PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO PARANA

ESCOLA DE CIENCIAS AGRARIAS E MEDICINA VETERINARIA

CURSO DE AGRONOMIA

JEFERSON R. GREMASCHI
TALLES MANCI
WALDECYR BORGES

RELATRIO DE AULAS PRTICAS

TOLEDO
2015

JEFERSON R. GREMASCHI
TALLES MANCI
WALDECYR BORGES

ISOLAMENTO, REPICAGEM E ARMAZENAMENTOS DE BACTRIAS

FITOPATGENICAS

Relatrio de aula prtica apresentado

disciplina de fitopatologia do curso de
agronomia da Pontifcia Universidade Catlica
do Paran.
Professor(a): FrancielleFiorentin Peters

TOLEDO
2015

INTRODUO
As bactrias so um importante grupo de patgenos que acometem
plantas como tubrculos, hortalias e frutas, que promovem graves enfermidades,
apresentam grande facilidade para disseminao e apresenta percalos para seu
controle (Romeiro, 2005). Determinadas regies do mundo apresentam ambientes
favorveis para o desenvolvimento e reproduo de bactrias que pode condicionar
ou mesmo inviabilizar a explorao econmica de determinadas culturas de
interesse agronmico. O Estados Unidos arcou com grande prejuzos na escala de
bilhes de dlares por causa de bactrias fitopatognicas (Romeiro, 2005).
O Brasil devido apresentar caractersticas de dimenses continentais como
diversos tipos de clima e solo variados, com inmeras plantas cultivadas de
interesse agronmico ou nativas, so potenciais hospedeiros para desenvolvimento
de bactrias fitognicas. Doenas estas que ocorrem sem ser identificada para
posterior afirmar que determinado patgeno acomete determinada planta, devido a
isso a identificao destas bactrias e importante para montagem de coleo de
culturas de fitobactrias no Brasil (Romeiro, 2005).
H um grande grupo de bactrias fitopatogenicas que acometem hortalias e
frutas, que so limitantes para o desenvolvimento e produo dessas culturas de
interesse. Neste grupo se encontra bactrias do gnero Pectobacterium(Erwinia),
que responsvel por desenvolver patologias como podrido mole, talo oco, e
canela preta j foram identificados em culturas como alface, alho, brcolos, cebola,
cenoura, chicria, couve, couve-chinesa, couve flor, nabo, pimento, tomateiro etc
(SILVA JUNIOR et al., 2007).
Como

uma

das caractersticas principais das bactrias

do

gnero

pectinolticas a produo de grandes quantidades de enzimas (KOTOUJANSKY,

1987; PROMBELON, 1972; KELMAN, 1995; PEROMBELON, 2002), como as
pectinases, celulases e proteases que causam o colapso da parede celular vegetal
liberando nutrientes para o crescimento da bactria (BARRAS et al., 1994;
PROMBELON, 2002).

O grande problema quanto s doenas bacterianas em hortalias sem

encontra no seu controle, pois de difcil manejo, atravs disso para ser fazer o
controle devem-se realizar mtodos combinados de controle como mtodo de
controle integrado que se inicia no plantio at a reprodutiva e comercializao do
produto final (LOPES & QUEZADO-SOARES (1997). Com isso o controle da Erwinia
ou podrido mole de difcil controle devido apresentar a grande capacidade de
adaptao a uma grande faixa de temperatura por longos perodos de tempo, se
desenvolve na gua presente no solo e em restos de culturas anteriores infectadas e
na rizosfera/filosfera de plantas cultivadas ou invasoras (DE BOER; KELMAN, 2001;
PROMBELON; VAN DER WOLF, 2002).

OBJETIVO
O presente estudo teve por objetivo:

Obter a partir de tecidos doentes do hospedeiro, cultura pura de

bactrias

fitognicas

aps

armazenamento

da

mesma

(preservao) utilizando leo mineral.

MATERIAS E MTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratrio de Fitopatologia, da Pontifcia
Universidade Catlica do Paran, Campus Toledo, PR.
Materiais utilizados foram esterilizados atravs da tcnica de flambagem,
utilizando lcool 70% e lamparina, utilizou-se autoclave para a morte pela
coagulao de protenas a 121 C por cerca de 10 a 15 minutos. Toda a banca assim
como mos e braos foram esterilizados com auxilio de lcool 70%, o material
infectado foi sendo lavado em torneira com gua corrente com auxlio de uma
esponja para limpeza do local e seco com papel toalha.
O material infectado utilizado foi manuseado aps a higienizao todo em
cmara de fluxo continuo. Equipamento este que tem por funo disponibilizar
ambiente protegido e estril pra que no ocorra contaminao do tecido por outro
agente patognico.
O processo de isolamento do agente patognico iniciou-se aps a lavagem e
higienizao do tecido contaminado, com auxilio de estilete e pina previamente
esterilizados, realizou-se os cortes de quatro partes do tecido contaminado de
pimento com ERWINIA colocando-os em soluo aquosa de lcool 70% por cerca
de 30 a 60 segundos, em seguida transferindo para uma soluo aquosa de
hipoclorito de sdio por cerca de 60 segundos para desinfeco do material. Em
seguida realizou-se a lavagem do tecido para retirada do excesso do material
desinfetante atravs do processo de 3 lavagens com gua destilada. Em uma placa
de Petri previamente esterilizada adicionou uma gota de gua destilada em seguida
depositou o material contaminado, com o auxilio de um escalpelo esterilizado
realizou-se a macerao do tecido e posteriormente semeados em uma superfcie

com meio de cultura BDA. O processo de semeadura procedeu-se por meio de

semeadura composta e simples.
Para realizao do processo se repicagem utilizou-se a cultura isolada e
desenvolvida, com uma ala de repicagem esterilizada retirou-se uma parte da
colnia desenvolvida e transferindo-a em um tudo de ensaio com soluo salina
(NaCL 0,85%) e agitando-se o tubo para homogeneizao da soluo juntamente
com a colnia desenvolvida. Novamente com o auxilio de uma ala de repicagem
esterilizada transferiu-se parte da soluo para uma placa de Petri com meio de
cultura.
Aps o isolamento, desenvolvimento e repicagem do patgeno, realizou-se o
armazenamento. Repicou-se a cultura desenvolvida e transferiu-se para o tudo
inclinado de armazenamento com meio de cultura (BDA) e posteriormente incubado
para desenvolvimento do patgeno. Aps o desenvolvimento da bactria adicionouse leo mineral cerca de 1 centmetro acima da rea de desenvolvimento da bactria
no meio de cultura, e posteriormente armazenar o material em geladeira para
conservao da cultura pura.

RESULTADOS E DISCUSSO
No processo de semeadura do patgeno em placa de petri com meio de
cultura, obteve-se na semeadura simples nenhum tipo de contaminao, teve-se um
bom desenvolvimento das bactrias, apenas faltou usar mais da placa no momento
da semeadura (figura 1). Na semeadura composta, as bactrias se desenvolveram
bem e sem contaminao, porm as estrias no ficaram bem definidas, ficaram mais
espalhadas na placa (figura 2).
Souza e figueiredo 2007 Essa tcnica de estria simples muito utilizada para
visualizao de determinadas propriedades metablicas, como a produo de
enzimas hidrolticas, e produo de pigmentos.
Silviano 2012 em um trabalho ao analisar os resultados das tcnicas de
purificao de espcie da estria simples, tcnica da estria composta concluiu que
houve separao em todas as tcnicas empregadas, porm no foi um isolamento
muito satisfatrio, j que as colnias formadas no foram continuas, mas as colnias
formadas so morfologicamente iguais possibilitando supor que a populao de
bactrias tenha se originado de uma mesma clula parental.

Figura 1. Semeadura simples.

Figura 2. Semeadura composta.

No processo de repicagem no ouve desenvolvimento do patgeno na placa
de petri, acredita-se que no foi esperado tempo necessrio para esfriar a ala de
repicagem quando flambada para fazer a repicagem, fazendo com que a
temperatura da mesma matasse os patgenos, e devido no ser feito em local
apropriado ouve uma contaminao por outra bactria. (figura 3).
Segundo Rachid 2008 quando uma populao de bactrias submetida ao
alto calor, suas protenas so desnaturadas. H fluidificao dos lpideos na
presena de calor. Ento os microorganismos so considerados mortos quando
perdem a sua capacidade de se multiplicar de forma irreversvel.

Figura 3. placa de repicagem.

No armazenamento obteve-se um grande desenvolvimento da bactria que

ocupou toda rea do meio de cultura BDA, isso se deu devido o tempo a mais que o
patgeno teve para se desenvolver j que ficou mais dias armazenado enquanto que
o certo seria ser armazenado por 3 e depois completar com leo mineral (figura 4).

Figura 4. Patgeno j armazenado.

CONCLUSO
Obtiveram bons resultados no desenvolvimento (semeadura) do patgeno,
portanto na repicagem os resultados no foram to satisfatrios, ms no atrapalhou
nos resultados de armazenamento, porque houve bom desenvolvimento do
patgeno no tubo inclinado com meio de cultura BDA.
Portanto obteve com sucesso cultura pura de bactrias fitognicas bem
armazenadas e propcias para serem usadas se necessrio posteriormente.

BIBLIOGRAFIAS
BARRAS, F.; VAN GIJSEGEM, F.; CHATTERJEE, A. K. Extacellularenzimes and
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PROMBELON, M. C. M. The extent and survival of contamination of potato stock in
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ROMEIRO, R.S. Bactrias fitopatognicas. Viosa: Imprensa Universitria/UFV,
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Disponvel

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UFF.
Apostila
de
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Disponvel
em:
<http://www.uff.br/labac/Apostila_Pratica_Nutricao.pdf>. Acesso em: 16 jun. 2015.

KOTOUJANSKY, A. Molecular genetics of pathogenesis by soft-rot Erwinia.Annual

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