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La medusa bioluminiscente Aequorea victoria provee una herramienta til para la biologa celular, una protena que
tiene la propiedad de emitir luz verde. La protena verde fluorescente (GFP, por sus siglas en ingls) ha sido modificada para emitir colores en muchas y diversas longitudes de onda. La GFP, junto con protenas derivadas de otros
organismos, ofrece nuevas variedades de protenas fluorescentes. Entre otras caractersticas que la hacen, sin duda,
especial, la protena fluorescente destaca por no necesitar intermediarios para su expresin en cualquier organismo
vivo, ser susceptible de modificacin para mejorar su intensidad, cambiar colores de emisin, construir quimeras
con otras protenas y servir de gen reportero, sensor bioqumico y medidor sensible de pH intra e intercelular, etc.
Desde su descubrimiento en 1962, la protena ha sufrido muchos cambios y sus aplicaciones involucran todas las
reas de la biologa. La neurociencia ha sido una de las ms beneficiadas por los mltiples usos de la GFP. Uno de
ellos ha sido marcar neuronas in vivo hasta con 90 colores fluorescentes, lo que ha permitido visualizar las redes de
la arquitectura neural de un mismo organismo de una manera sin precedentes. La presente revisin bibliogrfica
se enfoca en la descripcin de parte del descubrimiento de la protena GFP, as como de sus variantes, principales
aplicaciones y su actual utilizacin en la visualizacin de neuronas del sistema nervioso central.
Palabras clave
GFP, GFP supereclptica, GFP fotoactivable, aquorina
The bioluminiscent jelly fish Aequorea victoria provides a powerful tool to cell biology, a protein that fluoresces with the emission of green light. The green fluorescent protein (GFP) has been modified to emit in
many different wavelengths. The GFP, together with other proteins derived from different organisms, offers an immense variety of fluorescent proteins. This protein shows features that make it special; no other
factors are needed for its expression in any living organism, it can be modified to improve its intensity, to
change emission colors, to construct chimera with other proteins, it can also be used as a reporter gene,
biochemical sensor, sensitive intra and intercellular pH meter, etc. Since the discovery of the protein in
1962 it has experienced many changes and its applications extend to all areas in biology. Neuroscience is
one of the areas more benefited with the application of GFP. One of these applications involves the in vivo
labeling of neurons with multiple fluorescent colors which allow visualizing the neural network architecture
as never seen before, up to 90 different colors in a same organism. In the present work, we performed a
review that goes from the discovery of GFP, its variants, main applications and to its use in the visualization of neurons in the central nervous system.
Keywords
GFP, supereclptic GFP, fotoactivable GFP, aequorin.
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Introduccin
Historia de la GFP
La fluorescencia es la emisin de radiacin electromagntica en la regin visible por parte de una molcula o
tomo luego de la absorcin inicial de un fotn. (Chang,
2002). El descubrimiento de protenas que tienen capacidad fluorescente (protenas fluorescentes, en ingls, fluorescent proteins o FP), nativas de organismos acuticos
que poseen bioluminiscencia, ha sido una revolucin en
la biologa celular. Existen protenas fluorescentes naturales que emiten su fluorescencia en rangos de distintos
colores, como verde y rojo; ste ltimo proveniente del
coral Discosoma sp. (Shaner et al., 2003). Otras protenas
verdes fluorescentes se atribuyen a organismos como el
cnidario Renilla reniformis (Ward et al., 1979; Loening et
al., 2007).
Sin embargo, la protena proveniente de la medusa
Aequorea victoria, que han denominado protena verde
fluorescente nativa (Green Fluorescent Protein, GFP,
por sus siglas en ingls), ha sido la que ms impacto
dentro de la comunidad cientfica ha tenido; de hecho,
en octubre de 2008, los investigadores Osamu Shimomura, Martin Chalfie y Roger Tsien fueron galardonados con el Premio Nobel de Qumica por sus trabajos
con la protena verde fluorescente. El descubrimiento
tuvo gran impacto cuando se observ que la GFP conservaba su propiedad fluorescente incluso dentro de organismos distintos al de la medusa, lo que representaba
una gran ventaja respecto a otros tipos celulares (Chalfie
et al., 1994; Shaner et al., 2007).
En la biologa celular, estas protenas permiten obtener
datos sobre localizacin, dinmica y redes de interaccin
molecular con otras protenas de gran resolucin temporal y espacial (Tsien, 1998). A estas protenas se les
considera marcadores de localizacin (genes reporteros)
porque permiten el monitoreo de los cambios bioqumicos dentro y entre las clulas, o de cualquier otro fenmeno dinmico que se desee observar sin necesidad
de tincin o fijacin de la clula. Para la neurociencia es
relevante, entre muchas otras razones, porque favorece
el estudio de las redes neuronales y de las conexiones
sinpticas in vivo.
El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar una
breve historia de la protena verde fluorescente y describir algunas de sus aplicaciones, especialmente las utilizadas para visualizar clulas del sistema nervioso.
Caractersticas de la GFP
La protena verde fluorescente presenta dos picos de
excitacin: el primero, cercano a los 395 nm; el segundo, de 475 nm, y tambin dos picos de emisin: si es
excitada a los 395 nm su pico de emisin ser a los 508
nm, y si, por el contrario, es excitada a 475 nm, entonces
la emisin ocurrir a 503 nm (Tsien, 1998), cuando esto
ocurre la protena capta mayor luz fuera del espectro vi-
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FIGURA
1. Secuencia aminoacdica de la GFP nativa. Los aminocidos
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subrayados son los que conforman el cromforo
(Tomado de Prasher et al., 1992).
La estructura terciaria de la protena consiste en un barril beta de 40 , formado por once hojas antiparalelas,
acompaadas de una hlice con el cromforo al centro
de dicha estructura, tal como se muestra en la Figura 2
(Ormo et al., 1996).
La GFP presenta un cromforo p-hidroxibenzilideneimidazolinona (Prasher et al., 1992), sujeto a la hlice
dentro del barril. Dicho cromforo se forma por la ciclizacin espontnea y la oxidacin de los residuos 65
67, correspondientes a los aminocidos Ser 65 Tyr 66
Gly 67 (subrayados en la figura 1) de la protena nativa,
y es el responsable de la emisin de luz verde. Las series de residuos de aminocidos estn acompaados de
grupos polares que propician la presencia de molculas
de agua, adyacentes al cromforo (Heim et al., 1994). La
sntesis del cromforo comienza con el plegamiento de
la protena en su conformacin inicial y la formacin de
imidazolina por un ataque nucleoflico del grupo amino
de Gly-67 sobre el carbonilo del residuo 65, para producir deshidratacin. Al final, el oxgeno molecular quita
el hidrgeno del enlace C-C del residuo Tyr 66 y crea
un anillo fenlico con el imadazlico, el cual producir
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Aequorea victoria no requera sustratos exgenos ni cofactores para producir fluorescencia. El trabajo de Chalfie y su equipo fue, adems, el primero atribuir a esta
protena la cualidad de marcador gentico y localizador
de protenas en organismos vivos (Chalfie et al., 1994).
Variantes de la GFP
Se conocen decenas de protenas mutadas derivadas de
la GFP de Aequorea victoria (nativa), cuyas alteraciones
producen propiedades fsico-qumicas distintas a la original, y en las cuales se ha mejorado su expresin (mayor fluorescencia, cambios en el rango de excitacin y
emisin; cintica de oxidacin del cromforo, fotoestabilidad, etc), pero sin modificar el comportamiento general de la protena (Knee et al., 1998). La clasificacin
de las variantes de la GFP son diversas porque toman en
cuenta distintas caractersticas, como la estructura del
cromforo (Zacharias et al., 2006), el rango de emisiones
en el espectro visible (Sharner et al., 2007) y las aplicaciones como sondas intracelulares (Miyawaki, 2003).
La creacin de estas mutantes fue originada por la necesidad de frenar la tendencia de la protena a dimerizar,
porque esa propensin limitaba sus aplicaciones in vivo
(Fernandez et al., 2006). De esta manera, la GFP nativa
fue modificada para obtener variantes con emisin en
diferentes rangos espectrales y estabilidad en la forma
cuaternaria de la protena (Heim 1994; Ormo, 1996). A
continuacin se mencionan las mutantes ms importantes y, en el Anexo 1, se muestra un cuadro resumen.
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protenas. Esta capacidad se ha denominado Transferencia de energa de resonancia fluorescente (del ingls,
Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET. Zaccolo, 2004). El FRET es un fenmeno mecnico cuntico
que ocurre cuando existe transferencia de energa entre
dos fluorforos prximos, generalmente a distancias
menores de 100 , y el espectro de emisin de uno, el
fluorforo donador, se superpone con la emisin del
segundo, que acta como receptor. De esta manera, la
excitacin del donador produce la emisin del receptor
con la transferencia de energa (Tsien, 1998), y la fluorescencia del donador (molcula excitada) disminuye,
mientras que la del receptor aumenta (Takanishi et al.,
2006). Otros autores proponen que la distancia para que
se produzca la transferencia de energa puede variar entre 2 a 6 nm, si los dos cromforos estn adecuadamente
orientados en el espacio con una eficiencia mayor al 30%
(Zaccolo, 2004).
La eficiencia de esta tcnica del FRET va a depender de
la diferencia de energa entre los fluorforos donante y
receptor, lo que implica que la velocidad de la transferencia de energa es proporcional al solapamiento entre el
espectro de emisin del donante y el espectro de absorcin del receptor (Fernandez et al., 2006). Al medirlo, la
eficiencia de la transferencia de energa es inversamente
proporcional a la sexta potencia de la distancia entre los
dos fluorforos (Takanishi et al., 2006).
Los primeros pares de fluorforos usados para estudiar
la transferencia de energa entre protenas pertenecen a
las familias de las GFP y a las de BFP; sin embargo, las
BFP tienen poca duracin ya que presentan blanqueamiento (Zaccolo, 2004). Actualmente, la pareja que presenta mayores ventajas para este tipo de anlisis son las
mutantes de las familias de las CFP y las YFP, mucho
ms estables que las BFP (Heim et al., 1994).
La fuerte dependencia con la distancia y la ventaja que
presenta el poder utilizar el sistema de medicin en organismos in vivo y en tiempo real han hecho de FRET
una herramienta muy til en estudios biolgicos de
proximidad molecular y de cambios conformacionales
(Takanishi et al., 2006). Tambin ofrece una alta resolucin temporal y espacial en el seguimiento de la interaccin protena-protena, en cualquier lugar de la clula,
y la cuantificacin del grado de disociacin o de asociacin in situ (Tsien, 1998). Entre las desventajas, podemos
mencionar la necesidad de la correcta orientacin espacial de los fluorforos para que sea eficiente la transferencia de energa, y la necesidad de controles positivos y
negativos (Tsien, 1998).
Para cuantificar FRET se han descrito varias estrategias.
mtodos cuantitativos o cualitativos de FRAP. Si se desea determinar el coeficiente de difusin de la protena, la cantidad de movimiento aleatorio de la molculas
no blanqueadas, la capacidad de recuperacin molecular en una fraccin determinada o la viscosidad del
microambiente en donde est la protena se utilizan los
mtodos cuantitativos de FRAP; pero si lo que se desea
observar es el proceso de difusin de la protena en una
nica clula, o si la protena de inters es parte de un
gran complejo proteico, se utilizan los mtodos cualitativos, que requieren imgenes de alta calidad. (Snapp et
al., 2003)
La tcnica del FLIP (del ingls, Fluorescence Loss In
Photobleaching) est estrechamente relacionada con el
FRAP, con la diferencia que FLIP sigue la ruta del fluorforo fotoblanqueado, mientras que el FRAP sigue la
recuperacin de la fluorescencia en la regin fotoblanqueada. Esta tcnica puede ser utilizada para examinar
el movimiento o difusin de molculas dentro de las
clulas o membranas. Tpicamente, una membrana celular est marcada con un marcador fluorescente (puede ser expresin de una protena de fusin con GFP),
y un rea especfica de la membrana es fotoblanqueada con el lser del microscopio confocal. La intensidad
de la fluorescencia de esa regin se mide a lo largo del
tiempo. Ocurre un movimiento de molculas fluorescentes dentro del rea fotoblanqueada, la cual restaura
lentamente la fluorescencia en dicha rea mientras se
extingue la fluorescencia en otras regiones. En estas ltimas regiones se calcula la prdida de fluorescencia a
lo largo del tiempo, a travs de la medicin de la intensidad de fluorescencia (Lippincott-Schwartz et al., 2001).
Esta tcnica revela principalmente las conexiones entre
diferentes regiones y compartimentos celulares y el estudio de flujo proteico entre ellos (Snapp, 2003). Para los
anlisis con FLIP es necesario obtener imgenes antes
e inmediatamente despus del primer blanqueado, y as
sucesivamente con los blanqueados posteriores, hasta
que desaparece la fluorescencia (Snapp et al., 2003).
Por ltimo, en iFRAP (FRAP inversa) toda la regin de
fluorescencia, por lo general toda la clula, excepto la
zona de inters, es blanqueada. En las imgenes postblanqueamiento se mide la disminucin de la fluorescencia de la regin no blanqueada (Goldman et al.,
2004).
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Desde hace ms de un siglo, el estudio del sistema nervioso ha atrado a un gran nmero de investigadores
ansiosos de dilucidar su arquitectura y dinmica, para
lo cual se hizo necesario poder visualizar la disposicin
de las neuronas. Hasta finales del siglo XIX no existan
tcnicas que lo permitieran. Golgi plante entonces la
tcnica reazione nera (reaccin negra), que permiti
observar por primera vez una preparacin histolgica del Sistema Nervioso al teir varias clulas a la vez.
Luego, Santiago Ramn y Cajal, al utilizar esta tcnica
y otras que desarroll en sus estudios, dilucid la teora
de la conexin nerviosa y descubri que la neurona es la
unidad anatmico-funcional del sistema nervioso, teora
que an es vlida en nuestros das. Otras tcnicas que
desarroll fueron la tincin de las clulas del sistema
nervioso con azul de metileno y con plata, que tuvo mayor acogida que la realizada con azul. (Cajal, 1907 citado
por Jones, 2007).
Aunque estas tcnicas de tincin fueron muy tiles, la
informacin obtenida resultaba bastante limitada. Con
la llegada de las FP, algunos investigadores comenzaron
a marcar neuronas de diversas formas, con el fin de estudiar la arquitectura del SNC con ms detalle, e incluso
lograron obtener imgenes de clulas in vivo (Niel et al.,
2004). Dentro de las estrategias de marcado, se encuentran aquellas que involucran la expresin permanente
de protenas fluorescentes en mamferos, con la construccin de animales quimricos. Entre los mamferos,
el ratn es el que se ha usado de manera ms extensiva
como modelo experimental, debido a que sus genes son
homologables a los de los humanos, y porque los ratones representan un organismo nico como modelo para
el estudio de la organognesis, inmunologa, neurobiologa y reproduccin (Branda et al., 2004).
En el ao 2000, un grupo de investigadores (entre ellos
Feng, Mellor, Berstein, entre otros) logr marcar selectivamente, con varias protenas fluorescentes, neuronas
en el ratn. Posteriormente, generaron ratones transgnicos que expresaban GFP, RFP, YFP y CFP, y con ello
alcanzaron a etiquetar la totalidad de la morfologa de
algunas neuronas, como los axones, y de las terminaciones nerviosas, dendritas y espinas dendrticas. Estos
investigadores lograron que cada una de las variantes
de las FP mencionadas se expresara en neuronas in vivo
y demostraron que la expresin de todas estas protenas fluorescentes no afecta la funcin de la neurona ni
presenta toxicidad en las estructuras sinpticas. Consi-
FIGURA 6. Doble marcaje de PF en un mismo ratn transgnico. Izq.: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) provenientes del cruce entre ratones thy1-GFP y thy1-RFP. Centro: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) que expresan thy1-CFP con thy1-YFP. Der.: Neuronas de la corteza (SNC)
provenientes del cruce entre ratones thy1-GFP y thy1-RFP (Tomado de Feng et al., 2000).
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genticos de mosaico, Zong y otros colaboradores generaron y marcaron, por recombinacin de cromosomas
homlogos de clulas somticas de ratn, a las clulas
progenitoras de los grnulos cerebelares de la capa molecular de la corteza cerebelar. Con una, dos y hasta tres
protenas fluorescentes lograron marcar diferencialmente parte del sistema nervioso de los ratones genticamente modificados. Estos investigadores modificaron
un sistema de gen knockout condicional al utilizar la
estrategia Cre loxP (Zong et al., 2005). A esta modificacin metodolgica la denominaron MADM (Anlisis de
mosaico con marcadores doble) y bsicamente consisti en introducir dos genes quimricos, cada uno conteniendo el extremo N terminal de un marcador (GFP,
color verde) y el C Terminal del otro marcador (ds Red,
rojo), interrumpidos por un intrn conteniendo el sitio
loxP. De esta manera es posible obtener los dos colores
en las neuronas de los ratones.
La estrategia Cre-loxP, que permite inactivar genes diana en tipos especficos de clulas somticas, o en momentos particulares de su desarrollo, consiste en la aplicacin de la enzima llamada Cre en sitios especficos del
FIGURA 7. Izquierda. Corte sagital de cerebro de ratn adulto que muestra la expresin de la GFP uniforme (1mm). Centro. Corteza cerebral de ratn
adulto que muestra distincin entre neuronas verdes, rojas y con el doble coloreado (50 m). Derecha. Grupo de clulas de los grnulos cerebelares que
expresan la GFP y la RFP, pero no su combinacin (100 m). (Tomado de Zong et al., 2005)
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Conclusiones y Perspectivas
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FIGURA 10. Expresin de Brainbow 1.1 en astrocitos.
- Para expresar GFP no es necesaria la accin de cofactores de la medusa A. victoria. Con tan slo oxgeno (necesario para sintetizar el cromforo) se puede expresar
esta protena en cualquier organismo eucarionte o procarionte.
- La GFP est formada por 238 aminocidos y posee un
cromforo constituido por 3 residuos aminoacdicos. Su
estructura cuaternaria es de barril b.
- Se crearon variantes (modificadas por unos pocos aminocidos) que logran expresar longitud de ondas diferentes y que proporcionan as varios tonos de fluorescencia y caractersticas en su intensidad (fotoactivable)
y sensibilidad al pH (pHluorins).
- Una de sus grandes ventajas es que la GFP no presenta toxicidad para la clula y permite su observacin con
una mnima alteracin del sistema in vivo.
- Aplicado a la microscopa de fluorescencia, la GFP y
sus variantes pueden ser utilizadas en tcnicas como
FRET, FRAP, FLIM y FLIP.
- En su aplicacin a estudios en el Sistema Nervioso, tcnicas como Brainbow pueden utilizarse para descifrar el
diagrama de conexiones del sistema nervioso, no slo en
personas sanas, sino tambin en enfermas, pues es til
para observar los cambios anatmicos y fisiolgicos que
sufre el cerebro en estados de enfermedad.
Sin duda, las PF tienen un amplio futuro como indicadores lumnicos que permiten aplicar sus potenciales
fotoqumicos a la biologa celular, estructural, medicina, diagnstico, embriologa, biotecnologa, botnica y
muchas otras reas de la ciencia. A pesar de que son
muchos los investigadores que estudian y utilizan estas
protenas actualmente, podramos afirmar, sin temor a
equivocarnos, que son muchas las aplicaciones que an
no se han descubierto, pero que en un futuro prximo
nos sorprendern.
Referencias Bibliogrficas
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Editado por John Willey y Sons, Inc.
33. Tsien R.Y. (1998). The Green Fluorescent Protein. Annual Reviews Biochemistry. 67: 509-544.
Anexo 1
TABLA I. Se muestra la clasificacin por familias de las variantes derivadas de GFP de Aequorea Victoria. Tomado y modificado de Tsien 1998
y Sharnet et al., 2007.
Nombre
comn
Segn la
Color de
Pico de
Pico de
estructura fluorescencia excitacin
emisin
del
en el
(nm)
(nm)
cromforo
espectro
GFP nativa Clase I:
Verde
Presenta 2 508 / 503
Equilibrio
picos
fenol395-397/
fenolato
475
EGFP
Verde
488
507-509
clase III:
Verde
Fenol en el
cromforo
399
511
EYFP /
Topaz
Clase IV:
Fenolato
en sistema
electrnico
! apilado
amarillo
508-512
518-529
ECFP
Clase V:
Indol en el
cromforo
Turquesa
(Cyan)
434-452
476-505
380-384
440-448
H9
Clase II:
Cromforo
fenolato
Ventajas / Desventajas
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