de trabajo: 12 x 10 ml (240 l en
120 ml).
-Nitrofenil fosfato disdico hexahidratado (Ref. 71770 de Fluka) 1,5 mM en el tampn de
trabajo: 2 dispensadores de 0-5 ml (668 mg en 1.200 ml).
-Tampn de trabajo (Tris-HCl 100 mM, pH 8, conteniendo MgCl2.6H2O 1 mM y ZnCl2 0,1
mM): 12 x 40 ml.
Trizma Base [Tris(hidroximetil)aminometano] (Ref. T-1503 de Sigma)
Acido clorhdrico (Ref. 84418 de Fluka)
Cloruro de magnesio hexahidratato (Ref. 31413 de Fluka)
Cloruro de zinc (Ref. 31650 de Fluka)
-Fosfato potsico dibsico (Ref. 60356 de Fluka) 1 M: dispensador de 0-1 ml (174,18 g en
1.000 ml).
-K2HPO4 5 mM en el tampn de trabajo: 12 x 3 ml (217,73 mg en 250 ml).
-NPP 1 mM en el tampn de trabajo: 12 x 25 ml (200 ml de NPP 1,5 mM en 300 ml).
-NPP 25 M en el tampn de trabajo: 12 x 25 ml (5 ml de NPP 1,5 mM en 300 ml).
-Pipetas automticas (12 de 1 ml y 12 de 200 l).
-12 gradillas.
-Tubos de ensayo (12 x 25).
-Baos (4).
-Relojes cronmetros (12).
-Colormetros (3).

TRIS-HCL 1 M ( pH 8): 121,14 g ---------(HCl 37 % y H2O)-------- 1 l .

TAMPON DE TRABAJO: 500 ml Tris-HCl 1 M (pH 8) --------- 5 l, conteniendo 1,02 g de
MgCl2.6H2O y 68,14 mg de ZnCl2.