Historia del CRISPR/Cas9

El sistema CRISPR/Cas9 es un mecanismo de defensa adaptativa utilizado por Archea y bacterias

para
degradar
material
gentico
extrao. En estos organismos, el
material gentico extrao de un
bacterifago es integrado en el loci
CRISPR (1,2). Este nuevo material,
tambin conocido como espaciador,
genera un fragmento de secuencia
especifica que ser utilizado como
resistencia contra futuras infecciones del
bacterifago. Estos fragmentos de
secuencia especifica se traducen en
CRISPR ARNs cortos (crRNAs) y
funcionan como gua para dirigir la
excisin
del
ADN
invasor
complementario, mediante actividad
nucleasa de la protena CRISPRasociada (Cas) codificada tambin en el
loci CRISPR (1,2). La nucleasea Cas9
del sistema CRISPR tipo II tiene un
dominio de unin al ARN, y un lbulo
hlice alfa (REC), un lbulo de nucleasa
que incluye, RuvC y HNH para la
escisin del ADN y un motivo adyacente
protospacer (PAM) que interacta con
(1,2). crARN forma un complejo con la
nucleasa Cas9 mediante unin de la
hlice alpha con el Lbulo REC y genera
mltiples puentes con la columna de
crARN (1,2,3).
Tras la unin de crRNA a Cas9 la
conformacin de la nucleasa Cas9 se
modifica generando un canal que
permite la unin al ADN (% link_1%,%
link_2%,%
link_3%).
El
complejo
Cas9 / crRNA analiza el ADN en busca
de un motivo PAM (5'-NGG) (%
link_4%,% link_5%,% link_6%). El
reconocimiento de un motivo de PAM
induce un desenrollamiento del ADN que
permite al crRNA buscar el ADN
complementario adyacente al motivo PAM. Cuando Cas9 se une a un motivo PAM adyacente a
una secuencia de ADN complementaria a la de crRNA, la hlice puente dentro del lbulo REC
crea un heterodplex de ARN-ADN con el ADN diana (% link_3%,% link_4%,% link_7%). El
reconocimiento del sitio PAM est implicado en la activacin de los dominios HNH y RuvC lo que
produce la rotura de la doble cadena (DSB) del ADN diana, esto lleva a la degradacin del ADN
(% link_1%,% link_2%,% link_5%,% link_8%) . Si el crRNA no es complementario, Cas9 se
libera y busca otro sitio PAM (% link_7%). La rotura del ADN diana pueden ser reparado
mediante el mecanismo conocido como Recombinacin no homloga (NHEJ), que introduce o
elimina nucletidos, generando errores, o a travs de Recombinacin homloga (HDR), que
puede ser utilizado para introducir marcadores en sitios especficos del genoma (% link_2%,%
link_9%,% link_10%). Este mecanismo CRISPR /Cas9 puede ser utilizado en ingeniera
genmica de varios sistemas, incluyendo las clulas de mamferos.

Modificaciones en el Genoma tras la rotura de la doble cadena (DSBs) pueden realizarse con
meganucleasas, Nucleasas con dedos
de Zinc (ZF) transactivator-like
effectors (TALEs), que reconocen
secuencias de ADN, sin embargo
cada uno tiene sus limitaciones. Las
meganucleasas no permiten un
reconocimiento
especifico
entre
nucleasas y ADN (2). Las otras dos
opciones, ZFs y TALEs, son difciles
de disear y reconocen un mximo
de 3 nucletidos de ADN (2). Las
guias de ARN de una cadena
(sgRNAs) que actan como crRNAs
son fciles de disear y pueden
expresarse junto con la nucleasa
Cas9 en un mismo vector para hacer
diana en secuencias especificas del
ADN y realizar las modificaciones del
genoma. El sistema CRISPR/ Cas 9
tiene adems mayor sensibilidad y es
ms eficiente cuando se usa para
detectar pequeas horquillas de ARN.
A significant advantage of using the
CRISPR/Cas9 system to induce DSB
in genomic DNA is its high level of
efficiency. However, this efficiency
can be clouded by a number of offtarget effects, thereby reducing the
specificity of CRISPR/Cas9 editing.
Specificity can be improved by using
a CRISPR double nickase system,
whereby a pair of plasmids, each
encoding a Cas9 (D10A) nickase
mutant (Cas9n) are directed to a
distinct, site specific region in the
genomic DNA by a target-specific
guide RNA (12). Each Cas9n/sgRNA
complex creates only one nick in the
DNA strand that is complementary to
the guide RNA (12). Each pair of
guide
RNAs
are
offset
by
approximately 20 bp and recognize
target sequences located on opposite
strands of the target DNA. The
double nick created by the pair of
Cas9n/sgRNA complexes mimics a
DSB (12). Thus, the use of paired-guide RNAs allows for increased specificity of Cas9-mediated
gene editing, while maintaining a high level of efficiency (12).
In addition to genome editing, the CRISPR system has been engineered to allow for robust
activation of endogenous gene expression (13). Several components of the CRISPR system have
been modified to generate the synergistic activation mediator (SAM) complex that results in a
highly efficient and specific transcription activation system (13). One component of the SAM
complex that is modified is the Cas9 nuclease. In the SAM system, the catalytic domains of Cas9
have been deactivated and the resulting dCas9 is fused to a transcription activation domain
(VP64). Directed by a target specific guide RNA (sgRNA), the dCas9-VP64-sgRNA complex

targets the -200 bp region from the Transcriptional Start Site (TSS) of endogenous genes to
upregulate gene expression (13). To further enhance transcription, the sgRNA has been modified
by appending a minimal hairpin aptamer to the tetraloop and stem loop 2 (13). This aptamer on
the sgRNA selectively binds dimerized MS2 bacteriophage coat proteins (13). Fusing the MS2
proteins to p65 and HSF1 transactivation domains allows the resulting MS2-P65-HSF1 fusion
protein to enhance the recruitment of transcription factors, thereby improving the potency of
dCas9-mediated gene activation (13). Activation products are supplied as both standard
plasmids for transfection and lentiviral plasmids for lentiviral packaging and transduction, for
efficient delivery of the SAM Transcription Activation System into all cell types (13).

Plsmido CRISPR/Cas9

Detalles de productos CRISPR/Cas9:

20 g, hasta 20 transfecciones

Plsmidos para Knockout (KO)

CRISPR/Cas9 consisten en un
conjunto de tres plsmidos con la
nucleasa Cas9 y una guia de ARN
de
20
nucletidos
(gRNA)
diseados
para
una
mxima
eficiencia del Knockout

Las secuencias del gRNA provienen

de la biblioteca genmica GeCKO
(v2) y dirigen a la protena Cas9
para producir la rotura de la doble
cadena (DSB) en el ADN genmico
(11)

KO Plsmidos CRISPR/Cas9 se
encuentran disponibles para genes
humanos (h) y de ratn (m).
Ejemplo de nomenclatura: p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (h) para humano o p53
CRISPR/Cas9 KO Plasmids (m) para ratnCRISPR / plsmidos Cas9 KO disponibles para
los genes humanos y de ratn se indican con el (h) o (m) la designacin en el nombre
del producto. Ejemplo:CRISPR p53 / Cas9 KO plsmidos (h) para el hombre o CRISPR
p53 / Cas9 KO plsmidos (m) para ratn

Proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccin

Productos Complementarios para plsmidos CRISPR/Cas9

Hay disponibles adecuados anticuerpos control

Reactivo de Transfeccin Ultracruz, sc-395739

Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN, sc-108062

Plsmido control CRISPR/Cas9, sc-418922

Plsmidos HDR

Descripcin
HDR:

de

los

Plsmidos

de

El plsmido HDR proporciona

una plantilla especfica para
la reparacin del ADN tras la
DSB.

Cuando se co- transfecta con

el plsmido CRISPR/ Cas 9,
el plsmido HDR incorpora el
gen
de
resistencia
a
Puromicina para seleccionar
las clulas en las que la
escisin de AND inducido por
Cas9 ha tenido lugar.

Detalles de productos HDR:

20
g,
transfecciones

Plsmido HDR especficos de

diana se recomiendan para la
cotransfeccin
con
Plsmido CRISPR/ Cas9 para
el mismo gen y la misma
especie

HDR Plasmid consists of a

pool of 2-3 plasmids, each
containing
a
homologydirected DNA repair (HDR)
template corresponding to
the cut sites generated by
the
corresponding
CRISPR/Cas9 KO Plasmids

Cada plantilla HDR contiene dos brazos homlogos de 800 pares de bases diseados
para unirse especficamente al ADN genmico que acompaa el sitio de ruptura de la
doble cadena de ADN, inducida por Cas 9

Cada plsmido HDR inserta un gen de resistencia a puromicina para permitir la seleccin
de clulas con un knockout (KO).

Cada gen de resistencia a puromicina esta flanqueado por dos sitos LoxP que permiten
un posterior procesamiento con el vector Cre

hasta

20

Cada plsmido HDR contiene tambin RFP para una confirmacin por visualizacin de la
transfeccin.

Proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccin

Productos Complementarios para plsmidos HDR:

Reactivo de Transfeccin Ultracruz, sc-395739

Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN, sc-108062

Dihidrocloruro de puromicina: sc-108071

L-755,507, sc-204045

Expresin Allica

Clulas duploides tienen dos copias de un

cromosoma, dos copias de cada gen. Estas dos
formas el mismo gen, que no tienen que ser
idnticas, se denominan alelos y en cada locus
especfico del cromosoma, un individuo posee dos
alelos para el mismo gen. En una poblacin, un
alelo ocurre con mayor frecuencia y se denomina
por ello alelo dominante (wild type) y es
generalmente responsable del genotipo wild type.
Mutaciones pueden generar nuevos alelos y cada
alelo genera un nuevo fenotipo.
Como las clulas diploides contiene dos a lelos
para la mayora de los genes, rondas adicionales
de trasfeccin y seleccin pueden ser necesarias
por a obtener un Knock Out del gen diana, para
producir un Knockout homozigtico en la poblacin
de
clulas.
Utilizando
slo
el
Plsmido
CRISPR/Cas9 se produce reparacin no homloga,
Realizar un Western Blot tras la transfeccin con el
Plsmido KO CRISPR/Cas 9 es una manera de
determinar si se ha efectuado un corte bi-allico o
mono-allico en la poblacin de clulas. Aislando
clulas individuales obtendremos colonias biallicas o mono-allicas. Una vez que estas
poblaciones se encuentran en una confluencia
adecuada, un Western Blot puede mostrar qu
colonias tiene un knockot y cuales un knockdown.
Una poblacin con una edicin bi-allica no
poseer la protena de inters, mientras que una
poblacin con una edicin mono-allica mostrar
una reduccin en la cantidad de protena.
La co-transfeccin exitosa de un Plsmido especfico de CRISPR/Cas9 con el Plsmido HDR
(Reparacin Homloga) dar lugar a la interrupcin gnica dirigida y la reparacin homloga
(HDR) del gen diana. Despus de cotransfectar, han de seleccionarse las clulas que han sido
modificadas con xito con el gen de puromicina. Esta seleccin permitir tambin la seleccin de
una poblacin mixta, mono-allica y bi-allica. El Western Blot ser til para mostrar qu
colonias muestras una knockout bi-allico.

Vectores Cre

Descripcin Vector Cre:

El Vector Cre expresa la recombinasa

Cre, una enzima p1 de bacterifagos
que
cataliza
la
recombinacin
especifica de ADN entre dos sitios
LoxP

Cuando
el
Knockout
Plsmido
CRISPR/Cas9 se co- transfecta con el
plsmido HDR, las clulas que
contienen el ADN modificado pueden
seleccionarse utilizando el marcador
de seleccin insertado durante la
reparacin
por
recombinacin
homologa.

Tras la seleccin, las clulas pueden

transfectarse con el Vector Cre para
eliminar el material gentico incluido
durante la recombinacin homologa,
gen de resistencia a la puromicina

Detalles de productos Vector Cre:

20 g, hasta 20 transfecciones

Recomendado para la reparacin del

ADN y la seleccin de clulas modificadas satisfactoriamente por el KO plsmido
CRISPR/Cas9 y Plsmido HDR

El Vector Cre contiene un promotor CMV para iniciar la expresin de la recombinasa Cre

proporcionado como un plsmido purificado de ADN listo para la transfeccin

Vector Cre, sc-418923

Productos complementarios para Vector Cre:

Reactivo de Transfeccin Ultracruz, sc-395739

Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN, sc-108062

Double Nickase Plasmids

Double Nickase Plasmid product details:

20 g, hasta 20 transfecciones

Double Nickase Plasmids consist

of a pair of plasmids each
encoding a D10A mutated Cas9
nuclease and a target-specific
20 nt guide RNA (gRNA)
designed to knockout gene
expression
with
greater
specificity than its CRISPR/Cas9
KO counterpart

Paired gRNA sequences are

offset by approximately 20 bp
to allow for specific Cas9mediated double nicking of the
genomic DNA, which mimics a
DSB

One plasmid in the pair contains

a puromycin-resistance gene for
selection; the other plasmid in
the pair contains a GFP marker
to visually confirm transfection

Double Nickase Plasmids available for human and mouse genes are indicated by the (h)
or (m) designation in the product name. Example: p53 Double Nickase Plasmid (h) for
human or p53 Double Nickase
Plasmid (m) for mouse

Proporcionado como un plsmido

purificado de ADN listo para la
transfeccin

Support Products
Plasmids:

for

Double

Nickase

Hay
disponibles
anticuerpos control

Reactivo
de
Transfeccin
Ultracruz, sc-395739

Medio para Plsmidos de Transfeccin de shARN, sc-108062

Control Double Nickase Plasmid, sc-437281

Dihidrocloruro de puromicina: sc-108071

adecuados

Plsmidos Activadores

Detalles
de
productos
Activador CRISPR/dCas9:

Psmido

20
g,
transfecciones

Los Plsmidos Activadores

CRISPR/dCas9 son sistemas
mediadores
de
activacin
sinrgica (SAM), sistema de
activacin de la transcripcin
diseado
para
incremetar
especficamente la expresin
gnica.

Plsmidos
Activadores
CRISPR/Cas 9 incluyen los
siguientes tres plsmidos, con
un radio 1:1:1 : plsmido
codificador de la nucleasa Cas 9 desactivada, (D10A y H840A) fusionadas al dominio de
transactivacin VP64,; plsmido codificador de la protena de fusin MS2-p65-HSF1 y un
plsmido que codifica la
secuencia de diana especfica
de 20 nt de ARN.

Las secuencias de gRNA que

se encuentran en el complejo
mediador
de
activacin
sinrgica (SAM) CRISPR/Cas 9
proceden
de
bibliotecas
humanas
y
dirigen
el
complejo SAM para que se
una
a
lugares
que
se
encuentran a 200 -250 nt
aguas arriba del inicio de la
transcripcin del gen diana.

El sistema SAM proporciona

un reclutamiento robusto de
factores de transcripcin para
la activacin altamente eficiente del gen diana.

hasta

20

CRISPR/dCas9 Activation Plasmids

available for human and mouse
genes are indicated by the (h) or
(m) designation in the product
name.
Example: p53
CRISPR/dCas9 Activation Plasmid
(h) for
human
or p53
CRISPR/dCas9 Activation Plasmid
(m) for mouse

Proporcionado
como
un
plsmido purificado de ADN
listo para la transfeccin.

Support
Products
Activation Plasmids:

for

CRISPR

Hay disponibles adecuados

anticuerpos control

Reactivo
de
Transfeccin
Ultracruz, sc-395739

Medio para Plsmidos de

Transfeccin de shARN, sc108062

Plsmido
control
activador
CRISPR/dCas9, sc-437275

Blasticidin S HCl solution, sc495389

Hygromycin B, sc-29067

Zeocin Selection Reagent, sc-496345

Lentiviral Activation Particles

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles product details:

Lentiviral Activation Particles encode a synergistic activation mediator (SAM)

transcription activation system designed to specifically and efficiently upregulate gene
expression via lentiviral transduction of cells (13)

The SAM complex binds to a site-specific region approximately 200-250 nt upstream of

the transcriptional start site and provides robust recruitment of transcription factors for
highly efficient gene activation

Lentiviral Activation Particles are supplied as 200 l of transduction-ready viral particles

containing the critical elements, present in the three CRISPR/dCas9 Activation plasmids,
that are required for targeted gene upregulation:
1.

Deactivated Cas9 (dCas9) nuclease (D10A and N863A)

transactivation domain VP64, and blasticidin resistance genes

fused

2.

MS2-p65-HSF1 fusion protein, and hygromycin resistance genes

3.

Target-specific 20 nt. guide RNA, and a puromycin resistance gene

to

the

Recommended for use with hard-to-transfect cells

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles are available for human and mouse genes,
indicated by the (h) or (m) designation in the product name. Example: p53 Lentiviral
Activation Particles (h) for human or p53 Lentiviral Activation Particles (m) for mouse

Support Products for CRISPR Lentiviral Activation Particles:

Control Lentiviral Activation Particles, sc-437282

Polybrene, sc-134220

Blasticidin S HCl solution, sc-495389

Hygromycin B, sc-29067

Dihidrocloruro de puromicina: sc-108071

Suitable control antibodies are available