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Lima Per
2015 - I
CONTENIDO
Pg.
03
Introduccin
05
06
08
14
23
27
30
39
40
42
45
50
54
58
Referencias Bibliogrficas
65
reactivos, cultivos biolgicos y/o similares deber comunicarse al responsable del laboratorio o al
profesor de prcticas a fin de tomar las medidas adecuadas.
El ORDEN Y LA LIMPIEZA son obligatorios en el laboratorio de Biologa Celular y Molecular,
asegrese de aplicarlos durante y despus de la prctica, debiendo dejar el lugar usado como usted lo
encontr.
MANTENGA LOS EQUIPOS EN SU SITIO, moverlos podra daarlos. Salvo indicaciones expresas
del docente de aula, los equipos permanecern en sus respectivos lugares, en caso de observar cualquier
anomala informar al docente inmediatamente. Si al finalizar la prctica se encuentran microscopios con
lminas que debieron ser desechadas con anterioridad, el profesor bajar puntos a la nota de trabajo en el
laboratorio del da a toda la mesa.
Por su seguridad y la de sus compaeros se tienen que cumplir en todas las clases las normas de
BIOSEGURIDAD.
Realizada la prctica ANOTAR Y/O DIBUJAR las experiencias observadas, este proceso le ayudar
para realizar los informes respectivos y para el repaso respectivo.
Los laboratorios SON AMBIENTES DE TRABAJO: Para las demostraciones de sentimientos y juegos
habr otros momentos oportunos.
LA MANIPULACIN DE LOS EQUIPOS SE HAR EXCLUSIVAMENTE POR EL PROFESOR
que solicitar la ayuda del responsable de laboratorio si fuera necesario. Los alumnos slo podrn
manipular los equipos dirigidos por el docente o el responsable de laboratorio
INTRODUCCIN
Todos los seres vivientes estn formados por clulas; y estas a su vez estn formadas por biomolculas; pero
el nmero y la variedad de cada una de estas molculas y clulas difieren grandemente entre los distintos
organismos. Algunos organismos se componen de solamente una clula. Otros como los seres humanos, se
componen de billones de clulas. La Biologa como ciencia, enmarca los principios bsicos del conocimiento
requerido sobre el estudio de los seres vivos. Se trata de una ciencia natural que ha ido forjando, a travs del
tiempo la lucha constante, por conocer y transformar la naturaleza. A travs de su desarrollo, ha surgido una
diversidad de campos especializados dentro de lo que destaca la Biologa Celular y Molecular que se encarga
del estudio de los componentes moleculares de las clulas y su relacin con otras ramas de la Biologa como
la Gentica, con sus estudios del genoma humano, la clonacin de animales, la terapia gnica y la transgnica
como tambin el desarrollo de animales y vegetales transgnicos, avances muy importantes en las Ciencias
de la Salud.
A fin de conocer mejor las complejas y delicadas estructuras de los seres vivos, es necesario el contacto
directo con los muestras que se van a estudiar, por lo que es importante relacionar la teora con la prctica;
para lo cual brindamos el presente Manual de Biologa Celular y Molecular, detallndose las experiencias de
laboratorio con principios muy sencillos y fciles de comprender, para que el estudiante tenga un material
didctico de trabajo que le servir de gua para realizar sus experiencias de laboratorio.
El Manual tiene dos objetivos fundamentales: en primer lugar; introducir al estudiante en el desarrollo de
procedimientos experimentales que le permitan estudiar la clula como unidad estructural, funcional y
reproductiva de los sistemas vivos, as como los procesos metablicos que mantienen y renuevan su
organizacin; y en segundo lugar, desarrollar en el estudiante habilidades para buscar, seleccionar, organizar
e interpretar la informacin experimental; conducindolo a la formulacin de interrogantes sobre una realidad,
con base en la teora ya existente y as alcanzar soluciones a preguntas planteadas en los procesos biolgicos.
Los autores
Investiga previamente sobre los conceptos bsicos del tema a desarrollar en la prctica.
Escucha atentamente las indicaciones de los docentes y sigue las instrucciones del manual de
prcticas.
En caso de que las pruebas experimentales sean individuales realiza todas las pruebas mencionadas
en el manual en forma independiente.
En el caso de las experiencias grupales, trabaja en coordinacin con tu grupo, realizando una
distribucin equitativa de las tareas asignadas, cumpliendo con rapidez y eficiencia, ya que de tu
trabajo depende todo el grupo.
Realiza cuidadosamente tus pruebas experimentales, entendiendo el porqu de los hechos acaecidos.
Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo experimental, observa minuciosamente tus
experimentos y anota y/o esquematiza con claridad los cambios ocurridos (color, volumen,
aumentos observados, emisin de gases, texturas, etc.), as como los resultados finales. Estos
resultados son de forma individual y debern ser entregados a los docentes el da de la prctica para
su revisin y firma, siendo anexados en el informe final.
Discute y analiza con los miembros de tu grupo el porqu de estos resultados y las conclusiones
preliminares, encontrando patrones, explicando sucesos, hechos y construyendo deducciones.
Desarrolla en forma grupal o individual segn las indicaciones de los docentes el informe de prctica,
utilizando fuentes de informacin de nivel universitario que expliquen de forma sustentada tus
resultados y conclusiones desarrolladas que ser entregado al ingresar al laboratorio de la clase
siguiente.
Resuelve los cuestionarios que tienen como objetivo reforzar los conceptos aprendidos en teora y
prctica, porque estas preguntas sern consideradas ara tomar en los pasos al inicio de la prctica.
Las resultados prcticas desarrolladas por uno o un grupo de ESTUDIANTES NO PUEDEN SER
TRANSFERIBLES A OTROS.
Mesa:Fecha:
COMPETENCIAS A EVALUAR
1.
7.
NOTA
PUNTOS
ITEMS A EVALUAR
1. Cartula y presentacin
de la prctica)
mtodos usados)
4. Resultados.
6. Conclusiones
Vancouver)
NOTA
PRCTICA N 1
PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO
En cualquier laboratorio, se deben de seguir normas y procedimientos para que las personas que
laboran en dicho ambiente no pongan en riesgo su salud y la de la comunidad que lo rodea. Dicho
conjunto de medidas especficas a seguir es lo que se conoce como Bioseguridad.
Por tanto, podemos definir bioseguridad como el conjunto de medidas preventivas orientadas a
mantener, controlar y reducir factores de riesgo laborables procedentes de agentes de riesgo
(biolgicos, fsicos o qumicos) con el objetivo de proteger la salud y la seguridad del personal que
labora en un determinado establecimiento de salud, laboratorio de diagnstico o de enseanza
universitaria.
PRINCIPIOS BSICOS DE BIOSEGURIDAD
Se debe tener presente que la sangre humana y los fluidos corporales debern ser tratados como si
estuvieran potencialmente contaminados con patgenos transmisibles por sangre como el VIH y
VHB. Se asume que cualquier contacto directo con estos fluidos puede resultar en infeccin y por lo
tanto se requiere que cada trabajador utilice su equipo de proteccin personal.
Con el fin de evitar accidentes laborales se den tener en cuenta los siguientes principios:
1. Universalidad. Se debe asumir como potencialmente infectante, todo paciente o residuo
biolgico.
Principio Universal: TODO PACIENTE DEBE SER ASUMIDO COMO PORTADOR
DE UN AGENTE INFECCIOSO
2. Uso de barreras para la proteccin personal y disminuir los riesgos, para ello se usan guantes,
lentes protectores, mandil, etc.
3. Lavado de manos.
4. Manejo seguro de los residuos slidos, con el fin de eliminar los residuos biocontaminados
y lograr una buena segregacin de la basura.
AGENTES DE RIESGO
Durante el desarrollo de su trabajo en el laboratorio, dependiendo del tipo de laboratorio y del tipo
de actividad que en este se realiza, el personal puede enfrentarse a diversas situaciones de peligro
que ocasionen efectos adversos a la salud. Estas situaciones de peligro se deben a la exposicin a
ciertos agentes causantes de daos fsicos o enfermedades que pueden ser transmitidas. Estos agentes
de riesgo pueden ser agrupados en tres categoras, en relacin a su naturaleza y caractersticas:
Nivel de
bioseguridad
(BSL)
Grupo de riesgo
(GR)
Tipo de laboratorio
Medidas de bioseguridad
BSL-1 (Bsico)
GR1, riesgo
individual y
poblacional nulo o
bajo
Enseanza bsica,
investigacin
Servicios de atencin
primaria, diagnstico,
investigacin
GR2, riesgo
individual
moderado,
poblacional bajo
BSL-3
(Contencin)
GR3, riesgo
individual elevado,
poblacional bajo
Diagnstico especial,
investigacin
BSL-4
(Contencin
mxima)
GR4, riesgo
individual y
poblacional alto
Unidad de patgenos
peligrosos
BSL-2 (Bsico)
Aquellos generados en el
proceso de atencin e
investigacin mdica
Ejemplo
Cultivos, vacunas vencidas o
inutilizadas. Muestras de sangre,
suero, tejidos, rganos. Residuos
quirrgicos y patolgicos. Material
punzocortante que estuvieron en
contacto con pacientes o agentes
infecciosos.
Animales
contaminados.
Residuos
contaminados provenientes de la
atencin al paciente.
Residuos qumicos peligrosos.
Residuos farmacuticos (vencidos,
desactualizados, no utilizados).
Residuos radioactivos.
Residuos
generados
por
administracin,
limpieza
de
jardines, patios, reas pblicas,
restos de la preparacin de
alimentos.
Color de Bolsa
Rojo.
Amarilla
Negra
FUENTE: MINSA Norma tcnica: Procedimientos para el manejo de residuos slidos hospitalarios
(R.M. N217-2004/MINSA)
PRECAUCIONES UNIVERSALES
1. Lavarse siempre las manos con abundante agua y jabn.
2. Usar barreras de proteccin como guardapolvo largo, guantes, mascarilla, etc. y de ser posible llevar
el cabello recogido.
3. Evitar lesiones por agujas, bisturs y otros instrumentos cortantes durante los procedimientos y
limpieza del material utilizado.
4. Desinfectar, esterilizar y descartar adecuadamente los instrumentos despus de usarlos.
COMPETENCIAS
PRCTICA N 2
FUNDAMENTOS DE MICROSCOPA
El ojo humano con una visin en ptimas condiciones solo puede observar elementos cuyo tamao
sean mayores a 0,1 mm Para poder visualizar y catalogar las dimensiones por debajo de dicho
tamao, surgi la necesidad de crear instrumentos y tcnicas adecuadas que permitan explorar el
campo de la Biologa Celular. Por esta razn, aparecen en primer lugar las lupas y los microscopios
simples, muy tiles para el estudio de estructuras macroscpicas pero insuficientes para poder
realizar un estudio de estructuras celulares. Para cumplir con este fin, aparece el microscopio ptico
comn o microscopio compuesto. El microscopio ptico compuesto no es ms que un sistema ptico
de lentes convergentes que cumplen la funcin de aumentar la imagen de un objeto.
EL MICROSCOPIO PTICO
Parte mecnico y sus componentes:
Condensador: Lente o sistema de lentes de forma cnica que posee un sistema de dos lentes
convergentes que utilizan para hacer eficiente la iluminacin, de manera que la mayor parte de
los rayos luminosos de la fuente atraviesen el preparado y entren en el sistema ptico del
microscopio.
Ocular: es la lente o sistema de lentes ms cercana al ojo del observador, montada en un tubo
monocular o en dos tubos binocular. Las lentes llevan impreso el nmero de aumentos: 6X, 10X
y 15X; El ms comn es el de 10X. (X se lee por).
Objetivo: es la lente ms cercana al objeto a observar. En el revlver existen cuatro o cinco
objetivos montados de distintos aumentos. Estos llevan escrito el aumento que puede alcanzarse
con ellos, usualmente son de 4X, 10X, 40X, y 100X. Los cuatro primeros se denominan lentes
secos y la ltima, lente hmedo o de inmersin, ya que debe sumergirse en aceite de origen
sinttico cuyo ndice de refraccin sea prximo al del vidrio.
*Fuente de luz o lmpara. Los haces de luz pueden ser natural o artificial, cuando es natural (solar)
un espejo situado en la base del microscopio recoge la luz del medio y la refleja a travs del objeto
y del sistema de lentes. La luz artificial la constituye generalmente un foco de luz halgena
ubicado en el microscopio y conectado a un circuito elctrico de bajo voltaje (6 a 12V).
Joyce del Pino, Rafael Alvis, Danae Liviac, Gisella Guilln
ENFOQUE
Asegrese primero de que el microscopio est sobre una base slida y se encuentre conectado a
una toma de corriente elctrica.
Utilice siempre el objetivo de menor aumento (4X), para el primer enfoque de una muestra.
Encienda la fuente de luz, lleve el condensador a una distancia de 1 a 2 mm de la platina
Verifique que el diafragma est abierto y el objetivo perpendicular a la platina.
Coloque una de las lminas preparadas sobre la platina y asegrela con las pinzas del sistema de
desplazamiento que tiene la platina.
Procure que la muestra que va a ser observada se encuentre en el centro del orificio de la platina.
Gire el tornillo macromtrico hasta obtener una distancia de 1 a 2 cm entre el objetivo y la lmina
preparada. ESTA OPERACIN DEBE HACERLA SIN COLOCAR SUS OJOS SOBRE EL
OCULAR.
Ahora coloque los ojos sobre los oculares y mantngalos abiertos, ajuste el sistema de binoculares
a su distancia ocular, de modo que observe un solo y gran campo de luz.
Siga moviendo la platina hacia arriba utilizando el tornillo macromtrico hasta que visualice la
muestra en la lmina que prepar. Este enfoque se llama ENFOQUE GRUESO.
Empiece a girar, con los dedos pulgar e ndice de ambas manos, el tornillo micromtrico hasta
que pueda observar ntidamente la muestra, esto es el ENFOQUE FINO, que se ajusta a la visin
de cada observador.
Rote el revlver para cambiar de objetivo.
Manipule el tornillo micromtrico y enfoque nuevamente la muestra que est observando.
En el caso de que use el objetivo de inmersin, una vez que haya enfocado su muestra con el
objetivo de 40X, previo al cambio con el objetivo de 100X, se agrega una gota de aceite de cedro,
se ubica el objetivo y se enfoca la muestra usando el tornillo micromtrico con mucho cuidado.
COMPETENCIAS
1.
2.
3.
4.
5.
Tijeras
Lminas porta objeto y laminillas
cubre objeto.
Hoja de diario
PROCEDIMIENTOS
Preparacin de muestras:
Tome una lmina portaobjeto limpia, estas lminas y los cubreobjetos siempre debe tomarlos
por los bordes usando los dedos pulgar e ndice.
Con una navaja corte una lmina delgada de corcho, colquelo en el centro de la lmina
portaobjeto. Enfoque a 40X, 100X y 400X. Esquematice a 400X.
Repita la misma operacin en otra lmina y coloque esta vez la letra e minscula recortada de
un diario cualquiera. Asegrese de colocar la letra como usted la lee (e). Enfoque a 40X, 100X
y 400X. Esquematice a 40 y 100X
.
MARCO TERICO
El uso de determinados componentes colocados en el condensador o en los objetivos se interponen
al haz luminoso emitidos por la lmpara, filtrando u obstaculizando la luz y dan lugar a los distintos
tipos de microscopa ptica como la de campo claro, campo oscuro y contraste de fases. Estos tipos
de dispositivos en un microscopio de contraste de fases manipulan fsicamente los haces luminosos
seleccionando parte de las ondas de las que se compone dicho haz, lo que provoca una imagen
contrastada de la muestra sin necesidad de teirla. En el caso de la microscopia de fluorescencia, se
utiliza una lmpara que emite un haz luminoso fuera del rango de la luz visible y se aprovecha esta
propiedad de filtrar los haces de luz para poder manejar la longitud de onda que incide y emite una
muestra determinada mediante filtros. Actualmente, el microscopio de fluorescencia ms utilizado
es el de epifluorescencia, que simplemente indica que la luz filtrada no atraviesa la muestra sino que
incide sobre ella a travs de la lente objetivo, y esta misma lente es la encargada de recoger la luz
que emite la muestra excitada.
Otro tipo de microscopa es la Microscopa Electrnica, cuya principal virtud radica en la potencia
amplificadora que no posee un microscopio ptico, debido a que la microscopia ptica est limitada
por la longitud de onda de la luz visible (alrededor de 4000 ngstroms). En cambio un microscopio
electrnico utiliza electrones para iluminar un objeto, siendo la longitud de onda de un electrn de
0,5 ngstroms; razn por la cual en un microscopio electrnico se puede mostrar estructuras mucho
ms pequeas. La imagen que se produce es por la dispersin de los electrones, mientras que en el
microscopio ptico la imagen que se produce es por absorcin de los fotones. Es decir, la imagen
que se puede observar se debe a la diferente absorcin de la luz por las distintas estructuras de la
muestra, mientras que en el microscopio electrnico la formacin de la imagen est en funcin de la
dispersin y, por consiguiente, perdida de los electrones. Existen dos tipos bsicos de microscopios
electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM)
y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).
En el microscopio electrnico de transmisin (MET), la observacin de una muestra biolgica se
necesita realizar cortes histolgicos ultrafinos. Los haces de electrones se dirigen hacia el muestra
que se desea aumentar y uno de estos electrones que es emitido por la lmpara rebota o es absorbido
por el objeto y otros la atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra en estudio. Los
microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.
En un microscopio electrnico de barrido (MEB), las imgenes que se crean es una imagen ampliada
de la superficie de un objeto a observar. En este tipo de microscopio la ventaja que se tiene es que
no necesario realizar un corte del objeto en capas para poder observarlo, sino que se puede colocar
UTILIDAD
ptico de Fluorescencia
Electrnico de transmisin
Electrnico de barrido
MATERIALES
PROCEDIMIENTOS
PRCTICA N 3
PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA
CITOPLASMTICA. (SMOSIS)
Fuente: http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=Cell_Membranes_and_Compartments
La membrana celular es una estructura supramolecular que est presente en todos los tipos celulares.
Est constituida bsicamente por una bicapa fosfolpidica, en donde se insertan protenas (perifricas
o integrales). Algunas clulas pueden presentar carbohidratos asociados a lpidos y/o protenas,
encontrndoselas en la monocapa externa y en menor porcentaje.
La membrana celular rodea a las clulas dndole una individualidad, debido a que separa dos medios
acuosos: la regin intracelular llamada citoplasma y la externa o regin extracelular. Esta membrana
es un filtro, altamente selectivo, que controla la entrada de nutrientes y la salida de los productos
residuales, debido a esta propiedad es considerada como semipermeable.
En la actualidad se considera al modelo de Mosaico Fluido (Singer y Nicholson, 1972) como la
estructura bsica de las membranas. Este modelo propone que los lpidos se disponen formando una
verdadera bicapa que permite desplazamientos, donde las protenas integrales se insertan tomando
contacto con la superficie extra e intracelular. Uno de los conceptos bsicos de este modelo es que la
bicapa permite desplazamientos considerables de sus componentes. Por lo tanto, la doble capa no es
esttica, sino que es capaz de permitir y propiciar un movimiento a lo largo del plano estructural de
la membrana. Una de las caractersticas ms relevantes de la organizacin molecular de las
membranas es la asimetra de todos sus componentes, lo cual significa que en ambas mitades de la
bicapa los componentes se distribuyen de diferente manera.
Las funciones de la membrana son de transporte (el intercambio de materia entre el interior de la
clula y su medio externo), reconocimiento y comunicacin (gracias a molculas situadas en la parte
externa de la membrana, que actan como receptoras de sustancias.
Joyce del Pino, Rafael Alvis, Danae Liviac, Gisella Guilln
Fuentes: http://keepinapbiologyreal.wikispaces.com/Osmosis
Fuente: http://bio1100.nicerweb.com/Locked/media/ch04/tonicp.html
En Clula Animal
Fuente: http://catalog.flatworldknowledge.com/bookhub/4309?e=averill_1.0-ch13_s05
MATERIALES
MATERIALES DEL LABORATORIO
Goteros
Solucin NaCl 0.2% (0.015M)
Solucin NaCl 0.8% (0.15M)
Solucin NaCl 0.9%
Solucin NaCl 5% (0.3M)
3 beaker de 100 ml
Sacabocado
Balanza
Lanceta
Alcohol yodado
Algodn
Lminas portaobjetos
Laminas cubreobjetos
Hoja de afeitar
Plumn marcador
PROCEDIMIENTOS
1. Efecto de soluciones hipotnicas, hipertnicas e isotnicas en clulas vegetales (Elodea sp):
Colocar una hoja de Elodea sp sobre una lmina portaobjeto, colocar una gota de solucin salina
al 0.2%, rotular la lmina con el marcador y cubrir la muestra con una laminilla. Observar al
microscopio a 40X, 100X y 400X. Esquematice sus observaciones a 400X. Repetir el
procedimiento con las soluciones al 0.8 % y 5%. Esquematizar sus observaciones.
2. Efecto de soluciones hipotnicas, hipertnicas e isotnicas en clulas animales (glbulos
rojos). Limpiar y desinfectar con alcohol la pulpa del dedo anular. Punzar con la lanceta estril
y colocar en cada lmina portaobjeto una gota de sangre. A cada lmina agregar 1 gota de
solucin de NaCl: a la primera NaCl 0.9%; a la segunda, NaCl 0.2% y a la tercera, NaCl 5%.
Marcar cada uno de los preparados. Observar al microscopio y esquematizar a 400X.
3. Osmolaridad en las clulas vegetales: Se observar como los diferentes tipos de soluciones
afectan el equilibrio y el funcionamiento de las clulas vegetales. La osmolaridad se expresa
como moles de soluto por litro de solucin; mientras ms alta es la osmolaridad, mayor es la
concentracin de soluto.
Preparar 3 beakers de 40 mL rotulados para cada solucin. Usar un cortador cilndrico para sacar
1 cilindro de la papa de 5cm de largo. Cortar de cada cilindro 9 rueditas uniformes de
aproximadamente 5mm de grosor, separarlas en tres grupos y pesar cada grupo por separado y
tocar la textura inicial. Anotar los datos. Transferir a los vasos rotulados con las soluciones de
NaCl 0.015, 0.15 y 0.30M y anotar el tiempo en que se inicia Incubar por 30 minutos a
temperatura ambiente. Retirar cada grupo de rueditas de las soluciones en que estn sumergidas
a una hoja de papel secante. Anotar si hubo cambios en textura y pesarlas nuevamente. Analizar
y discutir los resultados.
PRCTICA N 4
PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA
CITOPLASMTICA
(DIFUSIN Y DILISIS)
DIFUSIN
Es el movimiento de molculas de una regin de alta concentracin a otra de menor concentracin
producido por la energa cintica de las molculas. Todas las molculas de gases y lquidos tienden
a moverse o difundirse en todas direcciones hasta que se encuentran distribuidas regularmente por
todo el espacio disponible.
La difusin no requiere gasto de energa por parte de la clula y por lo tanto es un movimiento pasivo.
La velocidad de difusin depende del tamao de las molculas y de la temperatura, la causa de la
difusin es el movimiento trmico de las molculas. Con el crecimiento de la temperatura de la
solucin, la velocidad de difusin, por lo comn, aumenta.
Fuente: http://en.wikipedia.org/wiki/Diffusion
Fuente: http://www.tutorvista.com/content/biology/biology-iii/biomembranes/physical-processes.php
Fig. 4. En la difusin, las molculas tienden a esparcirse y separarse lentamente con el tiempo. Las
molculas se mueven a favor del gradiente de concentracin.
Fuentes: The purification of proteins is an essential first step in understanding their function
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=stryer&part=A438
Fig. 5. En el proceso de dilisis, las molculas de bajo peso molecular son capaces de atravesar la
membrana semipermeable, movindose a favor del gradiente de concentracin.
COMPETENCIAS
1.
2.
3.
4.
MATERIALES
MATERIALES DEL LABORATORIO
40 ml de agua helada
40 ml de agua caliente
Reactivo de Biuret
Colorante Azul de Metileno
Nitrato de plata
Solucin de Lugol
40 ml de solucin de albmina 1.5%
40 ml de solucin de Cloruro de Sodio
al 30%
40 ml de solucin de almidn al 1%
Agua destilada
3 Beakers 100 ml
2 Beaker 500 ml
2 tubos de ensayo
Embudo
Navaja de afeitar
2 buches limpios de pollo
PRCTICA N 5
LA CLULA EUCARITICA Y PROCARIOTA:
RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS
La Teora Celular establece que todos los seres vivos estn constituidos por clulas, que todos los
seres vivos son la expresin de cada una de las clulas que lo constituyen, que una clula slo
proviene de una ya existente y que la clula es la unidad bsica de todo ser vivo. Se han identificado
hasta el momento dos tipos celulares: la clula procariota (que se caracteriza principalmente por que
el material gentico constituido por ADN desnudo y que se encuentra libre en el citoplasma celular),
y la clula eucariota (que se caracteriza porque el material gentico formado de ADN asociado a
protenas se encuentra separado del citoplasma por una membrana denominada membrana nuclear),
pero ambos tipos celulares comparten estructuras en comn: la membrana celular, el citosol o
hialoplasma, el citoesqueleto, los ribosomas y el material gentico.
La clula eucariota presenta mayor tamao y organizacin que la clula procariota y en su citoplasma
se encuentran estructuras celulares que van a cumplir diversas funciones que se conocen con el
nombre de organelas celulares, inclusiones citoplasmticas, sustancias ergsticas y/u otras
estructuras.
Las clulas procariotas son por lo general muy pequeas, con una estructura interna relativamente
muy simple. Casi todas las clulas procariotas estn rodeadas por una pared relativamente dura
llamada peptidoglucano. Son cosmopolitas. El citoplasma de la mayor parte de procariotas es en
apariencia relativamente homogneo. En general, el ADN est enrollado, adherido a la membrana
plasmtica y concentrada en una regin de la clula, llamada nucleoide. Los procariotas incluyen los
reinos Monera (simple bacterias) y Archaea. Carecen de las caractersticas "organelas" envueltas en
membrana subcelular de los eucariotas, pero pueden contener sistemas de membrana dentro de la
pared celular. Las clulas procariticas pueden tener pigmentos fotosintticos tales como los
encontrados en las cianobacterias ("bacterias azules"). Algunas clulas procariotas tienen flagelos
externos en forma de ltigo para la locomocin o pili como pelos para adherirse. Las clulas
procariotas tienen mltiples formas: cocos (redonda), bacilos (bastones), y espiralada o espiroquetas
(clulas helicoidales).
En la clula eucariota se pueden distinguir dos tipos de clulas, la clula eucariota animal y la clula
eucariota vegetal. Estas clulas tienen estructuras en comn como: la membrana celular, citosol,
citoesqueleto, retculo endoplasmtico, aparato de Golgi, mitocondrias y ncleo; pero tambin tienen
estructuras propias que las caracterizan, por ejemplo: la clula eucariota animal presenta centriolos
y estructuras locomotoras como los cilios y flagelos, mientras que las clulas vegetales se
caracterizan por la presencia de una pared celular compuesta principalmente carbohidratos y
plastidios que pueden tener o no pigmentos.
Todas las organelas celulares trabajan coordinadamente para el funcionamiento general y preciso de
la clula, muchas veces resulta difcil entender este proceso de forma dinmica y con todos las
estructuras celulares trabajando a la vez y en estrecha colaboracin logrando que la clula se
convierta en una mquina biolgica perfecta que cumple sus funciones vitales de forma precisa y
constante, convirtindose en la pieza base de los organismos multicelulares.
MATERIALES
MATERIALES DEL LABORATORIO
PROCEDIMIENTO
Coco
Gram+
Bacilo Gram-
1000 X
Ncleo, Nuclolo y pared celular: En una lmina portaobjeto coloque una gota de safranina o
azul de metileno y sobre ella un fragmento de catafilo de cebolla extrado con una pinza. El
fragmento tomado debe ser transparente y debe colocarse completamente extendido sobre la
lmina. Ponga una lmina cubreobjetos y sin aplicar presin elimine cuidadosamente el exceso
de lquido con ayuda de un papel secante. Observe al microscopio y esquematice sus
observaciones a 100X y 400X.
Nuclelo
Pared celular
Ncleo
400 X
400 X
Observacin de plastidios y ciclosis: Coloque una hoja de Elodeasp en una lmina, aadir una
gota de agua y observa al microscopio. Esquematice a 400X.
400 XX
400
Ncleo, citoplasma y mitocondrias: Con un hisopo estril haga un raspado de epitelio bucal y
estire la muestra en una lmina porta objeto y djelo secar a medio ambiente durante tres minutos.
Cubra la muestra con Verde de Janus y djelo reposar cinco minutos luego elimine el exceso de
colorante. Observe el citoplasma claro, limitado por la membrana, el ncleo ms teido y las
mitocondrias pueden ser observadas de color azul-verdoso. Esta coloracin se debe al sistema
citocromo-oxidasa, en cambio en el citoplasma el colorante es reducido a su leucobase.
Esquematice a 400X.
Mitocondria
Ncleo
Citoplasma
1000 X
Cilios y flagelos:
Observacin de cilios en Protozoarios: Coloca una gota del cultivo de Protozoarios sobre una
lmina portaobjeto y cbrala con una laminilla. Observe el movimiento de los cilios.
Cilios
1000 X
35
Observacin de flagelos: Coloque una lmina fijada de espermatozoides en el microscopio y
obsrvela a 1000x. Esquematice.
Flagelo
1000 X
ESPERMATOZOIDE HUMANO
Fuente: Laboratorio de Biologa. Universidad Cientfica del Sur
PRCTICA N 6
OBTENCIN Y ANLISIS DE FRACCIONES
CELULARES
Las diferentes metodologas utilizadas para el estudio de la composicin celular, entre ellas las
tcnicas bioqumicas, fisiolgicas y citolgicas. Permiten analizar en gran medida la anatoma y
localizacin de las estructuras y organelas celulares. Sin embargo, si se desea profundizar en la
funcionabilidad de cada componente celular se deben realizar ensayos bioqumicos y fisiolgicos.
Generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas con las distintas estructuras u
organelas.
Una de las tcnicas ms utilizadas para obtener dichas fracciones es el Fraccionamiento Celular, el
cual es un conjunto de procedimientos que tienen como principal objetivo obtener fracciones puras
o enriquecidas de un determinado componente celular, ya sea ste una organela como el ncleo,
mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, etc. Y dependiendo del estudio que se desee elaborar la
fraccin celular tambin puede estar compuesta por restos de membrana celular o por complejos
multiproteicos como el citoesqueleto de actina, microtbulos y poros nucleares.
Todo proceso de Fraccionamiento Celular tiene tres etapas:
CENTRIFUGADO (purificacin)
Una vez que se tienen todos los componentes celulares libres, es necesario separarlos en fracciones,
es decir, realizar su fraccionamiento y el mtodo ms utilizado para este fin es la centrifugacin de
gradiente de densidad o tambin el de centrifugacin diferencial; cuando los diferentes componentes
celulares se encuentran suspendidos en un lquido, tienden a sedimentar hacia el fondo por el efecto
de la gravedad. Para acelerar este proceso, se puede colocar a un tubo conteniendo esta suspensin
en un rotor giratorio, de forma de someter a las partculas a una fuerza centrfuga.
COMPETENCIAS
1.
2.
3.
4.
5.
MATERIALES:
MATERIALES DEL LABORATORIO
Mortero
Gasa
Tubos ependorf de 1,5mL
2 beaker de 100 ml
Verde de Janus
Cubetas con hielo
1 beaker de 50 ml
PROCEDIMIENTO
1. Colocar el hgado en el mortero, asegrese de moler bien y de extraer los ligamentos
conjuntamente con la grasa. Realice una pasta uniforme del hgado y seguidamente adicione
20 ml de la solucin Tris 10 mM pH 7,5. Con una gasa filtre en un beaker limpio.
2. Transvasar 250 l del extracto a 2 tubos eppendorf y agregue 500 l de la solucin de buffer
Tris 10 mM pH 7,5. Rotulndose con la palabra ncleo. Centrifugue a 3000 rpm durante 3
minutos. (El pellet que ha quedado se denomina fraccin nuclear y resuspender en 200 l de
Tris 10 mM pH 7,5).
3. Coloque el sobrenadante del proceso anterior a 2 ependorf nuevos y mrquelos con la palabra
mitocondrias. Centrifugar a 10000 rpm durante 8 minutos. (El pellet que ha quedado se
denomina fraccin mitocondrial, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l
de buffer Tris 10 mM pH 7,5).
4. Ahora observaremos la fraccin nuclear. Para ello colocamos 10 l del resuspendido del
tubo marcado como ncleo, en una lmina porta objeto y le adicionamos una gota de Azul
de metileno y cubrir con una lmina cubreobjeto. Hacer las observaciones en el microscopio
de campo claro y realice sus esquemas. En otra lmina adicionar 10 l del colorante Hoechst
33258 y cubrir con una lmina cubreobjeto., dejar reposar por 2 min. Observe en el
microscopio de fluorescencia y realice sus esquemas.
5. Observacin de mitocondrias. Tomar el tubo marcado como mitocondrias y en un ependorf
de 0,5 ml adicione 5 l del resuspendido y 5 l del colorante mytotracker dejndolo incubar
por 10 min a 37C. En otro ependorf de 0,5 l realice la misma operacin y adicione 5 l del
colorante verde de Janus. Realice un frotis y observe al microscopio de fluorescencia y de
campo claro. Esquematizar a 400X
PRCTICA N 7
METABOLISMO CELULAR: PROCESO DE
RESPIRACIN CELULAR
Posteriormente a los mecanismos de nutricin y digestin celular, las clulas usan las molculas
producto de estos procesos como fuente para la elaboracin de energa que es necesaria para la
actividad celular, para lo cual pasan procesos como la desaminacin de los aminocidos, la betaoxidacin de los cidos grasos y la gluclisis que tienen como objetivo la formacin de cido pirvico
y otras molculas necesarias para los proceso de respiracin celular. El cido pirvico obtenido de
estos procesos, principalmente de la gluclisis, puede dependiendo del individuo y del medio en el
cual se encuentra ir a dos rutas metablicas:
La ruta aerbica denominada tambin catabolismo aerobio degradndose completamente hasta CO2
y agua, este mecanismo se realiza en las mitocondrias que actan como centrales energticas de la
clula y sintetizan ATP producto de esta degradacin.
La otra ruta mencionada es el proceso anaerbico llamada tambin catabolismo anaerbico, que en
ausencia de oxgeno transforma el cido pirvico en otras molculas degradndose parcialmente, esta
ruta tiene dos procesos ms estudiados: el catabolismo lctico que por accin de la lactato
deshidrogenasa se transforma en cido lctico y la va alcohlica donde el cido pirvico se
descarboxila formando un acetaldehdo y este es reducido por accin del NADH a alcohol etlico.
Este ltimo tipo de fermentacin la realizan algunas especies de levaduras como la Saccharomyces
cerevisae que son utilizadas en la industria de la panificacin y en la industria cervecera, estas
levaduras tienen la capacidad de poder realizar los dos tipos de respiracin dependiendo de la
abundancia de nutrientes en el medio, cuando se encuentran en un medio rico en carbohidratos
escogen la ruta anaerbica.
En la presente prctica, utilizando un respirmetro artesanal, se observar la accin de diferentes
carbohidratos como facilitadores en el proceso de respiracin celular anaerbica y la accin de un
antimetabolito que interferir en el proceso de respiracin celular inhibiendo una de las etapas de la
gluclisis.
La accin del inhibidor sobre la respiracin celular: La enzima enolasa cataliza la reaccin que
convierte el 2 fosfoglicerato (2PG) en fosfoenolpiruvato (PEP), la enolasa para reaccionar requiere
de la presencia de iones de magnesio que mantiene su estructura y de iones manganeso como
cofactor. En el siguiente experimento se usar el flor para precipitar los iones magnesio y as inhibir
la reaccin. Esta inhibicin se puede detectar como una disminucin en la velocidad del proceso
respiratorio, (disminucin en la produccin del CO2) en las clulas de levadura. Debido a que los
fluoruros son extremadamente venenosos para los humanos, maneje las soluciones con sumo cuidado
en este ejercicio y asegrese de lavarse las manos tan pronto como termine.
1
3 mL
5 mL
2
3mL
3 mL
3 mL
3mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
RESULTADOS
TABLA DE RESULTADOS MUESTRA 1
TUBO
Longitud Inicial
(mm)
Longitud Final
(mm)
( L. Final L. Inicial)
(Produccin de CO2)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
TUBO
Longitud
Inicial (mm)
Longitud Final
(mm)
( L. Final L. Inicial
(Produccin de CO2)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
PRCTICA N 8
EXTRACCIN DE ADN
La biologa molecular es una de las herramientas ms tiles de las que se vale hoy en da la ciencia
y la medicina moderna, la extraccin de ADN es un tipo de metodologa que mediante la
manipulacin del material gentico ha permitido, entre otras cosas, el desarrollo de la clonacin de
secuencias de ADN para el estudio de mutaciones que estn involucradas en las diferentes patologas
humanas, mapeo y secuenciacin de genes con fines teraputicos. Con este conocimiento se logra el
desarrollo de la terapia gentica, el anlisis de diversidad molecular de especies, anlisis forenses y
de paternidad.
COMPETENCIAS
1. Extrae ADN a partir de muestras biolgicas.
2. Conoce las diferentes tcnicas de aislamiento de ADN.
3. Analiza cada proceso de la tcnica de aislamiento de ADN.
Puntas de 10 -100 l y de
100 -1 000 l
Tubos ependorf de 1,5 mL
Microcentrfuga16000 rpm
Vortex.
PROCEDIMIENTO
Extraccin de ADN usando kit de extraccin Purelink-genomic (Invitrogen)
Extraccion de ADN de sangre Total.
1. A un tubo ependorff, adicionar una muestra de 20 l de sangre fresca o congelada.
2. Transferir 20 l de clulas o sangre a un tubo que contiene 20 l proteinasa K.
3. Aadir 20 l de RNasa a la muestra. Someter a vrtex por 15 segundos e incubar a temperatura
ambiente durante 2 min.
4. Aadir 100 l de Buffer lisis y homogenizar utilizando vrtex por 15 segundos.
5. Incubar a 55 C durante 10 min.
6. Aadir 100 l de etanol 96-100%. Mezclar en el vrtex por 15 segundos.
7. Incubar la lisis por 5 min a temperatura ambiente.
Proceso de purificacin:
1. Colocar la lisis (260 l) en la columna de extraccin.
2. Centrifugar la columna a 8500 rpm por 1 min, descartar el filtrado por la columna y colocar la
columna en un nuevo tubo de lavado.
3. Lavar la columna con 200ul de buffer de lavado, centrifugar a 8500 rpm por 1 min y eliminar el
filtrado.
4. Colocar la columna en un nuevo tubo de lavado, adicionar 200ul de buffer de lavado y centrifugar
la columna a velocidad mxima por 3 min para poder filtrar cualquier residuo del buffer de lavado.
5. Colocar la columna en un nuevo tubo de recoleccin (1,5ml).
6. Aadir 100 l de Buffer de elucin a la columna.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar la columna a velocidad mxima
durante 1 min a temperatura ambiente.
8. Para recuperar ms ADN, realizar una segunda etapa de elucin utilizando el mismo volumen de
buffer de elucin (opcional)
9. Incubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar a velocidad mxima por 1 min (opcional)
10. El tubo contiene ADN genmico purificado.
11. Almacenar el ADN purificado a -80C para otras aplicaciones.
MATERIALES
Extraccin del ADN
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo ependorf de PCR colocar 1 l de la muestra en 199 l de buffer.
2. Calibrar el Qubit segn se indique el manual.
3. Medir las todas las muestras y anotar los resultados y comparar los resultados.
PRCTICA N 9
FUNDAMENTOS DE LA REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR)
Y
USO ENZIMAS DE RESTRICCIN
La reaccin en cadena de la polimerasa, cuyas siglas en ingles son PCR (Polymerase Chain Reaction)
es una tcnica muy usada en el campo de la biologa molecular, la cual fue desarrollada por Kary
Mullis en 1986. El objetivo de esta tcnica es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de
ADN particular mediante una amplificacin in vitro. Es una tcnica de amplificacin selectiva, la
cual se basa en la capacidad de la enzima ADN polimerasa en fabricar una cadena de ADN
complementaria a una ya existente.
Para realizar la tcnica de PCR se necesita de:
Desoxinucleotidostrifosfato (dNTPs), mezcla de los cuatro Desoxinucleotidos que son el
sustrato para la sntesis del nuevo ADN.
Cebadores (primers),oligonucletidos complementarios a una de las hebras del ADN,
delimitando la zona de ADN que se quiere amplificar.
ADN polimerasa, enzima termoestable (Taq polimerasa) que se encarga de la sntesis de la
cadena de ADN.
ADN molde, molcula que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Solucin tampn o buffer, solucin que permite el adecuado funcionamiento de la ADN
polimerasa.
Iones divalente (Mg++)
Cada ciclo de PCR consiste en tres etapas: la primera, donde el ADN molde es incubado a altas
temperaturas para desnaturalizarlo y de esta manera permitir el fcil acceso de los cebadores al ADN
molde; la segunda o etapa de alineamiento, donde los cebadores hibridan con sus secuencias
complementarias del ADN molde y por ltimo, la etapa de elongacin en la cual la ADN polimerasa
sintetiza de los fragmentos de ADN a partir de los cebadores que ya se han alienado. La deteccin del
producto de una PCR se realiza normalmente mediante una corrida electrofortica.
Es por eso que el PCR es una herramienta que se ha desarrollado para ofrecer una alternativa para el
estudio del ADN. Debido al impacto dentro de la comunidad cientfica porque ofrece las siguientes
cualidades.
Sensibilidad: hace referencia a la mnima cantidad de ADN que es necesario para que se
produzca la amplificacin.
Especificidad: solo se obtiene un solo producto amplificado.
Eficiencia: amplificacin mxima que se puede obtener en un nmero determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificacin.
Termociclador
Agua estril
Muestras de ADN
Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs,
primer, Mg, agua)
Primers Alfa tubiluna y Beta actina.
PROCEDIMIENTO
1.
Componente
Desnaturalizacin
94C por 1 min
4.
Hibridacin
52C por 1 min
Elongacin
72C 30 seg
N de ciclos
30
Mantener a
4C
Finalizada el proceso de amplificacin, retirar los ependorf del termociclador y guardar las muestras a
4C si el amplificado se llegara a utilizar en un lapso de poco tiempo. Si no fuese el caso mantener a
20C.
Cortar el ADN con enzimas de restriccin es frecuentemente el primer paso a seguir de los
investigadores para el estudio de un gen. La piedra angular de la biotecnologa del ADN
recombinante son un tipo de endonucleasas denominadas enzimas de restriccin. Aisladas en
organismos procariotes (bacterias), reconocen y escinden secuencias especficas de ADN de una
longitud de unos 4 o 12 pb., lo que constituye un mecanismo de defensa de las clulas bacterianas
contra las infecciones de fagos al degradar su genoma. Estas enzimas de restriccin reciben su
nombre de acuerdo al al organismo del cual son aislados. Es por eso, que la enzima EcoRI proviene
de Escherichiacoli, de donde fue aislada por Herbert Boyer en 1969; y donde corta al ADN entre
guanina (G) y la adenina (A) en la secuencia de bases GAATTC.
Existen tres tipos de enzimas de restriccin, las del tipo I, II y III. Las enzimas I y III realizan el corte
en el ADN a cierta distancia en forma aleatoria, lo cual es poco aprovechable y recomendable para
realizar trabajos de investigacin. Las de tipo II cortan con absoluta precisin dentro de las secuencias
reconocidas, este es el caso de EcoRI y la mayora de las enzimas que se utilizan en trabajos de
investigacin. La forma en que corta la enzima EcoRI es de manera escalonada, estos fragmentos
dejan extremos de cadena sencilla que denominamos extremos cohesivos que pueden unirse por
complementariedad a otros extremos cohesivos mediante puentes de hidrgeno.
COMPETENCIAS
1. Describe las funciones de las enzimas de restriccin.
2. Conoce cmo las enzimas de restriccin cortan el ADN.
3. Comprende que el ADN es cortado con diferentes enzimas de restriccin como EcoRI.
MATERIALES
Digestin del ADN con enzimas de restriccin
PROCEDIMIENTO
1. Para la digestin con las enzimas de restriccin se toman 5 ul del ADN amplificado y colocar en
un tubo ependor de 250 l.
2. EcoRI: Adicionar 2 l de buffer EcoRI, 1 l de enzima EcoRI y 12 l de agua destilada.
3. Incubar por 12 horas a 37C.
4. Guardar el ADN digerido a 4C. si el amplificado se llegara a utilizar en un lapso de poco tiempo.
Si no fuese el caso mantener a 20C.
PRCTICA N 10
FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS
La electroforesis en gel es una tcnica molecular muy utilizada con la cual se puede observar la
concentracin e integridad del ADN (extrado o producto de PCR), protenas y otras biomolculas.
La electroforesis va a permitir la separacin de molculas como protenas y cidos nucleicos a travs
una matriz tamponada de pH 8, la cual va a funcionar como un filtro o matriz molecular permitiendo
separar molculas en un campo elctrico, de acuerdo al tamao o peso molecular, la carga neta y la
estructura tridimensional que poseen. Por lo cual, molculas de ADN de tamao diferente van a
emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis; siendo la distancia recorrida por cada fragmento
de ADN inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Los materiales usados como
soporte son los polmeros como la agarosa o la poliacrilamida, papel (celulosa), almidn y acetato
de celulosa.
Los cidos nucleicos (ADN, ARN) estn cargados negativamente debido a los grupos fosfatos, por
lo cual cuando se aplica una corriente elctrica a una matriz de gel que contiene las muestras de
cidos nucleicos que se encuentra en una solucin a pH neutro o bsico, entonces los fragmentos de
cidos nucleicos migrarn hacia el polo positivo, nodo.
La separacin de los fragmentos de ADN por electroforesis se regula a travs de la concentracin de
agarosa (o poliacrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la corrida electrofortica; por lo
tanto, los fragmentos de menor tamao migran ms rpido hacia el nodo que aquellos de mayor
tamao y el incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migracin de los
fragmentos en el gel.
La poliacrilamida es un soporte muy usado cuando se realiza una electroforesis de muestras de cidos
nuclicos debido a que es transparente, elstico, tienen una porosidad controlable y permiten una
buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Los geles de poliacrilamida se
forman por polimerizacin de la acrilamida con la bisacrilamida. Estos geles suelen emplearse
cuando los fragmentos de ADN que van a ser visualizados son de bajo peso molecular (menos de
1000 pares de base), mientras que para fragmentos de mayor peso molecular se emplea los geles de
agarosa.
El tamao del poro formado por el gel depende de la concentracin de los acrilamida: a mayor
concentracin, menor tamao del poro y se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del
gel permitiendo de esta manera obtener una mayor resolucin en los fragmentos pequeo. Una
desventaja que posee la acrilamida sobre la agarosa es que es un compuesto txico pero su poder de
resolucin es mayor. Todas las molculas de ADN al tener carga negativa van a migrar hacia el polo
positivo pero al entrar en los polos del gel, las molculas ms grandes van a tener un movimiento
ms lento debido a su dificultad para pasar entre los poros, mientras las molculas ms pequeas lo
hacen ms rpidamente y llegan antes al polo positivo.
Una electroforesis tpica consiste en preparar un gel de acrilamida a una determinada concentracin,
mezclar las muestras que se van a analizar con un colorante adecuado que va permitir el frente de
corrida de la electroforesis, colocar las muestras en el gel, realizar la corrida electrofortica y por
COMPETENCIAS
1. Aprecia la tcnica de electroforesis en gel.
2. Comprende los conceptos que estn involucrados en la separacin de cidos nucleicos en una
corrida electrofortica.
3. Observa la muestra de ADN aislada de la prctica anterior.
MATERIALES
52
Buffer Tris borato EDTA 1X
(TBE) pH 8-8.3.
Buffer carga para ADN.
Solucin de fijadora al 10% para
tincin con plata
Solucin de tincin de nitrato de plata
al 1%.
Solucin de revelado para tincin con
plata
PROCEDIMIENTO
Armar los geles de poliacrilamida al 8%, dejar polimerizar por 10 min aproximadamente.
Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque (cmara
electrofortica) con el buffer TBE 1X para ADN. Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estn totalmente saturados de buffer.
Sobre un pedazo de lmina extensible de parafina, preparar una mezcla de 1 l ADN con 1l
de buffer cargas repartidas en alcuotas de acuerdo al nmero de muestras que se colocarn
en los pocillos (considerar el uso de un marcador de peso molecular estndar de ADN).
Finalizada la colocacin de las muestras ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y
conectar los cables de los electrodos en la fuente de poder. Encender la fuente de poder y
proceder a seleccionar el voltaje adecuado (puede estar comprendido entre 75 a 120 voltios).
Remover el gel de uno de los vidrios, para realizar este proceso se requiere tener mucho
cuidado, pues el gel de poliacrilamida es muy frgil y puede romperse con facilidad.
Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tincin con nitrato de plata.
53
Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua destilada
y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37 C.
Retirar el gel del recipiente y colocar el gel en la solucin de tincin, agitarlo constante
durante 5 - 7 minutos.
PRCTICA N 11
CICLO CELULAR: MITOSIS
Fuente: http://esperanzacuartoeso.blogspot.com/
Las clulas se generan a partir de otras clulas y la nica forma de producir ms clulas es por divisin
de las ya existentes. Este ciclo de reproduccin celular en el cual la clula duplica su contenido
(duplicacin) y luego se divide en dos (divisin) es conocido como ciclo celular. Este proceso se
divide en dos fases: INTERFASE Y DIVISIN CELULAR
LA INTERFASE, se divide en:
G1, llamada la fase de crecimiento, se inicia con una clula hija que proviene de la divisin
celular anterior. Se produce mucha actividad en la clula, la cual aumenta de tamao,
sintetiza nuevo material citoplasmtico sobre todo protenas y ARN, los cuales se necesitaran
para continuar con el ciclo celular.
S, o fase de sntesis de ADN, es la fase en que tiene lugar la duplicacin del ADN. Cuando
acaba este periodo el ncleo contiene el doble de protenas nucleares y de ADN que con el
que haba iniciado, cada cromosoma ahora tiene dos cromtidas hermanas.
G2, o segunda fase de crecimiento, en ella se sigue sintetizando ARN y protenas que se
necesitaran para la fase de mitosis. El final de este periodo queda marcado por la aparicin
Cariocinesis
MITOSIS
La mitosis es la fase del ciclo celular en el cual las molculas replicadas de ADN durante la Interfase,
se reparten el material nuclear (cariocinesis), dando lugar a la formacin de dos ncleos hijos con la
misma dotacin gentica entre s y que la clula que las dio origen. Al final de la mitosis suele
acompaarse por un proceso de citocinesis, que es la divisin del citoplasma en dos, permitiendo que
se formen dos clulas hijas. Esta cariocinesis ocurre en clulas somticas.
Gracias a este proceso de divisin celular, las clulas son capaces de multiplicarse, participar en
procesos de desarrollo, de crecimiento y de regeneracin celular.
La mitosis se puede dividir en cuatro etapas: profase, metafase, anafase, telofase, cada una de ellas
caracterizada por una serie particular de sucesos.
Profase. En esta fase, los cromosomas duplicados se preparan para la separacin y la maquinaria
mittica se ensambla. El material gentico se condensa permitiendo observar los cromosomas como
filamentos dobles (cromtidas hermanas) unidos por un estrangulamiento (centrmero). Al final de
la profase han desaparecido la membrana nuclear y el nuclolo.
1000 X
Metafase. Los cromosomas estn alineados en la placa ecuatorial de la clula (placa metafsica), en
la parte media entre los dos polos. Las cromtidas de cada cromosoma estn conectadas por su
cinetocoro con las fibras del huso, los cuales son jalados hacia los extremos.
1000 X
1000 X
Telofase. Durante la telofase las clulas hijas regresan a la condicin de Interfase. Las cromtidas
llegan a los polos y comienzan a descondensarse, en esta fase donde se reconstruye la membrana
nuclear alrededor de cada conjunto cromosmico lo cual definir los nuevos ncleos hijos.
1000 X
Fuentes: MITOSIS
http://www.etitudela.com/profesores/rma/celula/04f7af9d590edee08/04f7af9d5f0dc0808/04f7af9d5f0dc3a0a/index.html
PROCEDIMIENTO
1. Llevar la lmina al microscopio, localizar las clulas que presentan estructuras filamentosas
intensamente teidas e identifique las fases de la mitosis. Esquematizar sus observaciones.
Fuente: Mitosis
http://www.bio.miami.edu/dana/250/25009_4print.html
PRCTICA N 12
CICLO CELULAR: MEIOSIS
Fuente: http://ptbestaribiology.blogspot.com/2011/05/what-is-meiosis.html
La MEIOSIS es un tipo de divisin celular por el cual la dotacin cromosmica queda dividida
exactamente por la mitad. En este proceso, dos divisiones celulares sucesivas (DIVISIN I Y
DIVISIN II) ocurren despus de un ciclo de replicacin de ADN dando lugar a cuatro clulas
haploides a partir de una diploide.
Esta divisin ocurre en clulas germinales, que se localizan en los rganos reproductores, las
gnadas, y cuya funcin es la formacin de clulas sexuales o gametos, los que se forman al
dividirse por meiosis.
DIVISIN MEITICA I (reduccional). Se divide en:
Profase I. Fase ms compleja y larga de la Meiosis, la cual se subdivide 5 fases:
59
Diacinesis. Los quiasmas se desplazan hacia los extremos del bivalente, fenmeno llamado
TERMINALIZACIN. Los cromosomas se unen a las fibras del huso.
Anafase I. Los cromosomas homlogos (ttradas) se separan totalmente y se mueven hacia polos
opuestos guiados por las fibras del huso. Desaparecen los quiasmas.
Telofase I. Los cromosomas se ubican en cada polo de la clula. Los cromosomas empiezan a
condensarse, se forma la envoltura nuclear, dando lugar a ncleos que poseen un nmero haploide
de cromosomas, cada uno formado por dos cromtidas.
Fuentes: Meiosis
http://www.tokresource.org/tok_classes/biobiobio/biomenu/meiosis/index.htm
DIVISIN MEITICA II (ecuacional). Esta divisin se bsicamente una divisin mittica, pero
sin ninguna replicacin de ADN. Este proceso de divisin ocurre de manera simultnea en ambas
clulas hijas, resultado de la primera divisin. Se divide en cuatro fases:
Profase II. Comienza a desaparecer la envoltura nuclear y el nuclolo, la cromatina comienza a
condensarse, los centriolos se desplazan hacia los polos, se forma el huso.
Metafase II. Las fibras del huso se unen a los cinetocros de los cromosomas y los dirigen hacia el
plano ecuatorial de la clula.
Telofase II. Cada uno de los polos recibe un juego haploide de cromosomas, se forman los nuevos
ncleos.
Citocinesis Que origina cuatro clulas, cada una con nmero haploide de cromosomas (n) y
constituidas de una sola cromtide. Estas clulas formarn los gametos.
Fuentes: Meiosis
http://www.tokresource.org/tok_classes/biobiobio/biomenu/meiosis/index.htm
COMPETENCIAS
1. Identifica las fases de la Meiosis
2. Reconoce la importancia de la Meiosis en la variabilidad gentica
3. Investiga las consecuencias genticas de la Meiosis
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1. Llevar la lmina al microscopio e identificar las fases. Esquematizar sus observaciones.
LEPTOTENO
1000 X
ZIGOTENO
1000 X
PAQUITENO
1000 X
DIPLOTENO
1000 X
DIACINESIS
1000 X
1000 X
METAFASE I
1000 X
ANAFASE I
1000 X
TELOFASE I
1000 X
PROFASE II
1000 X
1000 X
METAFASE II
ANAFASE II
1000 X
1000 X
TELOFASE II
CITOCINESIS
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Audesirk T, Audesirk G y Byers B. Biologa: la vida en la tierra. 6ta ed. Mxico: Pearson
Educacin; 2003.
Curtis H, Barnes N, Schnek A y Massarini A. Biologa. 7ma ed. en espaol. Buenos Aires.
Editorial Mdica Panamericana. 2008.
De Robertis E, Hib J y Ponzio R. Biologa celular y molecular. 12ava ed. Buenos Aires:
Editorial El Ateneo; 1997.
Karp G. Biologa celular y Molecular. 4ta ed. Mxico D.F: Mc Graw Hill Interamericana;
2005.
Solomon E, Berg L, Martin D y Villee C. Biologa de Villee. 4ta ed. Mxico D.F: Editorial
Mc Graw Hill Interamericana; 1998.