INTRODUCCION

Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula, ellas

constituyen ms del 50% del peso seco de la clula. Cada tipo celular, tiene un
rol especfico determinado por su composicin proteica. Con la posibilidad de
que 20 (o 22) aminocidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden
para conformar polipptidos de cientos de aminocidos, tienen el extraordinario
potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformacin. Esta
variedad genera funciones tan refinadas como las de las enzimas que estn
involucradas en el metabolismo celular. Una bacteria puede tener cerca de
1000 protenas diferentes, en una clula humana puede haber ms de 10.000
clases de protenas distintas.
La composicin protica de las clulas en un determinado momento depende
del conjuntode genes que se estn activando y esto est relacionado
directamente con las seales que recibela clula, de su micro ambiente y de las
caractersticas celulares que le son propias. Es decir que el patrn proteico de
una clula vegetal ser distinto al de una clula animal, una clula heptica de
un ratn, ser distinta de una clula heptica de un humano, y a su vez una
clula heptica de ratn ser distinta a una neurona del mismo animal
La expresin de protenas puede estudiarse por ejemplo, mediante una
electroforesis en gel de poliacrilamida . Para esto es necesario extraer primero
las protenas a partir de las clulas que constituyen los tejidos u rganos.
Al momento de elegir el protocolo a seguir para obtener el extracto crudo, es
importante tener en cuenta tanto el material de partida como su posterior
utilizacin:
Material biologico de partida-tipo de organismo: En el caso de rganos u
otros tejidos animales, es necesario disgregarlos antes de proceder a la lisis
celular, ya que las clulas se encuentran rodeadas de tejido conectivo. En
general estas tcnicas involucran la utilizacin de enzimas (como por ejemplo
colagenasa) y/o una ruptura mecnica grosera. Para esto pueden utilizarse
morteros, homogeneizadores elctricos, tijeras o tamices metlicos (mesh),
entre otros.
Cuando el material es un cultivo celular, la extraccin puede realizarse
adicionando un detergente, realizando un shock osmtico, o por sonicacin.
Finalidad del extracto proteico: esto determinar el buffer de extraccin que se
utilizar dependiendo se desea o no que las protenas conserven su actividad
biolgica, su conformacin nativa, su interaccin con otras protenas u otras
molculas. Algunos protocolos son tan violentos que involucran la ruptura de
todas las membranas; otros en cambio permiten fraccionar y obtener, distintos
componentes subcelulares (ncleos, mitocondrias, etc).

La extraccin de protenas celulares comienza siempre con una ruptura celular

o lisis. Los mtodos ms utilizados se basan esencialmente en la
homogenizacin de los tejidos y la destruccin de los lmites celulares por
medio de diferentes procedimientos fsicos y/o qumicos. Obtenindose lo que
se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son
maximizar la liberacin de las protenas de inters, evitando la degradacin
trmica o las alteraciones secudarias por oxidacin, protelisis, etc. Se han
desarrollado una amplia gama de tcnicas de disrupcin celular, que se usan a
escala de laboratorio que se pueden clasificar como:
a) mtodos fsicos mecnicos: agitacin con abrasivos, homogeneizacin a alta
presin o extrusin por presin;
b) mtodos fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacin
descongelacin, sonicacin o secado
c) mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes, cidos o
sustancias caotrpicas
Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separacin y purificacin
de los componentes celulares.
Como primera medida, puede realizarse una centrifugacin diferencial para
obtener fracciones subcelulares o para aislar organelas especficas. En este
caso, las protenas asociadas a membrana quedarn en el pellet (precipitado
que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugacin) y las solubles en el
sobrenadante. En general, el extracto obtenido es sometido a tratamientos que
separan las protenas en diferentes fracciones basados en algunas ropiedades
tales como tamao o carga, proceso denominado fraccionamiento.
Las primeras fases en este proceso suelen utilizar diferencias en la solubilidad
de las protenas. Existen diversos factores que afectan esta solubilidad; en
particular, la composicin en aminocidos (una protena rica en aminocidos
polares es en general ms soluble que una rica en aminocidos hidrofbicos);
la estructura tridimensional (las protenas fibrosas son en general menos
solubles que las globulares) y el entorno de la propia protena.
Respecto a las condiciones del entorno de las protenas, los principales
factores que pueden afectar su solubilidad son la temperatura; la constante
dielctrica del medio; el pH del mismo; y la fuerza inica.
La precipitacin salina de las protenas es una tcnica en donde se logra la
precipitacin de una fraccin de protenas mediante el aumento de la fuerza
inica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a una solucin de
protenas, disminuye la interaccin protena-H2O porque quita la capa de
solvatacin, predominando la interaccin protena-protena y generando la
precipitacin de las mismas. La concentracin salina a la que se produce la

precipitacin no es igual para todas las protenas, lo que permite usar sta
propiedad para la separacin y purificacin de protenas particulares a partir de
mezclas complejas.
Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su
gran solubilidad (760 g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una
temperatura de 20C) y porque el in sulfato divalente permite alcanzar altas
fuerzas inicas. La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de
una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas.
La cantidad de protenas en la muestra analizada puede estimarse por diversos
mtodos.
La mayora de las protenas absorben a 280 nm, y a bajas concentraciones, lo hacen
de manera proporcional con su concentracin. Este es un mtodo rpido y sencillo
pero tiene la desventaja es que la muestra debe estar pura, ya que otras molculas
no-proteicas como el DNA, tambin absorben a esa longitud de onda. Por otro lado,
los ensayos colorimtricos involucran la adicin de una sustancia qumica que es
capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacdicos. El resultado de estas
reacciones es el cambio de color en la solucin, que es cuantificado mediante una
medida de absorbancia. En general, estos mtodos son ms sensibles que la
cuantificacin por absorbancia directa a 280 nm. Posteriormente, para determinar la
concentracin de protenas totales de la muestra a analizar los resultados de
absorbancia se interpola a un curva de calibracin construida utilizando una protena
estndar, por lo general albmina srica bovina (BSA bovine seric albumin), cuya
concentracin es conocida.
Los ensayos colorimtricos ms utilizados son:

Ensayo de Bradford (595nm): es uno de los ms sensibles. Es rpido y muy

sencillo y adems no presenta interferencia con sustancias reductoras como el
DTT y el -mercaptoetanol, que s interfieren con Los ensayos de Lowry y BCA.
La desventaja es que es altamente sensible a detergentes y lpidos.

Ensayo de Lowry (750 nm): se trata de una reaccin de redox con los enlaces
peptdicos y con los aminocidos Tyr, Trp y Cys. Es rpido, sencillo y
relativamente sensible. Como desventaja, es afectado por un amplio rango de
compuestos no proteicos como EDTA, sulfato de amonio, Tritn X-100. Sin
embargo existen variables que pueden realizarse para evitar estas
interferencias, que estn disponibles comercialmente.

Ensayo BCA (Bicinchoninine acid assay) (562nm): es ms sensible que

Lowry y puede realizarse en un amplio rango de temperaturas. Tambin es
sencillo, pero requiere de tiempos de incubacin un poco ms largos. Los
complejos coloreados son muy estables. Aunque es altamente susceptible a
interferencias, no interfiere con detergentes y lpidos.

DESARROLLO
PROTENA
Las protenas son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. El
nombre protena proviene de la palabra griega ("prota"), que significa "lo
primero" o del dios Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar.
Las protenas desempean un papel fundamental en los seres vivos y son las
biomolculas ms verstiles y ms diversas.
Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:

Estructural (colgeno y queratina)

Reguladora (insulina y hormona del crecimiento),
Transportadora (hemoglobina),
Defensiva (anticuerpos),
enzimtica (sacarasa y pepsina),
Contrctil (actina y miosina).

Las protenas de todo ser vivo estn determinadas mayoritariamente por su gentica
(con excepcin de algunos pptidos antimicrobianos de sntesis no ribosomal), es
decir, la informacin gentica determina en gran medida qu protenas tiene una
clula, un tejido y un organismo.
Las protenas se sintetizan dependiendo de cmo se encuentren regulados los genes
que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a seales o factores externos. El
conjunto de las protenas expresadas en una circunstancia determinada es
denominado proteosoma.
CARACTERSTICAS
Los prtidos o protenas son biopolmeros, es decir, estn constituidas por gran
nmero de unidades estructurales simples repetitivas (monmeros). Debido a su gran
tamao, cuando estas molculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman
siempre dispersiones coloidales, con caractersticas que las diferencian de las
disoluciones de molculas ms pequeas.
Por hidrlisis, las molculas de protena se escinden en numerosos compuestos
relativamente simples, de masa molecular pequea, que son las unidades
fundamentales constituyentes de la macromolcula. Estas unidades son los
aminocidos, de los cuales existen veinte especies diferentes y que se unen entre s
mediante enlaces peptdicos. Cientos y miles de estos aminocidos pueden participar
en la formacin de la gran molcula polimrica de una protena.
Todas las protenas tienen carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno y casi todas
poseen tambin azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes protenas, el
contenido de nitrgeno representa, por trmino medio, 16% de la masa total de la
molcula; es decir, cada 6,25 g de protena contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza
para estimar la cantidad de protena existente en una muestra a partir de la medicin
de N de la misma.

La sntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las clulas segn las
directrices de la informacin suministrada por los genes.
Las protenas son largas cadenas de aminocidos unidas por enlaces peptdicos entre
el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminocido
adyacentes. La secuencia de aminocidos en una protena est codificada en su gen
(una porcin de ADN) mediante el cdigo gentico. Aunque este cdigo gentico
especifica los 20 aminocidos "estndar" ms la selenocistena y en ciertos Archaea
la pirrolisina, los residuos en una protena sufren a veces modificaciones qumicas
en la modificacin postraduccional: antes de que la protena sea funcional en la clula,
o como parte de mecanismos de control. Las protenas tambin pueden trabajar juntas
para cumplir una funcin particular, a menudo asocindose para formar complejos
proteicos estables.
FUNCIONES
Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas
constituyentes de los seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los procesos
biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de molculas. Bastan
algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las funciones que
desempean.
Son protenas:
Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones qumicas en organismos
vivientes;
Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares;
La hemoglobina y otras molculas con funciones de transporte en la sangre;
Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones
o agentes extraos;
Los receptores de las clulas, a los cuales se fijan molculas capaces de
desencadenar una respuesta determinada;
La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del msculo
durante la contraccin;
El colgeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostn.

ESTRUCTURA

Es la manera como se organiza una protena para adquirir cierta forma. Presentan una
disposicin caracterstica en condiciones fisiolgicas, pero si se cambian estas
condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformacin y su funcin, proceso
denominado desnaturalizacin. La funcin depende de la conformacin y sta viene
determinada por la secuencia de aminocidos.
Para el estudio de la estructura es frecuente considerar una divisin en cuatro niveles
de organizacin, aunque el cuarto no siempre est presente.
Conformaciones o niveles estructurales de la disposicin tridimensional:
Estructura primaria.
Estructura secundaria.
Nivel de dominio.
Estructura terciaria.
Estructura cuaternaria.
A partir del nivel de dominio slo las hay globulares.

ETAPAS POSTERIORES DE PROCESAMIENTO: EXTRACCIN Y PURIFICACIN

DE PROTENAS
LISIS CELULAR

Para obtener protenas intracelulares de los microorganismos existen tres mtodos

generales; enzimticos, qumicos o fsicos. No todas las metodologas pueden ser
utilizadas en procesos a gran escala. Quizs el ejemplo mas destacado es la
sonicacin, que es el mtodo ms empleado en la obtencin de protenas en el
laboratorio.
Mtodos enzimticos de ruptura celular
La lisozima cataliza de forma especfica, la hidrlisis de enlaces - 1,4-glucisidcos
presentes en los mucopptidos de las paredes celulares de las bacterias. Las
bacterias Gram-positivas son las que presentar mayor sensibilidad a la lisozima. Sin
embargo, la ruptura final de la envoltura celular, depende a menudo de la presin
osmtica del medio de suspensin una vez que se ha digerido la pared. En las
bacterias gran-negativas la ruptura de la pared celular se consigue con lisozima y la
adicin de EDTA, que acta como agente quelante de iones metlicos, origina
generalmente la lisis celular. Esta tcnica no se puede utilizar para extracciones a
gran escala de enzimas bacterianas debido al costo relativamente alto de la lisozima.
En situaciones concretas se ha empleado glucanasas microbianas para hidrolizar las
paredes de las levaduras, que contienen -1,3 glucano, 3 y la lisoestafina empleada
para liberar protenas de estafilococos por ejemplo, la protena A de S. aureus.
Mtodos qumicos de lisis celular
lcali.
Este mtodo ha sido utilizado con considerable xito para la extraccin de protenas
bacterianas a pequea y gran escala. Por ejemplo la enzima teraputica Lasparaginasa puede liberarse por tratamiento de Erwinia chrysanthemi a un pH
alcalino entre 11.0 y 12.5, durante 20 minutos. 4 el xito del tratamiento depende de la
estabilidad en lcali del producto a obtener. El elevado pH puede inactivar las
proteasas y este mtodo tambin es valioso en la inactivacin
lisis de
microorganismos manipulados por ingeniera gentica.
Detergentes.
Los detergentes, tanto inicos, como es el caso del lauril sulfato sdico, colato sdico
(aninico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catinico), o no-inicos, por ejemplo el

tritn X-100, X-450 o incluso el Tween, se han utilizado para favorecer la lisis celular.
Los detergentes inicos son ms reactivos que los detergentes no-inicos y pueden
ocasionar la desnaturalizacin de muchas protenas.
La presencia de detergentes puede afectar tambin a las etapas posteriores de
purificacin, en particular a la precipitacin proteica por tratamiento con sales. Esto
puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografa de intercambio inico
o por ultrafiltracin
el tritn X-100 ha sido empleado para la liberacin a gran escala del colesterol
oxidasa a partir de Nocardia sp y el colato sdico se ha utilizado para solubilizar
pululanasa una enzima ligada a membrana, a partir de clulas intactas de Krebsiella
pneumoniae.
Mtodos fsicos de lisis celular
Choque osmtico.
El choque
osmtico ha sido utilizado en la extraccin de enzimas hidroliticas y
protenas ligadas del espacio periplsmico de cierto nmero de bacterias Gramnegativas, incluyendo a Salmonella typhimurium y E. coli. El mtodo implica el lavado
del cultivo de bacterias en una solucin tampn para tratar de eliminar los restos del
medio de cultivo y posteriormente, por ejemplo, resuspenderlo en tapm con sacarosa
al 20%. Tras equilibrarse, las clulas se recogen y resuspenden rpidamente en agua
a una temperatura aproximada de 4C. Solamente un 4-8% de la protena total
bacteriana se libera por choque osmtico pero si la enzima requerida se localiza en la
regin peri plasmtica, el choque osmtico puede producir un incremento de 14 a 20
veces en la purificacin con otras tcnicas de extraccin.
El empleo del choque osmtico se est viendo favorecido con el incremento en el
nmero de protenas recombinantes que se secretan al periplasma.
Homogeneizacin con abrasivos.
Inicialmente esta tcnica se utilizaba para la homogeneizacin de pastas celulares en
un mortero con polvo abrasivo tal como cristal, almina o kieselguhr. El sistema ha
sido desarrollado y mecanizado utilizando dispositivos desarrollados originalmente
para la homogeneizacin hmeda y la dispersin de pigmentos en las industrias de
impresin y pintura. Un producto tpico, el Dynomill (w. a. Bachofen, Suiza) se emplea
para liberar protenas de una amplia variedad de microorganismos. Consiste en una
cmara que contiene bolsa de vidrio y varios discos fijos y rotatorios. La suspensin
celular se bombea en la cmara, y la rpida agitacin es suficiente para romper incluso
las bacterias ms resistentes. La cmara de desintegracin est refrigerada para
eliminar el calor que se genera.
Un elevado nmero de factores influyen en la proporcin de clulas lisadas, entre ellos
el tamao y concentracin de bolas de vidrio, el tipo, la concentracin y la edad de las
clulas, la velocidad de agitacin, el flujo a travs de la cmara, la temperatura de
ruptura y la disposicin de los discos del agitador, habindose investigado todos ellos
para levaduras y para bacterias.
Tamizacin slida
El mtodo implica la extrusin del material celular congelado a travs de un orificio de
pequeo dimetro y a una presin elevada, manteniendo la temperatura prxima a
-20C. Se ha descrito un proceso semicontinuo, basado en una prensa X a escala de

laboratorio, el cual presenta un peso de 10 Kg de pasta celular bacteriana por hora a

una presin de 150 MPa y con una deficiencia del 90 % en la ruptura.
Tamizacin lquida
Este es ahora el mtodo de ruptura celular de eleccin utilizado en la lisis a gran
escala de microorganismos, estando muy extendida su aplicacin tanto en procesos
industriales como de investigacin. Es particularmente til en la ruptura de clulas
bacterianas aunque tambin puede ser efectivo en la rotura de hongos o levaduras
Las clulas en una suspensin lquida son forzadas a pasar a travs de un orificio de
pequeo dimetro bajo una presin muy elevada. Para trabajos a pequea escala se
puede emplear una versin continua de la Prensa Frech
Para trabajos a gran escala se emplea generalmente un homogeneizador que se
pens para la produccin de emulsiones en la industria lechera.
Para trabajos a gran escala el homogeneizador Manton-Gaulin es el ms empleado.
Las proporciones de rotura celular y de liberacin proteica dependen de diversos
factores, entre los que se incluyen el tipo de clulas, la concentracin de las mismas y
el pre tratamiento. El grado de liberacin proteica de clulas de levadura se describe
por la ecuacin emprica de primer orden.
log (Rm / Rm R) = K n p2.9
Donde Rm = cantidad terica mxima de protena soluble que puede ser liberada, R =
cantidad de protena soluble liberada, K = constante dependiente de la temperatura, n
= nmero de veces que la suspensin pasa a travs de la mquina, y p = presin de
trabajo.
Ejemplos sobre el empleo de los homogeneizadores Manton-Gaulin para la rotura a
gran escala de clulas microbianas. La -galactosidasa se ha obtenido de E. coli y la
carboxipep-tidasa a partir de Pseudomonas spp.
Un elevado nmero de enzimas se han obtenido de la bacteria termoflica Bacillus
stearothermophilus, incluyendo la gliceroquinasa y una hexoquinasa glucosa
especfica.
PURIFICACIN INICIAL
Eliminacin de restos celulares
Una vez provocada la ruptura celular, la primera etapa en la purificacin de una
enzima intracelular es la separacin de los restos celulares. La separacin de slidos
de lquidos es una operacin clave en el aislamiento de una enzima y normalmente se
lleva a cabo por centrifugacin o filtracin.
Centrfugas
Existen diferentes centrfugas con rangos de capacidad desde las de menos de 1 ml
hasta aquellas que superan varios litros, capaces de aplicar una fuerza centrfuga
superior a 100.000 g. Sin embargo, para la eliminacin de clulas bacterianas, de
restos celulares o de los precipitados proteicos es suficiente disponer de 20.000 g.
Centrfugas de flujo continuo

Debido a los grandes volmenes de lquido que es necesario manejar al comienzo de

un proceso de purificacin enzimtica a gran escala, es preferible utilizar una
centrfuga de flujo continuo para eliminar el material particulado.
Existen tres tipos bsicos de centrfugas: la centrfuga tipo disco o multicmara, la
centrfuga de cmara hueca y la centrfuga de cestillo.
Las centrfugas de cmara hueca tienen un rotor tubular que provoca un flujo de
extracto elevado, el cual se bombea en el fondo y fluye hacia la superficie de la
cmara. El material particulado se deposita en las paredes del rotor y los extractos
clarificados salen por la parte superior y son recogidos en un recipiente receptor.
La facilidad para cambiar el rotor o la utilizacin de un mecanismo de transporte para
recuperar el sedimento han contribuido a la popularidad de este tipo de centrfugas.
Las centrfugas de disco permiten excelentes rendimientos en la clarificacin de
extractos crudos y en muchos casos el sedimento se puede eliminar sin interrumpir el
proceso de centrifugacin. La cmara contiene una serie de disvos alrededor de un
cono central. Al entrar los extractos, el material particulado es arrojado al exterior,
chocando con los discos y sedimentando el material sobre la pared de la cmara.
Una desventaja de este tipo de centrifugacin es la perdida de actividad cuando se
descargan los slidos.
Los rotores de estos instrumentos que carecen de la facilidad para descarga del
sedimento durante el proceso son difciles de limpiar y ello puede resultar en una
perdida de producto cuando se necesitan estos slidos.
Una variacin de la centrifuga tipo disco es la centrifugacin con un rotor de cmaras
mltiples en la que el rotor s divide por cilindros montados verticalmente en una serie
de cavidades interconectadas. Este tipo de acoplamiento asegura un paso fijo corto y
constante para el llenado del rotor y es ms fcil de desmontar y de limpiar que la
centrifuga de tipo disco.
Centrifugas de ese tipo son comercializadas por De Laval Separator Co.
(Nueva
York; USA) wesfalia separator Ltd. (wolver ton, UK) y por Bird machine co. (south
Walpole, Massachusetts, USA). Existe una revisin del desarrollo y la construccin de
separadores para centrifugas en gran escala.23
Un problema que se presenta en todos los tipos de centrifugacin cuando se trabaja a
nivel industrial en la recuperacin de encimas es que la mayora de los homogenizados
produce precipitados poco consistentes. En algunos casos, puede evitarse mediante la
adicin de un agente tal como el CDR basado en la celulosa24
Centrifugas de cestillo
El principal objetivo de estas maquinas es la obtencin de material particulado de gran
tamao. En el contexto de la purificacin de enzimas esto se refiere generalmente a
materiales intercambiadores inicos, lo cuales han sido empleados apara la adsorcin
de la protena deseada.

Filtracin atravs de la membrana.

Un mtodo alternativo para la clarificacin de extractos celulares es la filtracin. Sin

embargo, la preparaciones microbianas frecuentemente son gelatinosas y por ello
difciles de filtrar por los mtodos tradicionales a menos que se empleen reas de
gran tamao para la filtracin.
Para evitar estos problemas se utiliza la filtracin tangencial o de flujo cruzado.
Las arilacilamidasa y carboxipptidasa G procedentes de especies seleccionadas de
Pseudomonas se han aislados con xito a partir de estos celulares rotos por micro
filtracin tangencial usando el sistema pellicon de millipore (millipore (UK) Ltd.,
Londres, UK).
Las membranas con una estructura de poro asimtrica son bastante menos propensas
a ensuciarse. Este tipo de membranas se han utilizados para separar arilacilamidasa
de restos celulares de Pseudomonas. Membranas de este mismo tipo tambin se han
usado en mayor escala para obtener L-asparaginasa a partir de Erwinia chrysanthemi.
Esta misma estructura se empleo tambin para clarificar un extracto producido
mediante la lisis alcalina de estas bacterias.
SEPARACIN ACUOSA BIFSICA
Los sistemas acuosos de dos fases, tpicamente creados almizclar soluciones de
polietilenglicol y dextrano o polietilenglicol y sales especificas como fosfato potsico o
sulfato amonico se pueden utilizar tanto para la separacin de protenas durante la
purificacin proteica como para la separacin de protenas de los restos celulares.
Este fenmenos refleja el balance entre los componentes implicados: polmeros, sales,
protenas y solventes (agua).
Una separacin de protenas precisas depende de parmetros tales como su peso
molecular y carga, la concentracin y el peso molecular de los polmeros, la
temperatura, el pH., la fuerza inica de la mezcla y la presencia de sales polivalentes
tales como sulfato o fosfato. Las condiciones ptimas requeridas para una protena
pedicular se deben encontrar empricamente. Aunque las condiciones requeridas para
llevar acabo una separacin satisfactoria pueden a menudo ser definidas de forma
precisa, el mecanismo de separacin es muy poco conocido y la influencia precisa de
las sales inorgnicas, desconocida.
Adems, el polietilenglicol, que es usado comnmente en estas separaciones de
fases, puede unirse a proteinas y esto puede causar comportamientos anmalos en
los siguientes pasos cromatograficos tpico
Las fases se pueden separar en un depsito, pero una separacin mas rpida y
eficiente se lleva acabo mediante centrifugacin.
Se estn investigando sustitutivos del dextrano crudo o el hidroxipropilalmidon.Abbott
et al. Ofrece una buena visin general de los sistemas acuosos bifsicos con
polmetros.
La separacin bifsica se a empleado en la purificacin y separacin a gran escala
de la pulgada -6-glucan hidrolasa y de la 1,4-glucan-fosforilasa a partir de 5 Kg, de
homogenizado celular de klebsiella pneumoniae, y RNA polimerasa y glutamina
sintetasa de E.coli.
Para alterar el proceso de separacin de protenas se han unido
polmetros (particin-.afinidad).

ligados a los

La separacin por afinidad se ha utilizado para purificar la frmico deshidrogenasa a

partir de la levadura cndida bodinii, usando el colorante tiazinico rojo porcin HE-3B,
inmovilizado sobre polietilenglicol. La separacin acuoso bifsica es un mtodo que
puede ser fcilmente aumentando de escala a un nivel de manufacturacin, aunque el
coste de los polmeros podra ser un factor limitante.
PRECIPITACION
Sulfato amnico
La precipitacin de protenas mediante el uso de sales ha sido utilizada durante
muchos aos, siendo til tanto para su purificacin como para su concentracin. La sal
ms comnmente empleada es el sulfato de amonio debido a su alta solubilidad, a la
ausencia de toxicidad para la mayor parte de las enzimas y a su bajo costo. La
precipitacin de una protena mediante el tratamiento con una sal depende de diversos
factores: como el pH, temperatura, la concentracin de protenas y la sal empleada.
Solventes orgnicos
La adicin de solventes orgnicos a soluciones acuosas reduce la solubilidad de las
protenas al disminuir la constante dielctrica del medio. Siendo los ms utilizados el
etanol, la acetona y el 2-propanol, que es el ms empleado. Debido a que las
protenas se desnaturalizan en presencia de solventes orgnicos es aconsejable
trabajar a temperaturas inferiores a 0C.
La naturaleza inflamable de los materiales junto al alto costo y la baja selectividad
hacen que los solventes orgnicos no sean usados a menudo en purificaciones
enzimticas a gran escala.
Polmeros de alto peso molecular
Existen otros agentes precipitantes orgnicos que pueden ser empleados para el
fraccionamiento de protenas; entre ellos nos encontramos
los polmeros
acuosolubles, de los cuales es el polietilenglicol el ms ampliamente utilizado. Este
compuesto presenta las siguientes ventajas: no es toxico, no es inflamable y adems
no produce la desnaturalizacin de protenas. Se usa fundamentalmente en el campo
del procesamiento de sangre.
CROMATOGRAFIA
La purificacin de enzimas por cromatografa ha sido una prctica de laboratorio
durante muchos aos. Estos mismos procedimientos cromatograficos pueden ser
empleados de forma similar para el aislamiento de cantidades muy superiores de
protenas
La cromatografa es la nica metodologa con la selectividad suficiente para purificar
una protena de una mezcla proteica compleja con un grado de purificacin final
superior al 99,8%.

Optimizacin del salto de escala y de la calidad del proceso

En la cromatografa analtica, as como en muchas aplicaciones a escala de
laboratorio, la cantidad de muestra que se aplica es pequea y el fin principal es el de
obtener el mayor numero de picos o el producir una pequea cantidad de protena
altamente purificada. La velocidad de flujo empleada suele ser baja, siendo la
resolucin el factor decisivo. Por el contrario, el propsito principal en la cromatografa
preparativa es la purificacin de grandes cantidades de protena en el menor tiempo
posible. Los flujos suelen ser elevados ya que la velocidad de procesamiento es ms
importante que la resolucin.
El salto de escala en la separacin cromatografica es, en principio, sencillo, ya que la
teora de esta metodologa seala que el dimetro de la columna no presenta un
efecto importante sobre la resolucin, de forma que bastara con incrementar el
dimetro de la columna para provocar el salto de escala.
Antes de realizar un proceso a gran escala es importante que el proceso de
purificacin que se ha de efectuar este optimizado y totalmente estudiado a nivel de
laboratorio. La bsqueda inicial de las condiciones ideales en una tcnica de adsorcin
debe efectuarse empleando diferentes adsorbentes bajo diversas condiciones de pH y
fuerza inica. Se pueden poner a punto mtodos cromatograficos adecuados
utilizando tanto equipos convencionales de baja presin como de elevada presin, con
grandes prestaciones.
A continuacin de este proceso de optimizacin, el siguiente paso es el aumento de la
cantidad de muestra que se puede separar en la columna, que debe multiplicarse por
un factor de entre diez y veinte. La altura de la columna debe Mantenerse constante,
mientras que el rea superficial deber incrementarse en proporcin a la cantidad de
muestra. El gel debe ser el mismo, o al menos tener caractersticas similares. El flujo,
la fuerza inica y el pH deben mantenerse invariados. Si se emplea un gradiente de
elucin, la relacin entre los volmenes de gradiente y de la columna debe ser
idntica.
En principio, estos procesos de salto de escala deben repetirse hasta alcanzar la
escala de operatividad deseada.
En la proporcin en que aumenta el dimetro de la columna incrementa el costo, as
como la dificultad para asegurar la carga de la muestra sobre toda la superficie.
Si el producto proteico va a ser destinado para uso humano existen otros factores,
junto a los mecanismos del salto de escala, hay que tener en cuenta. Existira la
necesidad de demostrar que cualquier material que pudiera haber entrado en contacto
con el producto durante su elaboracin no. esto tiene presencia residual en el
producto final. Es necesario un control estricto de las materias primas, incluidas las
matrices de cromatografa utilizadas, para asegurar criterios estrictos en trminos de
pureza y aceptacin. Esto, a su vez podra influir en la eleccin del mtodo.
Para llevar a cabo un procesado de calidad, es necesario distinguir entre los
contaminantes procedentes del sistema biolgico de las materias primas del proceso
de aquellos introducidos incidentalmente durante el procesado. Es especialmente
necesario disponer de mtodos analticos adecuados para la cuantificacin de estas
impurezas, las cuales podran estar presentes en el producto final. Los contaminantes
introducidos durante el procesado pueden ser de muy diversa naturaleza. Antes de la

introduccin deliberada de cualquier elemento durante el protocolo de purificacin, es

necesario asegurarse de que su presencia puede ser seguida de forma adecuada- se
debera demostrar, as mismo, que puede ser eliminada satisfactoriamente (usando un
paso de eliminacin) en una etapa posterior.
Los niveles de pureza deben ser extremadamente elevados, y esto podra eliminar
ciertos abordajes para el salto de escala. La demostracin de pureza es una
consideracin importante para lograr un proceso de calidad y ha conducido a la
necesidad de complejas estratgicas para el anlisis de la pureza de las protenas
incluso donde estas protenas de uso farmacutico se han producido mediante
tecnologa de DNA recombinante.
Seleccin de la metodologa
Para obtencin y separacin de protenas a gran escala se puede emplear cualquier
de las tcnicas cromatrograficas disponibles: filtracin a travs de geles, intercambio
inico, interaccin hidrofobica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque.
Tabla 1 mtodos cromatografico para la purificacin de protenas a gran escala
Caracterstica
Tipo
de Caractersticas
Aplicacin
molecular
cromatografa
aprovechada
Tamao
Gel filtracin
Resolucin moderada para el El fraccionamiento es mejor
fraccionamiento y buena para en las ltimas etapas de la
tampones
intercambiadores. purificacin. En cualquier
Capacidad limitada por el momento puede ser utilizado
volumen de la muestra.
los
tampones
intercambiadores y podr
existir una limitacin respecto
al volumen de la muestra.
Carga
Intercambiador
La resolucin puede ser alta. Es ms efectiva en las
inico
Capacidad alta no limitada por primeras
fases
del
el volumen de la muestra. La fraccionamiento cuando se
velocidad puede ser muy van a manipular grandes
elevada dependiendo de la volmenes.
matriz.
Cromatoenfoque
La resolucin puede ser alta. Es mejor usarla en una
La capacidad puede ser alta. purificacin posterior, ya que
La velocidad puede ser alta.
las matrices son caras.
Polaridad
Interaccin
Resolucin buena. Capacidad Puede ser utilizado en
hidrofobica
muy alta y no limitada por el cualquier fase, pero es mejor
volumen de la muestra. aplicarla cuando la fuerza
Velocidad alta.
inica es alta tras la
precipitacin con sales o
despus de un intercambio
inico.
Afinidad
afinidad
La resolucin puede ser Puede
emplearse
en
biolgico
elevada. Capacidad puede ser cualquier
etapa,
aunque
alta o baja, dependiendo de normalmente
no
es
ligando y no limitada por el recomendable
en
las
volumen de la muestra. primeras fases.
Velocidad elevada.

En este sentido, etapas en las que se produce una concentracin del producto, como
es la cromatografa de afinidad, hidrofobica o de intercambio inico deben realizarse
antes que aquellas que causan una dilucin, como es el caso de la filtracin a travs
de geles. La cromatografa de interaccin hidrofobica puede realizarse posteriormente
a una de intercambio inico con un cambio mnimo en el tampn, puesto que la
mayora de las protenas se unen mas fuertemente a un soporte hidrofobica a fuerzas
inicas altas.
LA CROMATOGRAFA DE AFINIDAD ES CAPAZ, POR SI SOLA, PARA LLEVAR A
CABO LA PURIFICACIN DE PROTENAS A ESCALA DE LABORATORIO.
Eleccin de la matriz
Quizs la decisin mas importante que se debe tomar cuando se disea un proceso de
purificacin a gran escala sea la concerniente a la seleccin del tipo de matriz de
cromatografa. Una matriz de cromatografa a gran escala deber ser hidrofilica,
macroporosa, rgida, con partculas esfricas, qumicamente estable, ligandos
delicados y de fcil modificacin.
Tabla 2 ejemplos de matrices para cromatografas a gran escalas. Este listado no es
exhaustivo, pero se pretende dar ideas acerca de la cantidad de material disponible.
Matriz
ejemplo
proveedor
Dextrosa con enlaces entrecruzados
Sephadex
1
Poliacrilamida con enlaces entrecruzados
Biogel-P
2
Agarosa
Sefarosa
1
Biogel-A
2
Ultrogel-A
3
Agarosa con enlaces entrecruzados
Sefarosa CL
1
Sefarosa FF
1
Superosa
1
Compuesto de poliacrilamida y dextrosa
Sephacry1
1
Compuesto de poliacrilamida y agarosa
UltragelAcA
3
Compuesto de dextrosa y agarosa
Superdex
1
Polmeros etilenglicol-metacrilato
Trisacry1
3
celulosa
Fractogel
4
Cellex
2
DE-52, CM-52
5
Sephacel
1
Cellufina
6
Polmeros orgnicos rgidos
Monobeads
1
TSK-PW
4
POROS
7
Slice porosa
Zorbax
8
Aquapore
9

Porosidad
Tipo de Matriz

Adsorci
n
noespecfic
a
Baja

Rigide
z

Estabilida
d

Dextrano con enlaces Baja

Baja
Buena
entrecruzados
Poliacrilamida
con Baja
Baja
Baja
Buena
enlaces entrecruzados
Agarosa
Alta
Baja
Baja
Deficiente
Agarosa con enlaces Alta
Baja
Media
Buena
entrecruzados
Compuesto
Alta
Media
Media
Buena
Poliacrilamida/Dextrano
Compuesto
Media
Baja
Media
Buena
Poliacrilamida/Agarosa
Polmero
acrlico Media
Media
Media
Buena
hidroxilado
Copolmero etilenglicol- Baja/media Media
Media
Buena
metacrilato
Celulosa
Media/alta Alta
Baja
Buena
Slice porosa
Baja/media Alta
Alta
Deficiente
Polmero
orgnico Media/alta Baja
Alta
Buena
rgido
Tabla 3. Propiedades de las matrices cromatogrficas bsicas.

Facilidad
de
modificaci
n

Coste
relativo

Buena

Bajo/medio

Buena

Medio

Buena
Buena

Medio
Medio

Buena

Medio

Buena

Medio/alto

Buena

Medio

Buena

Medio

Buena
Deficiente
Buena

Bajo
Alto
Alto

Algunos geles, como los basados en agarosa o celulosa, son productos naturales;
otros, como aquellos basados en dextranos entrecruzados o agarosa, son productos
Naturales modificados; un tercer grupo esta basado en componentes totalmente
sintticos tales como la poliacrilamida, el polihidroxietilmetacrilato o el poliestireno.
Los geles pueden clasificarse adems en macroporosos, como los geles de agarosa o
de celulosa, o microporos como los geles de dextrano o de poliacrilamida con enlaces
entrecruzados. Los geles macroporosos son de mayor utilidad en la cromatografa de
afinidad o de intercambio ionico o para el fraccionamiento de molculas de gran
tamao, virus, protenas muy grandes, o micro protenas.
Los geles de microporosos son ms aplicados para el fraccionamiento de restos de
protenas. Los primeros geles con consistan en matrices de dextrano con enlaces
entrecruzados, celulosa, poliacrilamida, o agarosa, eran muy blandos no se
adecuaban fcilmente a procesos cromatogrficos a gran escala. La nueva generacin
de geles macroporosos a un que formados por un elevado numero de enlaces
entrecruzados, son matrices de agarosa o de poliacrilamida-agarosa, son mucho mas
rgidos y adecuados para purificacin a gran escala. Poseen un tamao de partcula
ms pequeo y mejor controlado, lo que permite una reproducibilidad mayor cuando
se usan grandes velocidades de flujo.

Gel filtracin

ste tipo de separacin se basa en el tamao molecular. La fase estacionaria esta

formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente mvil. Cuando se aade la
muestra, las molculas de la mezcla se reparten entre los poros del gel del solvente.
Las molculas de tamao, incapaces de atravesar los poros, pasan a travs de los
espacios intersticiales y eluyen en primer lugar. Las molculas ms pequeas que
pueden pasar a travs de los poros, se eluyen posteriormente, en orden decreciente
de tamao.
El volumen total de una columna puede representarse por:
Vt = V0 + Vi + Vm

(2)

Donde Vt es el volumen total de la columna, V 0 el volumen del solvente en el

exterior de las partculas, Vi el volumen del solvente que ocupa el interior de las
partculas, y Vm el volumen de la matriz.
El volumen de elucin de una protena puede por tanto variar entre, V 0 para
una protena que no penetra en los poros del gel, y V i para aquellas que son capaces
de entrar en la matriz. As es posible calcular un coeficiente de particin efectivo, K av,
el cual vara entre 0 y 1.
Kav = (Ve V0) / (Vt Vo)

(3)

Donde Ve es el volumen de elucin del soluta, Vo el volumen vaco de la columna y V t

el volumen total de la columna. Para las protenas globulares se ha demostrado
empricamente que el valor de Kav es inversamente proporcional al logaritmo de la
masa molecular relativa.
Es esencial que no exita interaccin entre la matriz y el soluto; por consiguiente, la
sustancia ideal que forma la columna debera ser totalmente inerte, y para tener
capacidad mxima, debera ser tambin altamente porosa y rgida.
Para el trabajo a gran escala, la rigidez es quizs el factor ms importante ya que
determina la velocidad de flujo que se puede utilizar.
Por esta razn, la mayora de las aplicaciones del gel filtracin se limitan a proceso de
eliminacin de sales, empleando geles de baja porosidad, aunque sean rgidos como
es el caso de Sephadex G-25 y G.50.
Cromatografa de intercambio inico

Tradicionalmente para el fraccionamiento de protenas se han empleado los

intercambiadores inicos basados en compuestos de celulosa con diversos
sustituyentes;
Tabla 4. Sustituyentes en intercambiadores inicos
Intercambiador anionico
Amina cuaternaria (Q)
Amino etilo cuaternario (QAE)
Dietilaminoetilo (DEAE)

-CH2-N+-(CH3)3
-O-CH2-CH2-N+(C2H5)3
-O-CH2-CH2-N+(C2H5)2

Los intercambiadores celulsicos inicos son ideales para diversas operaciones como
primera etapa en varios procesos.

No es posible usar habitualmente en procesos a gran escala estas columnas de

celulosa, debido a que no pueden soportar grandes velocidades de flujo y a que sufren
cambios de volumen si se producen cambios de pH o fuerza inica siendo muy
complicado regenerarlas sin volver a empaquetar la columna.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

La cromatografa de afinidad es quiz el mtodo de purificacin ms elegante para

obtener una protena a partir de una mezcla compleja. Aunque se usa ampliamente en
el laboratorio, solo en los ltimos aos parece aceptable en purificaciones a escala
industrial.
Esta metodologa se basa en la interaccin de una protena con un ligando
inmovilizado. El ligando puede ser bastante especifico para una protena particular, por
ejemplo un sustrato, un anlogo del substrato, un inhibidor, o un anticuerpo. Existen
alternativas en las que el ligando es capaz de interaccionar con una variedad de
protenas, en este caso del NAD, AMP, ADP, colorantes, o cadenas de hidrocarburos.
La cromatografa de afinidad con nucletidos inmovilizados es escasamente usada en
procesos de purificacin a gran escala quiz debido a su inestabilidad, corte, baja
capacidad y las dificultades de su incorporacin a una matriz solida.
Para la purificacin a gran escala de muchas enzimas, se ha empleado colorantes
inmovilizados, puesto que poseen ventajas tales como facilidad de unin a un soporte
matriz, estabilidad, alta capacidad y al econmicos.
Tabla 5. Ejemplos de enzimas purificadas a gran escala por cromatografa de afinidad
con colorantes.
Enzima
Colorante
Eluyente
Gliceroquinasa
Procin azul-MX-3G
5 mM ATP
Glucoquinasa
Procin marrn H-3R
2 mM ATP
Glicerol deshidrogenasa
Procin rojo HE-3B
2 mM NAD

Metionil- tRNA sintetasa

Triptofanil tRNA sintetasa
3-hidroxibutirato deshidrogenasa
Malato deshidrogenasa

Procin verde HE-4BD

Gradiente de fosfato
Procin marrn MX-5BR 50 mM triptfano
1 M KC1
Procin rojo H-3B
Procin azul MX -4GD
Procin rojo H-3B

1 M KC1 + 2 mM NADH
1 M KC1 + 2 mM NADH
Gradiente 0-0,7 mM KC1

Procin azul MX-4GD

Carboxipeptidasa G2
Procin rojo H-8BN

Albumina de suero bovino

Albumina de suero bovino

Cibracron azul F3-GA

Cibracron azul F3-GA

Adsorbido en presencia
de 0,2 mM Zn2+ y tris
C1H 0,1 M, eluido con
10 mM EDTA pH 5,8y
despus, con tris-C1H
0,1 M pH 7.3

20 mM octanoato sdico
3 M NaCl, pH 8,6

Los colorantes son, a menudo, estructuras del tipo de la antraquinona, que unen
protenas por la interaccin con los dominios de unin a nucletidos de las
deshidrogenasas. Han sido aislados muchos otro tipos de protenas con estos
colorantes, por lo que se piensa que la interaccin especfica para cada caso debe ser
mas variable y, en las mayora de los casos, desconocida.
En los ltimos aos se han empleado de forma ms amplia la cromatografa de
inmunoafinidad debido a la mayor disponibilidad de anticuerpos monoclonales. Por
ejemplo, el interferon leucocitario recombinante y las tres hormonas pituitarias
humanas han sido purificadas usando esta tcnica.
Puesto que la cromatografa de afinidad presenta una alta selectividad, es por lo que
se pueden purificar protenas varios miles de veces en un solo paso. A menudo, es
posible separar formas activas e inactivas de una protena, mediante el uso de un
anticuerpo o pseudosubstrato, o eliminar una pequea cantidad de impureza de un
producto puro. Existen otros muchos ejemplos sobre la utilidad de esta metodologa en
procesos a gran escala, entre ellos estn los descritos por Hill y Hirtenstein y Clonis
Se pueden usar iones metlicos inmovilizados, como Zn2+ o Ni2+, para separar
protenas. Esta separacin depende de la interaccin entre el ion metlico y los
residuos de histidina de la superficie proteica. El ion se inmoviliza quelandolo a un
grupo iminodiacetato que, a su vez, est unido a una matriz adecuada, normalmente
agarosa. Las protenas unidas se pueden eluir usando un ligando competitivo, como
por ejemplo el imidazol.
Los criterios para elegir una matriz de cromatografa de afinidad son similares a
aquellos que se usan para cromatografa de intercambio inico. Como resultado de
ello, las ms usadas matrices macroporosas, como Sefarosa o Trisacryl. La matriz ha
de ser activada qumicamente para unir covalentemente al ligando. Existen muchos
mtodos para hacerlo, pero el ms habitual es el de bromuro de ciangeno. Tambin
se pueden adquirir matrices activadas de los proveedores de productos de
cromatografa si no se desea hacerlo por uno mismo. Los colorantes tienen la

desventaja de que pueden ser acoplados directamente a la agarosa sin previa

activacin.
Los mtodos para diluir una protena ligada pueden ser especficos, mediante el uso
de un substrato o cofactor, o no especficos, por ejemplo modificando el pH o la
concentracin salina. La elucin no-especifica se utiliza habitualmente cuando
adsorbentes muy selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos
selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos selectivos, la
elucin especifica proporciona mayor grado de purificacin. Para la elucin se puede
emplear, un substrato o ligando libre, cambios en el pH o la fuerza inica, la adicin de
agentes desnaturalizantes o caotropicos (por ej., KSCN, urea, hipoclorito de
guanidino), o cambios en la polaridad de los solventes, por adicin de un modificador
orgnico, como es el etilenglicol.
Se prefiere el mtodo mas suave, que, por lo general, se encuentra de forma emprica,
siendo importante en muchos casos las consideraciones econmicas. Aunque los
procesos de purificacin por afinidad pueden realizarse directamente o en columnas,
se lleva a cabo generalmente en estas ultimas.
Cromatografa de interaccin hidrofbica
Este tipo de cromatografa se desarrolla al comprobarse que las protenas se retienen,
de forma inesperada, sobre geles de afinidad con cadenas espaciadoras
hidrocarbonadas. Empleando este concepto, se desarrollaron familias completas de
absorbentes empleando una serie de cadenas homologas entre C2 y C1068, aunque en
la practica la mayora de las protenas pueden purificarse con agarosa acoplada con
grupos fenilo y optilo.
Las interacciones hidrofobicas son ms fuertes a fuerza inica alta, con lo que, a
menudo, la absorcin puede ser llevada a cabo tras la precipitacin salina o la
cromatografa de intercambio inico, sin necesidad de modificar la concentracin
salina de la muestra. Las protenas ligadas se puede eluir alterando el pH del
solvente, la fuerza inica o mediante el empleo de un agente caotropico o un
modificador orgnico tal como el etilenglicol.
Los iones utilizados se pueden agrupar en series dependiendo de si promueven
interacciones hidrofobicas (efecto de eliminacin de sales) o si se rompe la estructura
del agua (efecto caotropico) para debilitar la fuerza de interaccin hidrofobica.

Se ha utilizado la cromatografa sobre columnas de fenil sefarosa para purificar una

arilacilamidasa de pseudomonas fluorescens. La enzima se luyo de una columna de
intercambio inico en tampn fosfato 0,3 M, pH 7,6 a partir de 2 Kg de bacteria, y se
purifico mediante una columna de 500 ml de fenil sefarosa en el mismo tampn y el
empleo de un gradiente decreciente de 0,1M a o,01 M tris HCL, pH 7,6 .
Cromatografa lquida de gran resolucin

Uno de los mayores avances en cromatografa ha sido el desarrollo de matrices de

relativamente bajo tamao de partcula con gran capacidad de resolucin y que sean
capaces de trabajar a altas presiones. Se desarrollaron originalmente para separa
pequeas molculas orgnicas solubles en solventes no acuosos, pero la tcnica se
perfecciono para poder separa protenas y enzimas en solventes acuosos, pudiendo
utilizar as todos los mtodos cromatografcos habituales. la mayora de las
aplicaciones reseadas se usan solo a escala de laboratorio.
La eficacia de las matrices de HPLC se deriva del pequeo tamao de sus partculas
(3 a 50m), necesitndose presiones elevadas para generar velocidades de flujo
adecuadas. Por ello, se necesitan partculas muy rgidas y, en este sentido, se han
realizado dos aproximaciones para resolver este problema. Las matrices de slice son
los suficientemente rgidos y pueden ser activadas de forma adecuada como
monocloro-o monoalcoxi-silanos para producir una superficie hidrofilica que puede
posteriormente modificarse. sin embargo, presentan la desventaja de ser inestables a
pH superior a 8; este problema se ha solucionado mediante el recubrimiento de un
polmero para reducir las disponibilidad de las partculas inorgnicas al solvente, o
ms especficamente por estabilizacin de la superficie con sirconio. Las segunda
aproximacin ha sido el desarrollo de soportes polimricos rgidos con enlaces entre
cruzados, como el monobeads (pharmacia) o el TSK-PW (tosoHaas).
Tras estas verdaderas matrices de gran resolucin se ha desarrollado derivados de
gran disolucin de materiales del empaquetado convencionales, que presenta un
menor nmero de tamao de partcula, para lo que se denomina (cromatografa liquido
de resolucin intermedia) [MPLC].
Otra aproximacin del problema de las velocidades de flujo y la presin en
separaciones de alta resolucin ha sido la cromatografa de perfusin.
Existen pocos ejemplos en la literatura sobre las aplicaciones de HPLC debido
principalmente a que son propiedad de productos especficos aunque algunos
ejemplos de uso de tcnicas convencionales de HPLC y de tcnicas de afinidad de
alta resolucin de han descrito. por ejemplo, la lactato deshidrogenasa del musculo del
conejo se ha purificado empleando Procin azul MX-R inmovilizado sobre slice.

ULTRAFILTRACION

La ultrafiltracin ha sido una tcnica de uso corriente en el laboratorio para la

concentracin de soluciones proteicas en condiciones muy suaves. Tambin es una
alternativa para la dilisis y filtracin a travs de geles para la eliminacin de sales o
los cambios de tampones.

CONCLUSION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos
nucleicos y protenas. Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras
similares, la electroforesis nos ayuda a observar los cidos nucleicos y protenas (de los cual se trato este
trabajo) al final del procedimiento.
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro
tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de
acuerdo a su tamao o peso molecular. Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la
matriz y establecer un patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes.
Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern
posteriormente analizadas e interpretadas.
En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis;
sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa
ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas,
mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros mtodos electroforticos
que presentan ciertas modificaciones, as tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente
usada para separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genmico), la electroforesis bidimensional para un anlisis ms sofisticado de
las protenas etc.
Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e
hibridacin, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta tcnica es posible visualizar
las bandas de ARN o ADN de patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una
nueva protena, entre otros.

REFERENCIAS:
CAPITULO 17
Etapas posteriores de procesamiento: extraccin y purificacin de protenas
M.D. SCAWEN, T. ATKINSON, P.M. HAMMOND, Y R.F. SHERWOOD
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