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1.

CALIBRACIN

1.1. CONCEPTOS BSICOS.


El objetivo de la calibracin es evaluar la capacidad de medida de los instrumentos con
objeto de garantizar la comparabilidad de los resultados con los obtenidos por otros
laboratorios.
El resultado de una calibracin permite atribuir a las indicaciones de un instrumento los
valores correspondientes al mensurando o bien determinar las correcciones a aplicar a tales

indicaciones.
Suelen distinguirse dos tipos de calibraciones: la calibracin directa y la calibracin
indirecta, esta ltima tambin llamada calibracin analtica.
1.2.

CALIBRACIN DIRECTA.

La calibracin directa es la coincidencia entre la magnitud realizada por el patrn y la


cantidad medida por el instrumento. Se refiere al aseguramiento de que un instrumento y/o
aparato funciona correctamente, es decir lo que se espera de l. Por ejemplo, tenemos la

calibracin de una balanza o de una pesa.


Como resultado de la calibracin directa se obtiene una correccin de la respuesta
instrumental o la indicacin para que el funcionamiento de un instrumento alcance el valor

considerado como verdadero; esta correccin puede expresarse en forma de diferencia o en


forma de un factor, considerando a X como la magnitud medida:
Correccin = Xpatrn Xmedida materializada o material de referencia
o bien:
Correccin = Xpatrn / Xmedida materializada o material de referencia
En el primer caso es una correccin constante en todo el intervalo de valores de la magnitud

en que es aplicable, mientras que en el segundo caso es una correccin proporcional. En


cualquier caso es imprescindible que el intervalo de aplicacin de la correccin quede

perfectamente definido.
1.3.

CALIBRACIN INDIRECTA O ANALTICA.

En la calibracin indirecta o analtica la respuesta de un instrumento o sistema de medida se


expresa en forma de una magnitud distinta de la del patrn o patrones de calibracin. La
calibracin de un espectrmetro, en la que se relaciona la concentracin de los patrones con
una magnitud de tipo ptico (absorbancia, intensidad de emisin, etc.), o la de un
cromatgrafo, en la que la altura o rea de los peak cromatgraficos se relacionan con la
concentracin de los patrones, son ejemplos de este tipo de calibracin.

3
Esta calibracin se realiza mediante patrones que contienen cantidades conocidas de
analito, que generalmente son disoluciones del mismo en un disolvente apropiado, que son
sometidas al proceso de medida instrumental.
Al realizar una determinacin analtica empleando una tcnica instrumental, la calibracin
indirecta establece una correspondencia entre la respuesta y la concentracin, o cantidad
absoluta, de analito.
Funcin de calibracin: Seal analtica = (concentracin o cantidad de analito)
Esta funcin es aplicable en un intervalo de concentraciones perfectamente establecido y no
debe ser extrapolada fuera del mismo.
Existen distintos mtodos de calibracin:
1. Curva de calibrado.
2. Adicin estndar.
3. Patrn interno.
El primero es el ms cmodo, pero no siempre el mejor. La eleccin del mtodo de
calibracin depende de la tcnica instrumental, de la naturaleza de la matriz y del nmero
de muestras que se han de analizar.
1.4.

CURVA DE CALIBRADO.

Este mtodo se basa en la medida de la seal de un cierto nmero de patrones sintticos,


que contienen cantidades perfectamente conocidas de analito, y en la consiguiente
interpolacin de la seal de las muestras. La mayora de las tcnicas analticas se realizan
sobre especies en disolucin, por lo que los patrones son disoluciones lquidas obtenidas
por dilucin de un patrn ms concentrado. Este patrn ms concentrado puede prepararse
a partir de un patrn primario o de uno secundario, previa estandarizacin de ste. Pocas
tcnicas utilizan patrones slidos, ejemplo de stas tenemos la espectroscopa de
fluorescencia de rayos X.
El nmero de patrones depende de la exactitud y la precisin requeridas. En caso de
funciones rectilneas, normalmente se preparan entre 3 y 5 disoluciones patrones de
concentraciones diferentes que estn uniformemente distribuidas en la casi totalidad del
intervalo de la linealidad. Si la relacin no es lineal, se requiere un nmero ms elevado de
patrones. Se prepara tambin un blanco del patrn, patrn de concentracin cero. Se mide
la seal analtica de las disoluciones, en las condiciones instrumentales previamente
establecidas y se representa la respuesta en funcin de la concentracin del analito.
La concentracin de las muestras se determina por interpolacin y eso implica que se ha de
pesar la cantidad necesaria de muestra o se han de hacer las diluciones necesarias para que
la concentracin de la solucin, que es medida, quede dentro del intervalo de la linealidad
o en el rango de concentraciones de los patrones.

4
Es recomendable que los patrones tengan una matriz lo ms parecida posible a la muestra.
Para ello se debe agregar el volumen del disolvente utilizado, los reactivos y un exceso del
componente que se encuentra en mayor cantidad en la muestra.
Si el tratamiento de la muestra previo a la medida requiere de operaciones o adiciones de
varios reactivos que no es posible de agregar a los patrones, se debe preparar un blanco de
la muestra. Este consiste en una disolucin preparada exactamente igual que la muestra,
pero que no contiene analito. Si aquel blanco de la muestra da una respuesta
significativamente diferente de cero, habr que restarla a la lectura de la muestra.
Ventajas y limitaciones de la curva de calibrado:

1.5.

Ventajas: sencillez y rapidez, ya que con unos pocos patrones pueden determinarse
numerosas muestras.
Limitaciones: es preciso asegurar que no existe efecto de la matriz o que se ha
corregido convenientemente.
ADICIN ESTNDAR.

Se aplica cuando existe un efecto de la matriz que no es posible corregir. En este mtodo se
mide la seal analtica de la disolucin de la muestra y de las disoluciones que, adems de
la muestra, contienen cantidades conocidas de analito. Estas cantidades conocidas de
analito actan como patrones que se hallan bajo el mismo efecto de la matriz, al igual que
el analito, procedente de la muestra.
Se preparan diferentes disoluciones con alcuotas idnticas de muestra o realizando
adiciones sucesivas sobre una misma alcuota de muestra. El nmero de adiciones oscila
entre una y tres. La funcin de calibracin debe ser rectilnea y sin trmino independiente.
Por ello, en caso de que la seal incluya una contribucin del blanco, sta deber restarse
necesariamente.
Se representa grficamente las seales analticas de la muestra y las de las muestras con
adiciones respecto al incremento de concentracin. Por extrapolacin se obtiene la
concentracin de analito en la muestra no adicionada.
La cantidad de analito adicionada no puede ser muy grande, la respuesta de la muestra sera
muy pequea en relacin a las de las adicionadas, ni muy pequea, no conviene hacer
extrapolaciones muy grandes. Para obtener buenos resultados la concentracin de analito ha
de ser muy similar a x, entre la mitad y el doble.
En el segundo caso, es decir, en las adiciones sucesivas sobre la misma parte alcuota (se
suele emplear en voltamperometra), para no modificar la composicin de la matriz, es muy
importante que el volumen del patrn agregado sea pequeo. S es as, al hacer los clculos,
se puede eliminar el efecto de dilucin.

0
a3

5
C
Figura 2. Curva de adicin estndar
1.5.1. Ventajas y limitaciones de la adicin estndar:

Ventajas: Permite contrarrestar el efecto de la matriz.


Limitaciones: es un mtodo laborioso ya que exige realizar una o diversas adiciones a
cada muestra (es como si se realizara una curva de calibrado para cada muestra). Por

otra parte, la medida se hace por extrapolacin, por lo que pequeas variaciones de la
pendiente de la recta pueden repercutir significativamente en su punto de interseccin
con el eje de las abscisas.
1.6.

PATRN INTERNO.

Se aplica cuando, entre medidas sucesivas, es difcil mantener alguno de los parmetros
operatorios o reproducir la cantidad de muestra sometida al proceso de medida. Se aaden a
la muestra y a los patrones cantidades conocidas de una sustancia, el patrn interno, que no

est presente en la muestra, que se comporta similarmente al analito durante el proceso y


que no reacciona con los componentes de la muestra ni interfiere en el anlisis. Luego se
mide la seal del analito y la seal del patrn interno.
Para construir la recta de calibrado se representa el cuociente de las seales entre el analito
y el patrn interno, Yanalito / YPI, respecto al cuociente de las concentraciones, Canalito / CPI,
para cada una de las seales. Por interpolacin de la relacin de seales correspondientes a

las muestras se obtiene la relacin de concentraciones. Para obtener buenos resultados,


conviene no tener cuocientes muy altos ni muy bajos.
Este mtodo se aplica en cromatografa de gases y tambin en espectroscopa de emisin
atmica. Tiene la ventaja cuando hay variables experimentales poco reproducibles y que
son crticas en la respuesta, tales como el volumen de inyeccin en cromatografa de gases
o las condiciones de excitacin en fotometra de emisin. Si todos los parmetros que
influyen en la respuesta afectan igualmente la seal del analito y la seal del patrn interno,
por lo tanto no afectarn su cuociente.
6
1.6.1. Ventajas y desventajas del patrn interno:

Ventajas: al compensar el efecto de factores no controlados, proporciona resultados


de una elevada exactitud y precisin.

Desventajas: la adicin del PI a muestras y patrones hace que este mtodo sea ms

laborioso que la calibracin convencional. En determinados casos puede resultar difcil


encontrar un PI que cumpla los requisitos sealados.
2.

ESPECTROSCOPA ATMICA
2.1.

INTRODUCCIN

La absorcin y la emisin de la radiacin electromagntica caracterstica por parte de las


sustancias es la base de las tcnicas espectroscpicas de anlisis.
En los mtodos de emisin el analito se somete a un proceso de excitacin mediante
energa trmica, elctrica o, en algunos casos, radiante; como consecuencia de esto, la

sustancia pasa a un estado de energa superior. El paso desde el estado excitado o nivel
energtico superior a un estado de energa ms bajo produce la emisin de radiacin, la que

instrumentalmente es medida.
Por otra parte, en los mtodos de absorcin se mide la atenuacin de la intensidad o

potencia de la radiacin a que es sometido el analito, el cual pasa de un estado de energa


menor a un estado de energa superior.
En ambos casos el mtodo de anlisis se basa en la relacin entre la seal obtenida y la
concentracin de analito.
La seal medida en los mtodos de absorcin es la transmitancia, tanto por ciento de luz
transmitida, o la absorbancia, que corresponde [- logaritmo de T]. A una longitud de onda
determinada, la relacin entre la absorbancia y la concentracin de analito viene dada por la
ley de Beer: A = abc.
En los mtodos espectroscpicos de emisin se mide la intensidad de las lneas de emisin
que es proporcional a la concentracin de analito.
Las experiencias tratadas en este captulo corresponden a emisin y absorcin de radiacin
correspondientes a la regin UV-VIS del espectro electromagntico.
7
2.2.

ESPECTROSCOPA ATMICA.

Cuando las especies que absorben o emiten radiacin son tomos aislados o gaseosos, las
tcnicas analticas derivadas corresponden a las espectroscopa de absorcin atmica, EAA
o AAS, y espectroscopa de emisin atmica, EEA o AES, respectivamente. En ambos
casos se obtienen espectros de bandas muy estrechas, o lneas.
2.3.

ANLISIS POR ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA

Para la aplicacin de esta tcnica se requiere tener las especies absorbentes como tomos

gaseosos, aislados, por lo que es necesario un sistema capaz de producir vapor atmico,
normalmente mediante energa trmica, espectroscopa de absorcin atmica de llama, o
con un horno elctrico, espectroscopa de absorcin atmica con horno de grafito.
La tcnica de absorcin atmica con llama, que es la ms empleada en los laboratorios
industriales y la que trabajaremos en el laboratorio y en este texto, requiere la nebulizacin
de la disolucin de analito para producir un aerosol que es conducido a la llama. El vapor
atmico, generado en la llama, es atravesado por una radiacin especfica del elemento que

se va a determinar, correspondiente a una de sus lneas de resonancia, generada por una


lmpara de ctodo hueco, LCH o HCL (Hollow Cathode Lamp). Parte de esta radiacin es
absorbida por los tomos de analito presentes en la llama, provocando la atenuacin de la
radiacin incidente o absorbancia, medida que es proporcional a la concentracin dentro de
un intervalo determinado, intervalo de trabajo o rango lineal de trabajo.
Para la cuantificacin del analito se utiliza el mtodo de la curva de calibracin externa o,
en casos de matrices complejas, el mtodo de adicin estndar. En casos que existieran en
la matriz de la muestra algn componente capaz de formar una especie refractaria muy
difcil de atomizar en la llama, puede agregarse un agente qumico que evite este efecto,
combinndose con el analito o combinndose con el componente que causa esta
interferencia. Siempre que se agrega un agente qumico a las disoluciones de muestras, ste
debe agregarse tambin a los patrones como al blanco, en igual concentracin.
Monocromador

Atomizador

Lmpara de
ctodo hueco
hueco

0.6
45

Nebulizador
Detector

Procesador Sistema

de seal
Solucin

electrnico
de lectura

Figura 1: Esquema de un espectrmetro de absorcin atmica


8

Modulacin

Fuente
radiante

Monocromador
Atomizador
Nebulizador

Detector

Amplificador

Dispositivo

de lectura

Figura 2: Diagrama de bloques de un equipo de absorcin atmica


2.4.

ANLISIS POR ESPECTROSCOPA DE EMISIN ATMICA

La tcnica de emisin que se considera en este texto y en las experiencias de laboratorio es


la espectroscopa de emisin de llama, que utiliza la energa trmica de una llama como
fuente de excitacin de los tomos de analito. Tal como se ha descrito en la tcnica de
absorcin atmica, la muestra que contiene al analito en disolucin es aspirada, nebulizada
y conducida a una llama; donde es atomizada y excitada por la intensidad de la energa
trmica, provocando la emisin de radiaciones de longitudes de onda caractersticas del

elemento, correspondientes a sus lneas de resonancia, cuya intensidad es proporcional a la

concentracin del analito en un intervalo correspondiente al rango lineal.


Para algunos elementos, y tratando de no disminuir el rendimiento de excitacin por causa
de procesos de ionizacin del analito en la llama, se debe adicionar a la disolucin una sal

de un metal alcalino en gran proporcin con respecto a la concentracin de analito, que


acta como supresor de ionizacin. Este debe agregarse a muestras, patrones y blancos, en
la misma proporcin.
Atomizador

Monocromador

Nebulizador

Cmara de
premezclado

1.645
Detector

Disolucin de la
muestra, patrn o

Procesador

de seal

Sistema
electrnico
de lectura

blanco

Figura 3: Diagrama ptico de un espectrmetro de emisin atmica


9

SESIN 2
3.

ESPECTROMETRA DE ABSORCIN ATMICA

3.1. CALIBRACIN DE UN ESPECTRMETRO DE ABSORCIN ATMICA


Para garantizar la calidad del valor de la medida obtenida al usar un espectrmetro de
absorcin atmica, debe procederse, con cierta periodicidad, en su calibracin.
3.1.1. INSTRUMENTACIN

Espectrmetro de absorcin atmica con llama aire/acetileno y LCH de Cu.

3.1.2. REACTIVOS

Disolucin stock de Cu2+ 1000 mg /L

Disolucin de Cu2+ 100 mg/L, preparar por dilucin de la solucin stock en medio de
cido ntrico al 2 %.

Disoluciones patrones de Cu2+: 1, 2, 3, 4 y 5 mg/L: preparar a partir de la disolucin


anterior, utilizando una micropipeta o microbureta y enrasar con cido ntrico 2 %.

cido ntrico 2 %. Preparar a partir del cido ntrico concentrado p.a.

3.1.3. REPRODUCIBILIDAD DE LA RECTA DE CALIBRADO

Medir las absorbancias de cada una de las disoluciones patrones a 324,8 nm.
Representar los valores de absorbancia en funcin de la concentracin del patrn

correspondiente.

Determinar, por regresin lineal, el coeficiente de correlacin de la recta obtenida.

Cuyo valor, para ser aceptable, debe ser > 0,999.


3.1.4. ESTABILIDAD DE LAS LECTURAS

Medir seis lecturas de la disolucin patrn de Cu2+ 4 mg /L, dejando un intervalo de

unos 6-7 segundos entre lecturas.

Repetir el mismo procedimiento al cabo de 5 min.

Calcular, para cada grupo de valores, la desviacin estndar relativa, RSD. La

diferencia entre los valores obtenidos no debera exceder de un 2 %.

Calcular la variacin del valor medio de ambos grupos de valores, mediante la frmula:
10
d = 100 ( x1 - x2 ) / x1
donde x corresponde a la mediana del primer grupo, y x es la mediana del segundo
grupo de valores. El valor de d no debera exceder de un 10 %.
1

3.1.5. DETERMINACIN DE LA SENSIBILIDAD


1. Preparar, a partir de las disoluciones stock del laboratorio, y en medio de cido ntrico
al 2 %, los patrones que se indican en la siguiente tabla:
Slit
A
A
%
S

Metal Conc.
nm Terica exper. diferencia mg/L
nm
mg/L
Zn
Cu
Mn

1
4
25

213.9
324.8
403.1

0.5
0.5
0.5

2. Medir los valores de absorbancia de los patrones siguiendo las condiciones indicadas en
la tabla.
3. Los valores obtenidos no deberan diferir de los valores tericos, entregados por el
instrumento, en ms de un 10 %.
3.1.6. OBSERVACIONES
En caso de obtener diferencias notables en todas las lecturas proceder a un completo control

de calibracin en todo el laboratorio.


3.2.

VERIFICACIN DEL LIMITE DE DETECCIN (LD) Y VERIFICACIN

DE LA SENSIBILIDAD.

3.2.1. DETERMINACIN DEL LMITE DE DETECCIN PARA CU.


3.2.1.1. INSTRUMENTACIN

Espectrmetro de Absorcin Atmica con llama aire/acetileno y LCH de Cu

3.2.1.2. PROCEDIMIENTO:
a. Preparar dos estndares de cobre en agua destilada
Est : 0.05 g Cu/ mL
Est : 0.10 g Cu/ mL
b. Calibrar el instrumento en la lnea de resonancia principal del Cu, 324.8 nm
1
2

c.

Optimizar la seal hasta que un estndar de chequeo de 4.00 g Cu/ mL entregue una

seal de 0.200 A

11
d. Leer la absorbancia para los estndares de chequeo Est y Est en la siguiente secuencia:
blanco (agua destilada), corrija cero, Est , blanco, Est , blanco, Est , ...
e. Tabular los valores y restar a cada valor de absorbancia obtenido para los estndares el
valor ledo para el blanco siguiente.
f. Calcular la media para Est y Est sus respectivas desviaciones estndares (n-1).
g. Aplicar para cada estndar de cobre:
1

.
L D

.
* 3 DS
Conc Est
A

h. Calcular la media entre los dos valores obtenidos para L.D. e informar el lmite de
deteccin.
3.2.1.3. SENSIBILIDAD

Calcular la sensibilidad en base a los datos obtenidos en el punto 2.c.


Aplicar:
4.00 g Cu/ mL x 0.0044
Sensibilidad =
A
Preparar un estndar cercano al valor calculado y verificar si su A corresponde a 0.004
o 0.005 unidades.

Qu puede concluir de todas sus observaciones y resultados obtenidos?


3.3. OPTIMIZACIN DE UN MTODO ANALTICO POR ESPECTROMETRA
DE ABSORCIN ATMICA
3.3.1. INSTRUMENTACIN
Espectrmetro de absorcin atmica con llama aire/acetileno y HCL de Cu
3.3.2. SENSIBILIDAD VERSUS TIPO DE LNEA RESONANTE
a. Calibrar el instrumento de la misma manera que en 2.b. y 2.c.
b. Aspirar una solucin de 10

g Cu/ mL y calibrar la seal obtenida a un 90% de la

escala del registrador, a 324.8 nm.


c.

Efectuar el registro de las seales obtenidas para 10

g Cu/ mL a las longitudes de

onda de absorcin del Cu: 216.5, 222.6, 224.4, 244.2, 249.2, 324.8 y 327.4 nm
d. Calcular la sensibilidad de cada lnea relativa a 324.8 nm.

12
3.3.3. LINEALIDAD EN FUNCIN DE LA LNEA DE RESONANCIA ESCOGIDA

Realizar una curva de calibracin midiendo a tres longitudes de onda diferentes y

graficar sus resultados:


Lneas de resonancia: 216.5 nm, 324.8 nm, 327.4 nm

3.3.4. LINEALIDAD Y ABERTURA DE SLIT

Medir la curva de calibracin del punto 9.2.3.3. a tres valores de SLIT en la lnea
resonante 324.8 nm y graficar sus resultados.

3.3.5. RELACIN SEAL - RUIDO S/R (S/N)

Registrar en un registrador por 20 segundos las seales obtenidas para un estndar de


4.00 g Cu/ mL, a todas las aberturas posibles.
Para cada lectura registrar antes y despus la seal dada por el blanco.
Calcular las relaciones de S/R y escoger las condiciones que permitan un trabajo
ptimo para el Cu.
Qu puede concluir de todo el trabajo realizado?

SESIN 3
3.4. INTERFERENC1AS

ANALTICAS

QUE

AFECTAN

LAS

DETERMINACIONES POR EAA Y SU CORRECCIN.


3.5.1. INSTRUMENTACIN

Espectrmetro de absorcin atmica con llama aire/acetileno


LCH de Ca, Mg, Cu.

3.5.2. INTERFERENCIAS QUMICAS

INFLUENCIAS DE ANIONES:

Estudiar la interferencia del fosfato en la determinacin de Ca por EAA y su eliminacin


mediante la adicin de lantano o EDTA.
a. Poner a punto el espectrmetro y optimizar las condiciones para la determinacin de
Ca.
b. Aspirar las siguientes soluciones de Ca:
Blanco ( HC12% v/v)
2
g /

mL Ca + HC1 2 % v/v

13

4 g /mL Ca + HC1 2 % v/v


6 g /mL Ca + HC1 2 % v/v

c. Aspirar las siguientes soluciones de calcio preparadas en presencia de fosfato.


Blanco (HCl 2 % v/v)
6 g /mL Ca + HCl 2% v/v + 2 g /mL H PO
6 g /mL Ca + HCl 2% v/v + 10 g /mL H3PO4
6 g /mL Ca + HC12% v/v + 20 g /mL H3PO4
6 g /mL Ca + HCl 2% v/v + 40 g /mL H PO
3

d. Aspirar las siguientes soluciones de Ca preparadas en presencia de fosfato y de lantano


Blanco (La 0.2 % + HCl 2 % v/v)
6 g /mL Ca + HCI 2% v/v + 2 g /mL H PO
6 g /mL Ca + HCl 2% v/v + 10 g /mL H PO
6 g /mL Ca + HCI 2% v/v + 20 g /mL H PO
6 g /mL Ca + HCI 2% v/v + 40 g /mL H PO
3

+ La 0.2 %
+ La 0.2 %
+ La 0.2 %
+ La 0.2 %

e. Aspirar las siguientes soluciones de calcio preparadas en presencia de H PO y EDTA.


3

Blanco HC1 2 % v/v + EDTA 0.1 %


6 g /mL Ca + HCl 2% v/v + 1 0 g /mL H PO + EDTA 0.1 %
3

f. Graficar los resultados obtenidos.


Qu puede concluir de sus observaciones ?

INFLUENCIAS DE CATIONES

Estudiar la interferencia del Al en la determinacin de Mg por EAA.


a. Poner a punto el espectrmetro y optimizar las condiciones para Mg.
b. Aspirar las siguientes soluciones de Mg correspondientes a la curva de calibracin:
Blanco ( HCl 1% v/v)
0.1 g /mL Mg + HCl 1 % v/v
0.2 g /mL Mg + HCI 1 % v/v
0.4 g /mL Mg + HCI 1 % v/v
c. Aspirar las siguientes soluciones de Mg preparadas en presencia de AlCl3:
0.4 g /mL Mg + HCl 1 % v/v + 0.005 g/L AlCI3
0.4 g /mL Mg + HCl 1 % v/v + 0.010 g/L AlCI
3