Practicas Microbiologia.2015ok Casa

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA
QUMICA
GUA DE PRCTICA
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
AREQUIPA PER
2015
PROLOGO
El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud es
indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud
humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el
ilimitado campo de los bioprocesos.
Los microorganismos han demostrado ser un enorme
potencial para la elaboracin de infinidad de productos tiles al
hombre, en la generacin de procesos productivos con menor
contaminacin del medio ambiente y con consumos de energa
muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones
genticas para que puedan producir sustancias diversas de gran
necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que
a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos
bioprocesos.
El conocimiento de la microbiologa se hace imperioso para
su aplicacin a diversas disciplinas del saber humano. La
presente Gua de Prctica se ha desarrollado con el objeto de
poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las
tcnicas bsicas del manejo de Microorganismos en laboratorio
para estudiantes de Ingeniera Qumica.
Los Autores
NDICE
PROLOGO
NDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES...........................................................
PRCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA............................................
PRCTICA 2 : MICROSCOPIA;
OBSERVACIN
DE
MICROORGANISMOS IN VIVO, COLORACION VITAL..........

PRCTICA 3 : PREPARACIN
DE
UN
FROTIS
BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL...........................

PRCTICA 4 : COLORACIONES
ESPECIALES:
TINCION
MORFOLOGIA DE HONGOS....................................................
PRCTICA 5 : EQUIPO
MATERIAL
DE
LABORATORIO,
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN .......................

PRCTICA 6 : PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ............................
PRCTICA 7 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS......................................
PRCTICA 8 : CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS..........................................................................
PRCTICA 9 : CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO.............................
PRCTICA 10 :...................CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS
67
PRCTICA 11 :.............AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE
DILUCIN EN PLACA..............................................................
PRCTICA 12 :..........................AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
74
PRCTICA 13 :................................ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS
CONTAMINADAS....................................................................
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

DIFERENTES PRCTICAS ...........................................................................
BIBLIOGRAFA...............................................................................................
Recomendaciones Generales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia,

despus de este tiempo, no se permitir al acceso al
laboratorio
Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y
abotonarla completamente, slo podr quitrsela al salir de
ste.
Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas,
las mochilas debern ser colocadas en los cajones de las
mesas de trabajo.
No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn
objeto a la boca.
Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de
usarla.
No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber
efectuarse sentado y en su equipo de trabajo.
Hablar slo lo necesario con los compaeros.
Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es
lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor.
Si hay necesidad de llevar material biolgico para la
realizacin de la prctica, es necesario conseguirlo de lo
contrario la prctica se suspender para todo el equipo.
El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber
esterilizarse en la flama del mechero, antes y despus de
su uso.
Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
En
caso
de
derramar
material
que
contenga
microorganismos, cbralo con fenol o benzal y deje actuar
diez minutos y de aviso al profesor.
Todo el material que se va a incubar o desechar, debe
colocarse en el sitio indicado por el profesor.
Etiquete todo el material que va a incubar con los
siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material
e iniciales del nombre del alumno.
Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del
material para eliminar microorganismos que pudieran
hacernos dao a nuestra salud.
Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del
laboratorio.
Es obligacin de cada equipo entregar todo el material
limpio.
PRCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
Aprender las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio

Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
Identificar cada una de las partes del microscopio ptico, conocer su
funcin y el cuidado de cada uno de ellas.
Dominar el mecanismo de iluminacin, la observacin de una muestra
con todos los objetivos.
II. MARCO TEORICO

2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido comn que
tienen la finalidad de proteger la salud, la integridad fsica, la seguridad de las
personas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biolgicos
fsicos, psicolgicos y mecnicos.
2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD
Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente
en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no
previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas
precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se est dentro
del laboratorio
Precauciones estndar: comprende las medidas a tomar para evitar la
contaminacin de una persona, evitando la exposicin directa a sangre y
otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante
el uso de barreras, es decir mediante la utilizacin de materiales adecuados
que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras por
ejemplo guantes no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero
disminuyen las consecuencias de dicho accidente
2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR
- Barreras de proteccin
- Lavado de manos
7
Desinfeccin y esterilizacin.
Manejo de objetos punzo cortantes.
Manejo y eliminacin de desechos
Ventilacin e iluminacin adecuadas
Limpieza y desinfeccin de ambientes
2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN

1. La boca
Comer, beber y fumar en el laboratorio.
Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de
proteccin.
2. La piel
Cortaduras o rasguos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o
utensilios contaminados (lpices, bolgrafos, etc.).
3. Los ojos
Salpicaduras de materiales infecciosos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos
contaminados.
4. Los pulmones
Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).
2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION
- Lavado de manos (antes y despus)
- Guantes
- Mascarilla o barbijo
- Mandil
- Gorro
2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD
Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y
otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.
Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe

permanecer completamente cerrado.
Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar

y al finalizar la sesin prctica.
Lavar las manos con agua y jabn:
antes de realizar las actividades programadas
antes de salir del laboratorio
despus de usar materiales contaminantes.
Recoger el cabello largo.
Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo

lo indispensable.
No comer, beber, fumar.
Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de

iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna
duda, dirjase al profesor.
Usar mascarillas para casos indicados
2.2 MICROSCOPIA
8
El microscopio permite la observacin de estructuras muy pequeas que

no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolucin de un
microscopio est en relacin inversa a la longitud de onda de la luz usada.
2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. Parte mecnica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revlver
- Tornillo macromtrico o sistema de movimiento rpido
- Tornillo micromtrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de lminas y mandos coaxiales
- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo
porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo
2. Parte ptica del Microscopio:
- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes caractersticas:
o Magnificacin: Ej. x 25
o Apertura numrica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo
Planacromtico
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Correccin de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminacin. comprende: Espejo, Condensador,
Diafragma
2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina
porque deteriora el tornillo micromtrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente
para observar sin fatiga Verificar que los oculares estn limpios y en
posicin correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del
M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no
posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas
oin vivo debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revlver estn en orden progresivo
de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico girando el
revlver hasta que haga clik.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de
la platina y abra el diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si
tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al
fluorescente ms cercano.
8. Observe por el ocular la iluminacin del campo y trate de lograr la
mxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje
ligeramente el condensador.
9
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la

laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la
derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el
condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz.
Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observacin, emplee siempre el objetivo de menor
aumento (panormico 10X) y procure que la distancia objetoobjetivo sea la mnima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el
tomillo macromtrico y observando por un lado del Microscopio el
descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y
simultneamente suba al tubo con el tomillo macromtrico hasta
enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo
micromtrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la
lmina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observacin
integral, siempre utilizando el tomillo micromtrico para no perder
la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al
utilizar el tomillo macromtrico, la distancia objeto-objetivo debe ser
de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de
contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el
centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema de
revlver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento
(45X) y NO el de inmersin. Ponga ntida la imagen nicamente con
el tomillo micromtrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a
otro no debe manipularse con el tomillo macromtrico porque corre
el riesgo de romper la lmina o la lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersin, coloque el
elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el
objetivo, de manera tal, que quede libre ste sector de lmina para
que pueda colocarse una gota de aceite de inmersin. Luego,
contine girando el revlver hasta que el objetivo de inmersin
(100X) contacte con la gota y encaje en el eje ptico; finalmente,
observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo
micromtrico.
Una vez terminada la observacin limpie el objetivo de inmersin y
la lmina con el campo ligeramente humedecido con alcohol
isoproplico o metanol.
2.2.3.AUMENTOS
DEL
MICROSCOPIO
Y
CLCULO
APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento
del objetivo por el del ocular.
Ej.:
Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el clculo aproximado de dimensiones celulares, se debe
conocer el dimetro del campo microscpico que vara de acuerdo al
objetivo que se usa.
Dimetro del campo microscpico
10
Ocular
Objetivo
10X
10X
10X
10X
45X
100X
Ejemplo:
Dimetro del
campo en micras
1500
400
150
Si observamos una clula epitelial al Microscopio con

objetivo 10X y ocular 10X, y si sta ocupa la tercera
parte del campo microscpico, concluiremos que la
clula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la
tercera parte de 1500.
2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo la
platina, porque a la larga deteriora el tomillo micromtrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte ms delicada del
Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. As, el
enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del
objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razn debe desmontarse
los objetivos.
El objetivo de inmersin no debe usarse en seco y debe quedar
escrupulosamente limpio despus de su uso, para lo cual use el
campo ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o
metanol.
3. Al finalizar la observacin microscpica, coloque el objetivo de
menor aumento en el eje ptico dejando un espacio de 2 cm. entre
ste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.
11
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.
Observe las diferencias en el campo ptico y el acercamiento.
IV. CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?

A qu se denomina campo ptico?
Por qu decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.
Qu es el poder de resolucin
qu entiende por bioseguridad
Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.
qu barreras de proteccin debe tener en cuenta antes de empezar a
trabajar.
8. Cmo promovera la cultura de bioseguridad.
12
PRCTICA
MICROSCOPIA: OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
1) Conocer la morfologa de organismos unicelulares.
2) Conocer los distintos mtodos de observacin de microorganismos in
vivo.
II. OBSERVACIN
UNICELULARES
IN
VIVO
DE
ORGANISMOS
Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina est en
posicin horizontal.
2. Coloque la lmina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lmina de manera
que la luz del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observar que tiene exceso de
iluminacin y poca visin de la muestra corrija ste defecto bajando el
condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observar elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen
caractersticas especiales y un fondo de partculas de tierra y cristales
grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de
pequeas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaos, se las distingue porque son
brillantes, amarillentas, poco mviles; van desde la forma de un barril
pequeo hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de
observacin. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se
caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior
observar el ncleo y vacuolas.
13
Tambin puede observarse a la stilonichia, ms pequea que el

Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por
presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado).
- La ameba, difcil de visualizar por su transparencia, presenta pocos
movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudpodos en la
superficie de su cuerpo.
- Tambin puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cliz, con un
pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie
del cliz est rodeada de cilios.
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno)
en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
-
Grafique la Observacin y Resultados
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_______________________________________
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_______________________________________
_______________________________________
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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

1. Examen en Fresco
Es la forma ms simple de realizar la preparacin de un espcimen para su
examen microscpico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos
vivos.
Hay 2 tipos de tcnicas:
a. Preparacin en fresco simple entre porta y cubre.
Consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un
porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en un
cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una
excavacin central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparacin
con vaselina alrededor de la excavacin.
La ventaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser observada
durante un tiempo ms largo.
2. Coloraciones Vitales
14
Son los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello,
determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja
concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observacin,
mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin
provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS
Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la
finalidad de observar caracteres de movilidad, morfologa, agrupacin,
observacin de huevos y quistes de parsitos.
15
EXAMEN EN FRESCO
Material
- Microscopio
- Lminas cubreobjetos
- Lminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Grmenes varios
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodologa
- Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca
una gota de lquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un
cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una
gota de suero fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con la
ayuda del asa de kolle realizar una suspensin y colocar un
cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.
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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones en
fresco o como tcnicas intermedias entre stas y las preparaciones
fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teidas.
Material.
Microscopio,
Lminas
portaobjetos,
a
examinar,
Cubreobjetos, Solucin de azul de metileno (1/1000), Asas de platino,
Grmenes diferentes
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno
(l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa
de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o
slida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
16
17

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V. CUESTIONARIO
-
Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco?

Qu ventaja presenta una preparacin gota pendiente?
Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?
18
PRCTICA
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
I.
OBJETIVOS
.
Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes
procedimientos de coloracin.
II.
MARCO TEORICO
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su
protoplasto posee un ndice de refraccin cercano al agua, se requiere
generalmente tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente o
demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, y
difieren uno de otro en cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y a
la sustitucin de los tomos de hidrgeno por otras molculas. Algunos de
los grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son: C=C,
C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero de
radicales cromforos del compuesto.
2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES
PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de
espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las
paredes de las clulas jvenes son ms delgadas que las clulas de
cultivo antiguo.
GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas est
constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo
unidas por puentes peptdicos.
Sin embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad de
cidos teicocos, polmeros de glicerol y ribitol unidos por grupos
19
fosfato y aminocidos como D-alanina o azcares como la glucosa

estn unidos a los grupos glicerol y ribitol.
GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas,
dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME),
con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antgeno
o somtico conocido como lipopolisacrido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmtica interna. Un espesor de 0.0075
m.
2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Este tipo de preparaciones son las ms frecuentes, tanto las obtenidas
directamente a partir de muestras clnicas como las obtenidas a partir
de desarrollo de cultivos.
Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada y
coloreada son:
a. Confeccin del Frotis. Puede prepararse a partir de productos
lquidos o slidos.
Producto lquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un
portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y
se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio slido. puede prepararse una suspensin del
material en una gota de solucin salina colocada previamente en el
portaobjetos, extendindola con ayuda del asa de platino.
b. Secado. Se dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
c. Fijacin. La fijacin tiene como objeto la inmovilizacin de las
estructuras del material a estudiar en un estado lo ms prximo
posible al estado vivo. Consiste en una muerte rpida de los
microorganismos, debida a la coagulacin de las albminas
protoplsmicas. Existe un gran nmero de fijadores, tanto en forma
simple (etanol, cido pcrico). Las formas ms habituales de fijacin
son: por el calor y alcohol en fro.
d. Coloracin. Es el proceso de coloracin de los microorganismos.
e. Lavado. Eliminacin del exceso de colorante.
f. Secado. Se secar la preparacin al aire.
CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONES
La clasificacin de los colorantes es algo confusa, pero est basada en los
cromforos presentes.
a. Segn su estructura qumica. Pueden clasificarse como cido o
Bsico, trmino que no ndica sus reacciones de pH en solucin, sino,
si una parte de la molcula es aninica o catinica.
20
Los colorantes bsicos, tien estructuras de naturaleza

cida, como la cromatina nuclear de las clulas. Ej: Cristal violeta,
Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes cidos, reaccionan con sustancias bsicas,
tales como estructuras citoplsmaticas, y como colorante de
contraste. Ej: cido pcrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante
cido con uno bsico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua
y solubles en alcohol. Ej: Sudn III.
CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten
conocer la morfologa y tipo de agrupacin bacteriana. ejplo. Tincin
azul de metileno, Tincin fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan ms de un colorante y sirven para
poner de manifiesto las caractersticas de afinidad de los
microorganismos por ciertos colorantes como; Tincin Gram, Tincin
cido-alcohol resistente.
c. Tinciones Estructurales. Utilizan ms de un colorante y sirven para
poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tincin de
flagelos, Tincin de esporas, Tincin de cpsulas, Tincin de
corpsculos metacromticos
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1.PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
Preparacin del Frotis
-
Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo.

Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porcin azul de la
flama. Ponga el asa tan cerca de la posicin vertical como sea
posible. Djela enfriar (cuente hasta 20).
Tome una porcin de la muestra que se va examinar, colocando el
asa en posicin plana en la superficie del lquido.
Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente en el
centro de ste (el portaobjeto deber estar numerado).
Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjeto muvala
trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto
espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.
Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir
cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.
Fijacin
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero de
Bunsen, con la muestra hacia arriba.
- Djelo enfriar antes de aplicar la tincin.
21
3.2.TINCIONES SIMPLES
Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Azul de metileno
(solucin acuosa al 1%), Safranina (solucin acuosa 1%), Asas de
platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol
TINCIN DE AZUL DE METILENO
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin
del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y
algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con
dificultad son as fcilmente diferenciables.
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua
destilada para hacer un frotis.
- Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no
necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni
muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar
de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua
caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de
colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con
aceite de inmersin.
22
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
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TINCIN DE SAFRANINA
Las bacterias aparecen de color rojo.
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua
destilada para hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no
necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni
muy gruesos ni muy finos.
suavemente para obtener la fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) y
se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua
caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de
colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con
aceite de inmersin.
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23
3.3.COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin
de Gram, Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin,
Xilol
TINCIN GRAM
El cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la
pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin
dbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza
qumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el
cristal violeta, an luego del tratamiento con un decolorante orgnico,
tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se
denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico en
su pared celular, pierden la coloracin primaria del cristal violeta
cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de
contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que
han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al
microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus
paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin
del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y
algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con
dificultad son as fcilmente diferenciables.
Reactivos
- Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95
=
20 ml, Agua destilada csp=100 ml)
- Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0
g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de
bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lmina
portaobjeto limpia.
suavemente para obtener la fijacin del frotis, con la finalidad de
que el material no sea arrastrado durante el proceso de tincin.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la
superficie con solucin de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien
con agua de cao.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con
agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la
superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no
arrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos ms
o menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como
decolorante , en este caso dar ms tiempo aproximadamente 1
minuto.
24
Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con

agua de cao.
Secar al aire, a temperatura ambiente.
Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con
aceite de inmersin.

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IV. CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
Qu es un colorante y cules son sus propiedades?

Por qu se le llama a un colorante cido o bsico?
A qu se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?
De qu manera influye el pH en la coloracin?
Por qu es necesario utiliza mtodos de tincin para visualizar a las
bacterias?
6. Escriba la estructura del azul de metileno y safranina
7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
9. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos
grampositivos y explique la funcin que cumple cada uno de ellos.
10.
Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos gramnegativos y explique la funcin que cumple cada
uno de ellos.
25
11.
Explique el fundamento de la coloracin de Gram y
esquematice.
12.
A qu se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
13.
Mencione tres razones por las que un microorganismo
grampositivo se observa gramnegativo.
14.
Dibuje la estructura del colorante cristal violeta
15.
Mencione tres microorganismos (gnero) que sean cocos
grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos
gramnegativos.
26
PRCTICA
COLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS
I. OBJETIVOS
-
Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructuras

microscpicas de los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
Conocer mediante las caractersticas macroscpicas y microscpicas las
especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
Conocer la aplicacin de los gneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
en la industria.
II. MARCO TERICO

1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Caractersticas morfolgicas del hongo: tamao y forma de las cabezas
conidiales, Morfologa de los conidiforos, filides y metulas, y en la
presencia de clulas de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se
muestra las principales estructuras morfolgicas del gnero Aspergillus:
27
B. ETIOPATOGENIA
Se origina por hongos omnipresentes y oportunista que vive como
saprofitos en el suelo, vegetales en descomposicin, cualquier tipo de
materia orgnica como pintura fresca, alimentos enlatados abiertos, ropa
vieja, recipientes con agua sin usar, reactivos qumicos, paredes de
refrigeradores, sistemas de ventilacin, cuartos de hospital, lentes de
contacto blancos, en las capas altas de la atmosfera.
Las especies que actan como patgenos son termotolerantes. Tras la
exposicin a grandes cantidades de conidios, penetran por inhalacin o se
instalan de manera saprofitica en una cavidad pulmonar de cualquier
origen, como cavernas por TBC.
C. APLICACIONES INDUSTRIALES
En la produccin de enzimas que se emplean en la industria molinera y
panadera:
ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque
se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de
cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del
pncreas.
En la produccin de enzimas que se aplican en la industria de alimentos
azucarados.
INVERTASA O SACARASA.
Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar
invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que
acta sobre el extremo fructosa de la molcula de sacarosa, y la alfaglucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se
entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es
producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que
la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y
de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
La aplicacin de enzimas en los detergentes
Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que
permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y perodos ms cortos
de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre los
materiales que constituyen las manchas, facilitando la remocin de estos
materiales y de forma ms efectiva que los detergentes convencionales.
Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por
hidrlisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lpidos son
insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo ocurre en la interfase
entre la gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que
permitan la remocin de manchas de grasas a bajas temperaturas de
lavado. Una combinacin de bsqueda y manipulacin gentica ha
conducido a la introduccin reciente de lipasas en los jabones en polvo.
28
Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logr producir en Aspergillus

otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos
extractivos Extraccin de aceite. El uso de algunos preparados
celulolticos en el proceso de extraccin ha tenido un efecto positivo sobre
el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado
enzimtico producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la
extraccin del aceite de soya. En condiciones ptimas, el contenido de
aceite de soya extrable (24.9 % en base seca) y el porcentaje de
recuperacin del aceite de soya (99 %).
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con
actividad mixta principalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa,
pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extraccin de aceite a
partir de las semillas de ajonjol, de cacahuate y de girasol. Los niveles de
porcentaje de aceite extrado fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de
ajonjol, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite de cacahuate y de 55.3 a
57.1 %
Extraccin de colorantes. La extraccin de colorantes es otra aplicacin
atribuida a algunos preparados enzimticos.
Extraccin de antioxidantes con preparados enzimticos con actividades
mixtasmixtas
El preparado enzimtico comercial Grindamyl pectinasa, con actividad
mixta principalmente pectinasa, pero ambin celulasa y hemicelulasa,
producido por Aspergillus niger, no slo fue efectivo al aumentar la
extraccin de los fenoles debido a la degradacin de los polisacridos
(celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la
cascara de uva, sino que mejor tambin la actividad antioxidante de los
extractos fenlicos
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las
estructuras del espora-cojinete.
Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos
de fales en forma de botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de
los fialides, con la espora ms joven en la base de la cadena, y son casi
siempre verdes.
La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del
penicillium. Algunos son no ramificado y llevan simplemente un racimo.de
fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada
cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una
segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides.
Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman
monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una
corona radial ancha y blanca, a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37
C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la
29
colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin

abundante. Olor aromtico, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es gnero grande y difcil encontrado casi por todas partes, y
generalmente el gnero ms abundante de hongos en suelos. La ocurrencia
comn de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular.
Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no
comestible o an peligroso. Es una buena prctica desechar los alimentos que
demuestran el desarrollo de cualquier moho.
Se le encuentra en el polvo domstico, en los edificios hmedos y mohosos
donde deteriora diferentes materiales de construccin, entre los que resaltan
el papel de decoracin (crece bien en la cola empleada para su adhesin a las
paredes). No muestra una notable variacin estacional. Las mximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera
(mayores en las reas urbanas que en las rurales).
APLICACIONES DEL PENICILLLIUM
Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres
humanos. Los quesos tales como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se
maduran con la especie de Penicillium y son absolutamente seguros de comer.
La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming produca 2 mg de
penicilina por cada litro de cultivo, posteriormente se encontr que otros
Penicillium eran mejores productores de penicilina y se eligi a Penicillium
chrysogenum como cepa sper productora de este antibitico. Finalmente, la
seleccin de sucesivos mutantes sper productores y la mejora en las tcnicas
de fermentacin realizadas por la industria biotecnolgica han hecho que
actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea en la produccin
de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.
Incluye las siguientes especies:
Penicillium bilaiae
> Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos
camembert y brie.
> Penicillium candida, dem.
> Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola.
> Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistmica emergente
que afecta a roedores y humanos, especialmente a personas
inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis
> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina.
> Penicillium purpurogenum
> Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort,
danish blue y recientemente tambin gorgonzola
III. PROCEDIMENTO
A. MATERIAL
Asa de kolle
KOH al O%
Mechero
Azul de lactofenol
30
Lminas portaobjetos
Lminas cubreobjetos
Microscopio
B. MATERIAL BIOLOGICO
Cultivo de Aspergillus flavus

Cultivo de Aspergillus niger
Cultivo de Aspergillus fumigatus
Cultivo de Penicillium
C. REACTIVOS
C.l. Hidrxido de potasio al 10%
KOH
10 g
Agua destilada
100 ml
C.2. Azul de lactofenol.
Fenol
cido lctico
Glicerol
Agua destilada
20
20
40
20
g
g
ml
ml
Disolver los componentes antes mencionados y despus se agrega el

colorante.
Se puede emplear cualquiera de los siguientes:
Azul de algodn
0.05g
Azul de metileno
0.05 g
Azul de cotton de Perrier
0.05 g
31
1. EXAMEN DIRECTO CON KOH 10%

Se realiza a partir del esputo, membranas expectoradas o fragmentos de
tejido que se obtienen por broncospia.
Se encuentran filamentos hialinos, largos, sinuosos y ramificados de 3 a 4 de
dimetro. En los aspergilomas puede observarse masas de filamentos con sus
cabezas aspergilares. Se puede trabajar a partir del cultivo, con la finalidad de
observar sus estructuras que permitan identificar el gnero.
Colocar una gota de KOH al 10% en un portaobjeto y mezclar con una
pequea cantidad del material a examinar (micelio areo proveniente del
cultivo).
Colocar un cubre objeto (18 x 18 mm) sobre la gota.
El hidrxido de potasio acta disolviendo la queratina e intensificando el
contraste de las estructuras fngicas con otros materiales presentes en
este preparado microscpico.
Examinar microscpicamente en busca de hifas u otras estructuras
nicticas.
2. CULTIVOS
Se realiza en los medios habituales sin cicloheximida, Agar Sabauraud. Las
colonias crecen con rapidez, son de color blanco y por la produccin de
esporas se tornan de diferentes colores. La superficie es aterciopelada o
pulvurulenta. Estos hongos se diferencian por el aspecto y pigmentacin de la
colonia.
2.1. AGAR SABOURAUD
A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos,
particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatolgicas. Su bajo
pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estar
presentes en la muestra.
B. COMPOSICION
C. PREPARACION
32
IV. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER
Caracteres Macroscpicos
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Caracteres Microscpicos
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B. ASPERGILLUS FUMIGATUS
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C. ASPEGILLUS FLAVUS
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D. PENICILLIUM
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3. RHYZOPUS
34
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados

en suelo, fruta que se decae y las heces del vehculo, animales, y el viejo pan.
En ciertas especies del Rhizopus son causas ocasionales del zygomycosis
(phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rpida. En ciertas
especies son patgeno de la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza
en la produccin del tempeh, un alimento fermentado derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los
sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el
esporangio, y son gentico idnticos a su padre, los zygospores se producen
despus de que dos mycelia se fundan durante la reproduccin sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser gentico diferentes de sus padres.
EL GNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus
especies invaden lentamente los medios de cultivo.
EL GNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los medios
de cultivo. En este Gnero los esporangiforos nacen en los nudos de los
estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre
rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia econmica, sntesis de productos industriales: produccin de
cidos lctico, ctrico, succnico, oxlico, etc. Y alimentos populares orientales:
su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se
desarrolle. Una forma tpica o filamentosa, en medios slidos y otra forma
atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios lquidos y
que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de
mostos azucarados, en cambio, la forma tpica se usa para obtener enzimas
(amilasas).
35
Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente

fermenta los azcares formados en la hidrlisis anterior produciendo etanol
en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24
horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentacin alcohlica. Esto es
en sntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma tpica
se emplea para la fabricacin de amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amiloltico, puede hidrolizar
el almidn y producir etanol, pero en menor proporcin que otras especies,
por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentacin alcohlica, en
cambio, en los ltimos aos se
A. CULTIVOS
Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente.
Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rpido
crecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa petri.
Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrn o negro con la

madurez a medida que se forman esporas.
B. OBSERVAR
a. RHYZOPUS
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b. MUCOR
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37
c. ABSIDIA
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V. CUESTIONARIO
1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?
2. Mencione las enfermedades producidas por el gnero Aspergillus?
3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscpicas y
microscpicas) ? Dibuje.
4. Cmo diferencia el gnero Aspergillus del Penicilium?
5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?
6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?
7. Qu es una enzima?
8. Dibuje e indique las partes del Penicillium?
9. Mencione Ud. Cules son las caractersticas macroscpicas del Penicillium?
10. Cul es la estructura bsica de la Penicilina?
11. Cules son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
12. Cmo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de
cultivo se trata de un Zygomycete?
13. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?
14. Indique Ud. Cules son las diferencias que permiten identificar un Mucor,
Rhyzpopus y una Absidia?
15. Qu enfermedades producen estos hongos?
16. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?
38
PRCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN
I.
OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y

esterilizacin de materiales y equipos ms empleados en un laboratorio de
microbiologa industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para
el anlisis microbiolgico.
3) Justificar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el control
microbiolgico de los alimentos.
II. MARCO TERICO

El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los
mismos es el primer paso en el control microbiolgico de los alimentos, pues
de l depender el xito del anlisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas.
2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado de
calentamiento que la esterilizacin con vapor. Su uso est limitado
primariamente a la esterilizacin de material de vidrio y aquellas
sustancias que sean impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los
efectos letales del calor seco debido a la desecacin en general, lesin por
oxidacin y efectos txicos de los niveles de electrlitos.
En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadena
peptdica y se requiere ms energa para abrir las molculas, de all la
aparente mayor estabilidad del organismo.
39
Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una

temperatura de 160-170C durante 1 hora.
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a
esterilizar (asas y agujas de kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al
contacto de la llama de un mechero para eliminar rpidamente los
microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno
Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170-180C
por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de
vidrio.
2.1.2
ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente

cuando se encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un
medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente
de esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm 3
sobre la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Se
produce tambin rupturas de cadena nica en el ADN, y la prdida de la
viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede correlacionarse con
la introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica,
como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa.
El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de la
membrana y filtracin de pequeas molculas y material absorbente de
260 nm. Este material es de origen ribosmico y aparentemente es
resultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas
por el tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del ARN
ribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas a
temperaturas elevadas.
a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo
(100C) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la
accin del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100C; para ello
puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para
materiales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de
presin y 121C por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios
de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por
calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.
c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma
cilndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta
de:
Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una
camisa metlica cilndrica.

40
Dispositivos
para la instalacin de la fuente calorfica (gas,

electricidad o vapor de agua).
Orificios superiores para purga de gases de combustin.
Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro.
Canastilla para colocar el material a esterilizar.
2.2 ESTERILIZACIN POR FILTRACIN
Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a
travs de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve
para la esterilizacin de sustancias termolbiles. El material filtrante
puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
II.3 ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA

Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su
mayor efectividad como agente bactericida en la regin espectral de
alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, ste mtodo presenta
muchas dificultades tcnicas.
III. MATERIALES Y EQUIPO

- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri
- Erlenmeyer, tubos de ensayo
- Papel craff, algodn, gasa, tijeras
- Mechero de Bunsen
- Horno Pasteur de aire caliente
- Autoclave

4.1
PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a)Preparacin de tubos matraces
-
Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben

llevar sus tapones de algodn respectivamente, los cuales deben
cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos,
preparados segn el mtodo siguiente:
De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo
convenientemente de algodn de fibra, extendida, rectangular
Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta
completar toda la longitud.
Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele
la forma de cono truncado, con el dimetro a la medida del
recipiente a taponar, el tapn debe entrar en el recipiente hasta la
41
mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los

tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos
con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel
slo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel
kraft y se amarra con hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparacin.
b)Preparacin para proteger las pipetas
- En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de
algodn con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que
quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar
uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la
punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de
la pipeta girndose en espiral en forma ajustada y en la parte
terminal de la boquilla se remata con una torsin para protegerla y
se rompe el resto de papel sobrante.
- Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de su
esterilizacin.
c)Preparacin de las placas Petri
- Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las
placas petri completas.
- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa
ponindose esta en el centro, se envuelve la placa tomndose dos
extremos opuestos del papel, dndose una vuelta alrededor de ella,
los otros dos extremos del papel se doblan en tringulos,
rematndose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa,
dndosele una apariencia de paquete de regalo.
4.2
ESTERILIZACIN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear
con utensilios de vidrio o metal.
a)Procedimiento para la esterilizacin en horno
- Ponga el termostato a l75C y encienda el horno.
- Si hay un ventilador verifique que est funcionando.
- Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase
calentando durante 60 minutos ms.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta
60C. Abra la puerta del horno.
- El papel empleado para envolver deber de haber tomado un color
marrn oscuro, si el color del papel es amarillo plido indicar que
el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido
indicar que el horno se ha calentado demasiado.
42
4.3
ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO

a)Procedimiento para la esterilizacin con autoclave
- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la
canasta). Cercirese que el agua no toque la canasta. Elimine el
exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van
a esterilizar, se pueden aadir indicadores de la esterilizacin,
como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la
temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela de
goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los
sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado.
- Abrir la vlvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor.
Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y
continuo, esto indicar que todo el aire ha sido expulsado de la
autoclave.
- Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los
sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura
ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deber
regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el
tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula
de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del
autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la
canasta con los utensilios estriles.
43
VI. CUESTIONARIO
1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos
ejemplos?
2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales
antes del control microbiolgico, por qu?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en
funcionamiento el autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas
bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia.
5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.
44
PRCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I.
OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que
pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms
corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de
cualquier medio de cultivo.
II. MARCO TEORICO

2.1 REQUERIMIENTOS
CULTIVO
NUTRICIONALES
DE
LOS
MEDIOS
DE
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento

microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerir una fuente de
energa y una fuente no energtica como son las sales, factores de
crecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para su
desarrollo.
2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOS
MICROORGANISMOS
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a
azcares en forma de mono o disacridos, como glucosa, lactosa,
maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azcares ms complejas para obtener energa., como es el caso del
almidn.
Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO 2 hecho
que es caracterstico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e,
incluso hidrocarburos como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.
45
Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como
fuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados
diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la
gelatina o incluso protenas an ms complejas, como es el caso de los
extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que
corresponden a pptidos o polipptidos dependiendo de su complejidad
pero en cualquier caso son tambin protenas que estn parcialmente
hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una
peptona ppsica de carne.
La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar
la formacin de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de
triptfano que posee este tipo de peptona. Tambin es utilizada para
estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos
protozoos.
La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente
para hongos y ciertos grmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco,
sales de amonio, aminocidos, etc.
2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS
MICROROGANISMOS
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo
hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de
tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algn
aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma
de fosfato.
C. IONES METLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones
muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo
de su concentracin pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso
del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de
microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de
Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del
Enterococus.
46
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si
lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta
adems una serie de componentes definidos que no son capaces de
fabricar por s solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a
corresponder a algn tipo de aminocido de bacterias muy exigentes o
incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido
nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y
grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina
(factor X) y est enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor
V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para
crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en gotas de
mercurio brillantes es fcil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del
complejo B para el crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de
microorganismo por bloqueo de sus procesos metablicos.
Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia
bacteria.
La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento
bacteriano de los Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y
tipificacin de pruebas bioqumicas de las bacterias.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
desarrollo de las bacterias Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de
anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos
Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales
biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a
muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.
2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO
Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:
- Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese
microorganismo.
- Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra
que considerar:
A. TEMPERATURA PTIMA
47
Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras

siguientes en funcin de los rangos de temperatura de crecimiento.
- Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima o
inferior, la mxima es de 20C. Se aslan del rtico y Antrtico. Pueden
crecer a 0C, aunque su temperatura ptima sea 20 a 30C y la mxima
de casi 35C. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefaccin
de alimentos refrigerados.
- Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la
mnima de 15 a 20C y la mxima de casi 45C. La mayora de los
microorganismos pertenecen a esta categora. Las bacterias patgenas
para el hombre suelen crecer a una temperatura ptima de 37C.
- Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores.
La temperatura mnima es normalmente de 45C y la ptima es de 55 a
65C. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberas de agua
caliente, aguas termales.
- Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, no
crecen por debajo de 55C. Microorganismos aislados en zonas calientes
del suelo marino.
48
RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Microorganismo
Bacillus psichrophilus
Microcococcus cryophilus
Pseudomona fluorescens
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Neisseria gonorrhoeae
Thermoplasma acidophilum
Bacillus stearthermophilus
Sulfolobus acidocaldarius
Pyrococcus abyssi
Pyrodictium occultum
Pvrolobus fumarii
Candida scotti
Saccharomyces cerevisiae
Mucor pusillus
Temperaturas cardinales (C)

Mxim
Mnima
ptima
a
-10
23-24
28-30
-4
10
24
4
25-30
40
6.5
30-37
46
0
37
44
10
37
45
30
35-36
38
45
59
62
30
60-65
75
60
80
85
67
96
102
82
105
110
90
106
113
0
4-15
15
1-3
28
40
21-23
45-50
50-58
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para
su crecimiento.
En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de
agua.
En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la
liofilizacin y cualquier mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de
conservacin.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH
ptimo de crecimiento.
- Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.
La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de
pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos
alterando la membrana plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas
y las protenas transportadoras.
El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como
consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradacin de los
nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la fermentacin
glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica
49
utilizando la bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice

el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo
para mantener el pH dentro de los lmites fisiolgicos.
50
EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Microorganismo
Picrophilus oshimae
Thiobacillus thiooxidans
Sulfolobus acidocaldarius
Lactobacillus acidophilus
Staphylococcus aureus
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Clostridium sporogenes
Pseudomonas aeuriginosa
Nitrosomonas
Bacillus pasteurii
Bacillus alcalophilus
Lmite
inferior
0
0.5
1.0
4.0-4.6
4.2
4.4
4.4
5.5-5.8
5.6
7.0-7.6
8.5
8.5
pH
ptimo
0.7
2.0-3.5
2.5
5.8-6.6
7.0-7.5
6.0-7.0
6.0-7.0
6.0-7.6
6.6-7.0
8.0-8.8
SD
10.6
Lmite
superior
SD
6.0
4.0
6.8
9.3
8.4
9.0
8.5-9.0
8.0
9.4
SD
11.5
D. PRESIN OSMTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque
existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo
superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e
hipotnicos; este hecho es debido a su pared rgida que permite que el agua
no penetre en la bacteria y sta se rompa.
En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a
concentraciones muy altas de cloruro sdico; Ej: Staphylococus.
Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados
sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente
el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).
Actividad del
Ambiente
Agua
1.00 (agua pura) Sangre
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
0.60
Pan
Jamn
Salami
Conservas
Lagos
salados
Pescado
salado
Cereales,
dulces
Chocolate
Leche
deshidratad
a
Microorganismo
Mayora de Gramnegativos
no halfilos
Bacilos
Grampositivos,
Basidiomycetes
Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor,
Rhizopus
Staphylococus, Saccharomyces
Penicillum
Halobacterium, Aspergillus
Actinospora
Aspergillus
Saccharomyces
Xeromyces
E. CONCENTRACION DE OXGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es
AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
51
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer,

pero lo hacen mejor en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis
pueden crecer bien tanto en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo:
Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno
y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa
mediante la respiracin aerobia y deben utilizar vas de fermentacin o
respiracin anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter,
que son MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno
atmosfrico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de
Oxgeno.
2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes
clasificaciones. De acuerdo con esto y segn criterios se podran dividir en:
2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA
A. MEDIOS SLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre
por encima del 15%.
La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el
aislamiento, purificacin y visualizacin del crecimiento en colonias, as
como su posible identificacin a travs de medios especficos y diferenciales
de caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos
Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.
B. MEDIOS LQUIDOS
Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para
la
realizacin
de
recuentos
bacteriolgicos
por
turbidimetra,
especialmente til en levaduras, para la realizacin de inculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos
como: antibiticos, cidos lcticos, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de
glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados
difciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISLIDOS
52
Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en

agar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad
que le proporcione consistencia semislida. Son tiles para algunas
pruebas bioqumicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.
2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN
A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO
Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias
aisladas. Estos, segn sea su composicin, se pueden a su vez dividir en:
A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems de
los componentes bsicos, uno o varios elementos, como por ejemplo casena
soja, triptfano, etc., que facilitan el crecimiento de algn tipo de
microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el
microorganismo que buscamos.
A.2. MEDIOS SELECTIVOS
Son medios en cuya composicin presentan componentes que impiden el
crecimiento de algn tipo bacteriano.
- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares,
citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y
los hacen con el grupo coliforme.
A.3. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades
que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el
crecimiento de algunas bacterias y, lo que es ms caracterstico de este
medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias
que van a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria y
especfica, es decir, diferencial; por ejemplo:
- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y
azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y
algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias,
que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una coloracin
caracterstica para cada tipo de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con
fines de aislamiento e identificacin.
- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de
utilizar la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, adems si puede producir H2S.
- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o
desamina el aminocido Lisina.
- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de
utilizar el citrato como nica fuente de carbono.
B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL
Son medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de la
mayor parte de las bacterias. Su composicin va a corresponder a una
fuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales y agua. Dentro de los
medios generales ms empleados tendramos el caldo comn, que est
53
compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sdico y

agua.
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las
cepas vivas durante perodos de tiempo relativamente largos
mantenindose
tales
medios
generalmente
a
temperaturas
lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento.
Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para
mantener cepas durante meses.
2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICIN
A. MEDIOS NATURALES
B. MEDIOS SEMISINTTICOS
C. MEDIOS SINTTICOS
D. MEDIOS COMPLEJOS
2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIN
A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS
B. MEDIOS YA PREPARADOS
C. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRI
D. MEDIOS SLIDOS EN TUBO
D.1. Con Agar Inclinado
D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta
E. MEDIOS LQUIDOS EN TUBO
54
III. MATERIALES Y REACTIVOS

d. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml.
Baguetas. Balanza. Esptula. Agua destilada. Placas Petri .Tubos
de ensayo.
e. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac
Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA . Agar Manitol salado.

4.1. PREPARACIN
- Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad
que est indicada en la etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del
volumen de agua que se requiere, agitar suficientemente para
conseguir una suspensin homognea, despus incorporar el agua
restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al
conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado
adheridas a la pared interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para
conseguir su disolucin.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al
agitar no debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente;
la solucin es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y
pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en
caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121C.
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar
en sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad
del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido,
se colocan en la posicin deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda.
- Repartir:
55
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios

de cultivo:
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
56
o En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)

Agar TSI
Agar LIA
o En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar
seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y
en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo
tiempo limitado de conservacin. Cuando no se indique otra cosa y
bajo condiciones adecuadas de conservacin es de varios meses. Se
recomienda temperatura de 4 8C.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre
encintarse con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas
entre el cuerpo de la placa y la tapa.
4.5. COMPOSICION Y PREPARACIN DE CADA UNO DE LOS
MEDIOS UTILIZADOS
AGAR NUTRITIVO
Composicin
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar Agar,
12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Descripcin del Medio
Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
57
_________________________________________________________
AGAR MAC CONKEY
Composicin
Peptona de casena 17.0 g. Rojo neutro
0.03 g. Peptona de carne
3.0 g.
Cristal violeta
0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro
de sodio 5.0 g
Agar Agar
12.5 g. Agua destilada 1000 ml.
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores inhibidores: _______________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composicin
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g.
, peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol,
24 mg.,
sacarosa,
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0
g
Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
58
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composicin
Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona,
azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua
destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn
su
proporcin
___________________________________________
Segn
su
uso
o
___________________________________________
Segn
la
_____________________________________________
Segn
su
_____________________________________________
CALDO LURIA BERTANI (LB)
Composicin
59
en
agua
utilizacin
composicin
presentacin.
Extracto de levadura,.. g. ,
Cloruro de sodio.. g.
Triptonag
Agua destilada. ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
V.
CUESTIONARIO
1.
Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de

microorganismo: Aerobios obligados, Anaerobio facultativo, Anaerobio
aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.
2. Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
3. Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo?
4. Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores
bajos de aw?
5. A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos.
6. Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
7. Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
8. Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
9. Realice una grfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el
crecimiento microbiano, y clasifique en categoras diferentes segn los
rangos de temperatura de su crecimiento (psicrfilos. Psicrtrofos,
mesfilos, termfilos, Hipertermfilos?
10. Con qu sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione
por lo menos 4.
11. Qu es un medio de transporte y para qu sirve? De 2 ejemplos.
12. Qu medios diferenciales conoce? Qu utilidades tienen?
60
13. Qu es un medio selectivo y qu funcin tiene? Mencione por lo menos 3

y qu sustancias se le agregan para que cumpla esa funcin?
14. Cmo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
15. Cmo pueden incubarse los microorganismos microaerfilos?
16. Para qu sirve utilizar un medio de cultivo semislido? Cmo se obtiene
la consistencia del agar blando?
61
PRCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I.
OBJETIVOS
-
Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.

Saber llevar a cabo los diferentes mtodos de siembra e inoculaciones.
Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en
condiciones de asepsia y esterilidad.
II. MARCO TEORICO

Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito
previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto
inicialmente deben ser aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los
siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de
los cuales son contaminantes, hacindose necesario su aislamiento
inicial para obtener cultivos puros.
2.1.SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en
medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen,
de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas
de temperatura y tiempo de inoculacin, puedan desarrollarse y
multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a
partir de una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran
superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el
medio, generen su progenie (cepa) por formacin de colonias
separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr
62
caractersticas especiales, la morfologa bacteriana ser tambin

distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo
apropiado en tubo, que puede ser lquido o slido.
Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios
especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas
y como resultado la identificacin especfica. Los trasplantes se
pueden realizar:
1. De lquido a slido.
2. De lquido a lquido.
3. De slido a slido.
4. De slido a lquido.
2.2.MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION
Existen los siguientes materiales:
ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con
una punta en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango
cilndrico para un uso sencillo.
Se utiliza para inoculacin o siembra por estra en medios slidos,
presentan un arco bastante cerrado en su extremo cuyo dimetro es
ms o menos especfico es decir muchas asas son calibradas y
corresponden a un volumen determinado de siembra las ms
utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)

Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su
extremo, nicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por
picadura en medios semislidos y slidos.
ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se
utiliza para extender el inculo lquido previamente adicionado en la
63
placa, a travs de una pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave,

aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y
prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.
HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que
esta sufra desecacin, deterioro o contaminacin. Sirve para extender
la muestra a travs del hisopo en el medio de cultivo. Se suele
comercializar ya estril listo para utilizar y desechables.
PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de
vidrio, reutilizables por esterilizacin o de plstico, generalmente
desechables.
Pueden
ser
graduadas
(contienen
volmenes
especficos), en cuyo caso su aspiracin se realizar con aspiradores
para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene
volmenes graduados son muy utilizados en bacteriologa y cuya
aspiracin se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros
en un determinado medio de cultivo.
2.3.PREPAPACION DE INOCULOS
Un inculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de
microorganismos problema. As pues, se debe partir, por un lado, de
un, cultivo puro y, por otro lado, de una concentracin adecuada de
microorganismos problema.
Si la muestra no es pura se aplicar distintos mtodos para el
aislamiento mediante tcnicas especficas, como es el caso de la
siembra por estras en placa o por agotamiento, o la tcnica de la
placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento ms o
menos separado de los microorganismos. Es muy til usar medios de
cultivo enriquecidos especficos y diferenciales que permitan el
crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De
esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser
aislada y desarrollada como puro.
METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS
Si la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de
siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta
graduada o pipeta pasteur estril en cantidad suficiente y, en ambos
casos se homogenizar
2.4.PREPARACIN DE INCULOS
64
Si la muestra es slida o semislida se tomara siempre con asa de

siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta
graduada o pipera pasteur estril en cantidad suficiente, y en ambos
casos se homogenizar posteriormente en el medio especfico de
cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un
medio lquido se homogenizar y se dejar crecer a la temperatura
adecuada, que generalmente para organismos patgenos coincidir
con la temperatura corporal, dejndolos crecer aproximadamente 24
horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilizacin de
un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo
el medio lquido, aunque esto va a depender de su aplicacin posterior
y de la cantidad de inculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estril y se adiciona en un
medio de cultivo slido, se utilizara diferentes tcnicas de siembra y
posteriormente se verificar el cultivo, ej. siembra por agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se
adiciona a un medio liquido, se homogenizar la mezcla inicial por
agitacin y se dejar crecer a una temperatura de 37C por 24 horas.
Es importante que los inculos sean siempre jvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y sta se
aade a un medio slido, se extender con el asa de Digrasky,
previamente estril a travs de toda la placa incubndose a a
temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren tambin
cultivos jvenes.
Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina
estril o caldo de cultivo base.
A veces es necesario partir de un inculo con un nmero aproximados
de microorganismos problema. En estos casos, los inculos se
establecen en medios lquidos y el nmero de microorganismos se
recuenta de forma aproximada, por comparacin de medios lquidos
con diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de
Mc-Farland formada por una batera de tubos cada uno de las cuales
tiene distinta turbidez segn la concentracin de sulfato brico. Cada
tubo
corresponder
a
una
determinada
concentracin
de
microorganismos.
2.5.METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MTODOS DE
AISLAMIENTO)
El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea
lquido o slido se denomina siembra o inoculacin.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se
denomina resiembra.
La siembra del inculo puede realizarse en medio slido o en medio
lquido.
2.5.1. SIEMBRA DEL INCULO EN EL MEDIO SLIDO
Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
65
2.5.2. SIEMBRA DEL INCULO EN PLACA

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la
superficie del medio slido. Se va descargando gradualmente el
inculo, para que en los ltimos planos del medio queden escasas
clulas aisladas que en el ambiente nutritivo se irn multiplicando,
logartmicamente hasta formar colonias puras.
Los mtodos de aislamiento varan segn el dispositivo de siembra y la
forma de distribuir el inculo.
Cualquiera que sea el mtodo ensayado, aprovechando el mximo de
superficie del medio se logra el aislamiento de mayor nmero de cepas
microbianas.
CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estras.
- Siembra por difusin.
- Siembra por diseminacin.
a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE
Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se
construye una cantidad adecuada de muestra problema depositando el
inculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aqu
se realizar movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa
no tomndose en ningn momento nuevos inculos y no levantndose
el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.
- ESTRIA MLTIPLE
Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente
estril y dicho inculo se depositar en el extremo superior de la
placa, extendindose de un extremo a otro de sta solo en la parte
superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa
repetiremos el proceso anterior que nos permitir arrastrar la muestra
desde uno de los bordes donde qued la muestra hasta el otro extremo
superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino
sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma
direccin se repite la operacin hasta un total de cuatro o cinco veces,
que son los que tienen cabida aproximadamente en una placa,
teniendo en cuenta que el ltimo tramo se efectuar hacia el interior
de la misma.
El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia
de que cada vez que se va arrastrando y separando ms la muestra. Es
importante que para separar estas colonias se realice en cada estra
un flameado previo del asa de siembra.
66
- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se
dibujan dos lneas perpendiculares que debern cruzarse en el centro
de la placa de tal forma que esta queda dividida en cuatro cuadrantes
iguales. Se tomar con el asa de siembra estril una cantidad de
inculo y se adicionar en el extremo superior de uno de los
cuadrantes extendindose por todo ese cuadrante en forma de zig zag. Realizamos la misma operacin sin flamear el asa en todos los
dems cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos
arrastrando el microorganismo problema observndose en el ltimo
cuadrante las colonias ms aisladas o separadas.
- TECNICA DE LOS TRES GIROS
Se rotula la placa en forma anloga al caso anterior. Se toma inculo
con el asa de platino y se siembra por estra la mitad superior de la
placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90 y
volveremos a sembrar una segunda vez. As sucesivamente hasta
completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) sta
tcnica no es muy utilizada.
b. SIEMBRA POR DIFUSION (TCNICA DE BARRY)
67
En este mtodo, el medio de cultivo se mezcla con el inculo, al

solidificar las colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirn
para contaje de colonias.
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de
medio a una temperatura de 45 a 50C) en el tubo, en el tubo se
adicionar la cantidad de inculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se
homogenizar la muestra en el tubo mediante el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa Petri estril
y se dejar solidificar, la mezcla tambin se podra realizar en la
misma placa Petri, aunque la homogenizacin en este caso es ms
difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para la determinacin de
CMI (concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico frente a
determinados microorganismos.
c. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).
Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar
entre 0,2 y 1 ml segn los casos con una pipeta graduada estril, y
posteriormente se extiende con el asa de Digrasky tambin estril.
Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables,
antibogramas, etc.
2.6.SIEMBRA DEL INCULO EN TUBO

a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SLIDO INCLINADO
Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado
una cantidad de muestra adecuada. Se aade al tubo desde el fondo
de la superficie de sta realizando movimientos ascendentes en zig zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo es
utilizado para conservar cepas durante largos perodos, as como para
la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas como la prueba de
ureasa.
b. SIEMBRA POR PICADURA

68
Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones

tambin puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el
asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo
de esta y en posicin central. Esta tcnica se utiliza para la siembra de
medios de cultivo semislidos ej. medio de oxidacin - fermentacin de
Hugh-Leiffson.
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA

Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas.
Este mtodo se lleva a cabo cuando el medio es slido y est inclinado.
Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la
siembra por estra ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio
citrato entre otras.
2.7.CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y

TRANSFERENCIA CELULARES
El empleo de microorganismos en Biotecnologa se fundamente en la
obtencin de cultivos puros, que estn constituidos por una nica
especie microbiana. La mayora de las aplicaciones en biotecnologa
conlleve el uso de cultivos puros.
La mayora de los mtodos de obtencin de cultivos puros se basa en
algn mtodo de dilucin. El mtodo ms til y prctico es el
aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se inocule y se
extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las
clulas individuales queden separadas una de otras. Cada clula
aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo
(o clon) puro puesto que las clulas que componen la colonia son la
progenie de una nica clula original.
Existen varios mtodos para confirmar la pureza de un cultivo:
1.
Repitiendo la operacin de aislamiento; una colonia aislada

procedente de un aislamiento en placa inicial debera dar lugar al
repetir la operacin a colonias todas del mismo tipo, y cuya
morfologa concuerda con la del aislamiento inicial.
69
2.
El examen microscpico de los organismos procedentes de una

colonia deberan mostrar un nico tipo celular. Los mtodos
diferenciales de tincin Gram, son tiles pare establecer que la
colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.
Es necesario emplear una tcnica asptica para transferir los cultivos

puros y para mantener la esterilidad a los medios y soluciones.
Trabajando aspticamente, el biotecnlogo tome prudentemente las
precauciones necesarias para prevenir la contaminacin o de las
soluciones con microorganismos no deseados.
III. MATERIALES Y EQUIPOS

Material de Vidrio
- Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100)
- Placas petra
- Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml
- Erlenmeyer
Equipos
- Estufa 37C
- Autoclave
Otros materiales
- Gradillas
- Mechero Bunsen
- Asas de siembra
- Algodn
- Pinzas
Reactivo y Medios de cultivo
- Medios de cultivo
Agar Mc Conkey
Agar nutritivo
Agar Saboraud
Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta)
Agar SIM (tubos fondo)
Caldo SIM
70
IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS

4.1.SIEMBRA DE UNA MUESTRA LQUIDA CON EL ASA DE
DIGRASKY
Muestra: Inculo de un cultivo puro
Medio de cultivo: Agar nutritivo
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.2.SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA
Muestra: Microorganismos
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.3.TCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES
Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
71
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
V.
CUESTIONARIO
1. Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen?

2. Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada
transferencia?
3. Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una
transferencia?
4. Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del
tubo fuente o del tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. por qu es
necesario tocar una parte estril del agar con el asa antes de tocar el
crecimiento bacteriano?
6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los
procedimientos de siembra?
7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la
incubacin?
72
PRCTICA
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS
I.
OBJETIVOS
-
Aprender las diferentes caractersticas de la morfologa colonial

utilizadas en la identificacin de bacterias.
Estudiar
caractersticas
culturales
de
crecimiento
de
los
microorganismos en medio slido
Investigar las manifestaciones de crecimiento de los microorganismos
en medio lquido
II. MARCO TERICO

GENERALIDADES:
Para estudiar las caractersticas de los microorganismos (forma, estructura,
tamao, consistencia, cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y
cultivarlos en medios de cultivos apropiados segn el tipo de microorganismo,
de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y
desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios slidos y
lquidos.
Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la
reproduccin de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio
slido; aunque vara de tamao generalmente es visible a simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de
microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que
tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los
estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se
encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la
especie bacteriana que la forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y
combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes,
sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, adems
de stas caractersticas se requiere tambin estudiar la fisiologa y
73
propiedades inmunolgicas de las bacterias para poder realizar una

identificacin completa.
La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de
una clula individual pero es la caracterstica de la masa celular. As pues, por
ejemplo, la pigmentacin es aparente en la colonia, pero no en la clula
individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se
deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cpsula muy grande.
Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las
especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios
milmetros.
Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras
se pueden observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias
bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde
una colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una
colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando
se trata de separarla del agar..
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada
con muescas concntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz
transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas
en las que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los
microorganismos patgenos uno de los pigmentados ms importantes es
Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se
aprecia en las clulas individuales a que se debe a grnulos intracelulares
muy pequeos para verse con luz transmitida.
III. MATERIALES Y EQUIPO

Se utilizarn las placas y tubos sembrados en la prctica anterior.
1 mechero Bunsen
2 asa bacteriolgica
74

TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN
LA
SUPERFICIE DE UN MEDIO SLIDO
75
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
CONSISTENCIA (probarla con el asa)
Cremosa
Membranosa
COLOR
Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento
producido
Difusible o no.
CARACTERSTICAS PTICAS
LUZ TRANSMITIDA (observar a travs de la colonia)
Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos
Observados a travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos
observados a travs de la colonia.
LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)
Opaca
Brillante
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de
la
bacteria sembrada se reflejan en las caractersticas que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contino sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al
agitar
Crecimiento en caldo Nutritivo
76
Crecimiento en medio semislido
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla, basndose en el
Texto, las figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consisten
cia
Color
Luz
transmitid
a
Luz
reflejada
CALDO
Bacteria
Pelcula
Turbidez
77
Sedimento
78
MEDIO SEMISLIDO
Bacteria
Movilidad
IV. CUESTIONARIO
1. Qu mtodo utilizara para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo
puro, joven, injuriado y envejecido.
2. Por qu algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en
caldo una caracterstica de forma de pelcula.
3. Cmo se visualiza el polisacrido extracelular y a qu bacteria puede
corresponder?
4. Qu es la prueba de catalasa, cmo se realiza y qu utilidad tiene?
5. Cmo se interpretan los resultados de una prueba de fermentacin de
hidratos de carbono?
79
PRCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I.
INTRODUCCIN
Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales,
absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra
mide la entidad de luz transmitida por la suspensin, mientras que la
medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos
procedimientos se puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya
que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensin
bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de clulas en
el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la
medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz
monocromtica por medio de un filtro que permite slo el paso de la
longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una
suspensin bacteriana es medida por una clula fotoelctrica e
inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la
multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin de la luz
transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida
(absorbancia), ya que esta ltima es directamente proporcional al nmero
de bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la
transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la
siguiente manera:
Absorbancia = 2 - log % de transmitancia
Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro.
Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de
turbimetria es muy til el uso de matraces con brazo lateral, ya que
permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar muestras del
cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.
II. OBJETIVOS
1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.
2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.
80
III. FUNDAMENTO TERICO

Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la clula
aumentan en cantidad, en la mayora de organismos el crecimiento
continuo hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas, proceso
denominado fisin binaria. Cada una de las clulas hijas recibe, un
cromosoma completo, copias de todas las macromolculas, monmeros e
iones inorgnicos.
El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama
generacin y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de
generacin o tiempo de duplicacin,na entre los microorganismos,
algunos crecen rpidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros
requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso das.
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO
Si se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes
de un cultivo que ha crecido a saturacin, en el que se ha
determinado el nmero de clulas variables por minuto
peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene una curva
de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases
fundamentalmente y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los
microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos,
enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta
alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se
reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia
de la divisin celular y las nuevas clulas crecen en progresin
geomtrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad
constante aumentando la masa en forma exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan
productos metablicos txicos. Aqu cesa el crecimiento de una
poblacin.
4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el
cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la
velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel
sostenido.
81
Fases de Crecimiento
Latencia
Exponencial
Estacionaria
Rezago
Adaptacin
Logaritmo
Divisn celular
Crecimiento
Nutrientes se agotan
Acumulan metabolitos txicos
Sesa crecimiento
Muerte
Declinacin
8,0
Turbidez
(densidad ptica)
Viables
0,75
D e n s i d a d p ti c a
L o g 1 0 o rg a n i s m o s
v i a b l e s /m l
9,0
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0
0,1
Tiempo
IV. PARTE EXPERIMENTAL

4.1 MATERIALES Y REACTIVOS
- Cubres
- Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo
- Cubetas
- Caldo Luria Bertani estril
- Jeringa descartable de 10 cc.
- Contmetro
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubacin a 37C
- Microscopio
- Espectrofotmetro
V.
METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un
cultivo discontinuo (en un matraz en agitacin) normalmente
experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de
latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de
muerte. Las clulas en fase de latencia, que proceden de una
alcuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio
nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a
crecer a un ritmo rpido. La duracin de esta fase de latencia
depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inculo, de la
temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo y
nuevo, de la aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden
haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que
han entrado en la fase de crecimiento logartmica (log) o
82
exponencial. En este estadio las clulas crecen rpidamente, y a

diferencia de las clulas de las fases de latencia y estacionaria, la
mayora de las clulas se hallan en el mismo estado fisiolgico. La
velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de
nutrientes y de la aireacin de cultivo. La constante de velocidad de
crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un
cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo
medio de duplicacin o tiempo de generacin).
Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo
y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de
crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el
cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las clulas no
estn todas en el mismo estado fisiolgico; algunas todava se estn
dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la
poblacin total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor
parte de los nutrientes, el nmero de clulas que mueren sobrepasa
al nmero de clulas que se producen, y el cultivo entra en la fase de
muerte.
Realizacin (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben
realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del
mechero.)
1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo
completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la
solucin salina por agitacin.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y
aadirlos a un matraz con 50 ml de Caldo Luria Bertani estril.
3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin
(200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de
onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 %
de transmitancia con un tubo conteniendo Caldo Luria Bertani
estril antes de cada medida.
5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de
incubacin y colocadas en refrigeracin hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos,
colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de
ordenadas los de absorbancia.
83
V.
CUESTIONARIO:
1. Por qu se calibra el espectrofotmetro a 100% de transmitancia con
medio de cultivo estril?
2. Por qu motivo puede ser de alguna forma til conocer la curva de
multiplicacin de una bacteria?
3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.
84
PRCTICA
CONTEO DE CLULAS MICROBIANAS
I.
OBJETIVO
Determinar el recuento directo de clulas microbianas con la cmara de
contaje celular.
II. FUNDAMENTO TERICO

Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de
partculas microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser
necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin
como el porcentaje de stas que son viables.
Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes
tcnicas, desde la relativamente simple cmara de contaje celular de la
que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cmara
de Neubauer), hasta equipos automticos de contaje celular como el Cell
Coulter.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando
mtodos ms sencillos. Nos basta con una cmara de contaje celular, por
ej. La cmara de Neubauer, y un microscopio. Una cmara de contaje
celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin
a medir. El dispositivo presente unas seales que determina un volumen
conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el nmero de
partculas presentes en ese volumen se pueden determinar la densidad de
partculas en la suspensin de origen.
La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve
en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos
lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L
corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del
cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
85
cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada

0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el
cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x

clulas entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular
ser:
Concentracin en la suspensin (clulas / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones
marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrcula de
16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado. Esta imagen ha sido
tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a su

uso en microscopa. En la imagen puedes observar una cmara de
Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prcticas.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de

estimar la cantidad de clulas microbianas, sin embargo, tiene algunas
limitaciones:
1) No se distinguen las clulas muertas de las clulas vivas.
86
2) Las clulas pequeas son difciles de ver bajo el microscopio y

posiblemente se omitan algunas clulas.
3) La precisin es difcil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha
teido la muestra.
5) El mtodo no es adecuado para suspensiones de clulas de baja
densidad. En el asa de bacterias, en una suspensin de clulas con
menos de 106 clulas por mililitro, se podran ver pocas o ninguna
bacteria.

-
Cultivo de E. coli
Matraz
Cmara del Neubauer
Estufa
- Cultivo de levadura
- Pipetas
-Pipeta Pasteur
- Microscopio
IV. METODOLOGA
CARGANDO LA CMARA
Agita la suspensin celular con el vrtex. Aspira una pequea
cantidad de suspensin con una pipeta Pasteur. Deposita una gota
pequea en la superficie pulida de la cmara de recuento cerca del
extremo del cubre. La suspensin entrar en la cmara por
capilaridad. Una cmara adecuadamente llenada contiene clulas
solo en el espacio contenido entre el cubre y la cmara de recuento.
No debera sobrar fluido que cayera en los surcos.
V.
CUESTIONARIO
1.- Investigue las caractersticas de:

Cmara de cuenta de Petroff Hausser, equipos automticos de Contaje
celular, Otros mtodos de recuento celular
2.- Indique como diferencia las clulas viables de clulas totales.
3.- Describa los mtodos directos e indirectos de contaje celular.
87
PRCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE
DILUCIN EN PLACA
I.
OBJETIVOS
Aprender la tcnica de dilucin para el aislamiento y cuenta en placa de

diferentes fuentes de inculo.
II. INTRODUCCIN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin
de colonias, la tcnica por vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en
cantidades conocidas se deposita en cajas petri estriles, se adiciona el medio
de cultivo fundido a una temperatura de 45C y se mezcla con la muestra.
Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que
multiplicadas por el inverso de la dilucin que corresponda permite estimar el
nmero de microorganismos viable por gramo o mL de muestra, obviamente
con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoqumicas y
tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referir a determinado
grupo de microorganismos. Esta tcnica permite la mayora de las veces
cuantificar la contaminacin en alimentos, medicamentos.
SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).
Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y
1 ml segn los casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se
extiende con el asa de Digrasky tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar
para el recuento de clulas viables, antibogramas, etc.
TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION

88
Se dispondr de un batera de tubos con medio de cultivo especfico o agua

estril segn los casos. Se adicionar una cantidad de muestra liquida o slida
en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inculo que se aade en el
tubo inicial. Se agitar hasta homogenizar. Con la pipeta estril se tomar una
cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos
la operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la
dilucin deseada. Con la dilucin obtenida por ej. l0 -4 y 10-5 inocular en placas
de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente
estril. Incubar a temperatura ptima de 24 horas y posteriormente recontar.
Existen muchas variaciones de este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio
de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluye hasta
obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en placas y se le deja
solidificar.
III. MATERIAL REACTIVOS

Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de
tincin de Gram, Cajas Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodn, gasa, alcohol.
IV. METODOLOGA
SIEMBRA POR DILUCION
Preparacin de reactivos y medio de cultivo:
Solucin isotnica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua
destilada
Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del
reactivo.
Envolver cajas de Petri y pipetas..
Bajo condiciones estriles hacer las diluciones en la solucin isotnica estril,
de acuerdo a la figura 1.
Tomar 0.1 ml de la dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en
cajas de petri bajo condiciones estriles. Inocular de la misma manera con las
diluciones siguientes
Se realizar el conteo en placa por superficie.
Incubar las cajas en forma invertida a 30C, de 24 a 48 horas.
Considerar las siguientes reglas para la realizacin del reporte de la prctica:
Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de
30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo.
Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y
no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el
nmero de colonias contadas se multiplica por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas
se multiplica por 4.
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por
el nmero de cuadros que ocupa la caja.
El nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por el inverso de la
dilucin y considerar si la tcnica fue por vertido o por superficie (debido al
volumen de la muestra).
89
Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos
al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49
se reporta 49
90
Fig. 1
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Preparar las muestras segn procedimientos recomendados para la
preparacin y dilucin de muestras.
Pipetear a placas Petri estriles, alcuotas de 1 ml. A partir de las diluciones,
dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y
temperado a 45C, mezclar rpidamente con movimientos vaivn y rotacin de
la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posicin invertida a 37 C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos segn:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre
30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmtica de dos recuentos y multiplicar por el factor de
dilucin utilizada. Reportar el resultado como numero de m.o. aerobios
mesofilos viables por gramo o mililitro, segn el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores
que 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los dos recuentos y
computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la
relacin de los dos recuentos
V.
RESULTADOS
Reportar el nmero de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de
TODOS LOS EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos
y discutir.
Presentar descripcin de morfologa de colonias y microscpica.
91
92
VI. CUESTIONARIO
1. Indique la importancia de utilizar el mtodo de dilucin para el
aislamiento de microorganismos.
2. Comparar el mtodo de dilucin con el de estra para el aislamiento de
microorganismos.
3. Por qu el nmero de microorganismos es el resultado de multiplicar el
nmero de colonias por el inverso de la dilucin?
4. De los datos obtenidos en la prctica cules cree que sean congruentes
y cules no y porque?
5. Por qu la incubacin se realiza con las placas en posicin invertida?
6. Qu finalidad tienen las diluciones y donde se requerirn ms
diluciones, en muestra fresca o procesada, por qu?
93
PRCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I.
OBJETIVO
-
II.
Obtener ndulos de Rhizobium de races de alfalfa.

Observacin microscpica de bacterias de Rhizobium
FUNDAMENTO TERICO
La produccin agrcola basada en leguminosas es fundamental para la
alimentacin humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente.
Por ello la interaccin natural de estas plantas con una bacteria del
suelo a nivel de la raz, es ecolgicamente importante, como medida
para evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran
el suelo y contaminan el ambiente.
La fijacin biolgica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce
a su hospedero, lo infecta a travs de los pelos radicales para que en la
matriz de las clulas corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada
que da lugar a un tejido hipetrofiado: El ndulo en el sistema radical de
la leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se
ha transformado en un bacteroide, mientras que por la enzima llamada
nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio, que luego transfiere al
ribosoma
vegetal
para
la
sntesis
de
protenas
vegetales;
simultneamente por la fotosntesis la leguminosa reduce el C02 en
carbohidratos que servirn como fuente de carbono y energa para
Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo
activo en el ndulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la
aplicacin de fertilizantes qumicos al suelo; incrementan el contenido
de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen el rendimiento en
las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de produccin
y la contaminacin de mantos acuferos y suelos, es vital para una
agricultura sustentable.
94
GRUPOS DE INOCULACIN CRUZADA Y ASOCIACIONES

DE Rhizobium LEGUMINOSA
Especies de
Grupo de
Gnero
Leguminosa
Inoculacin
Rhizobium
hospedero
incluida
cruzada
Medicago
Alfalfa
Grupo de alfalfa R. meliloti
Melilotus
Trebol dulce
Grupo del trbol R.
leguminosarum
biovar trifolii
Trigonella
Trifolium
Alholva
Trbol

Material Biolgico
- Races de alfalfa con ndulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bistur
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
IV. METODOLOGA
1. Preparacin del Medio PSA
Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta
que las papas estn cocidas.
Filtrar la solucin de coccin y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de
sacarosa y 1.2 g agar agar autoclave 120C 15? Y proceder a
plaquear
2. Observacin Microscopia de Bacterias de Rhizobium
- Obtener los ndulos de Rhizobium de las races de alfalfa.
- Caracterizar los ndulos segn posicin en las races, color, forma,
tamao.
- Lavar con agua destilada los ndulos y realizar diseccin del ndulo
sobre un porta objeto y dejar caer el lquido interno para realizar
un frotis.
- Fijar el frotis de Rhizobium.
95
- Realizar coloracin Gram

- Observacin en el microscopio a 100X
3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA
Esterilizacin de ndulos
- Disponer los ndulos en un matraz de 100 ml
- Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar.
- Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 8 minutos, decantar
- Lavar con agua destilada estril 3 veces
- Realizar la diseccin del ndulo con la ayuda de pinzas y bistur sobre
papel estril.
- Dejar caer el lquido interno del ndulo seccionado apretando con la
pinza o pasar sobre la superficie del medio.
- Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 27C en estufa, 5 das.
V. CUESTIONARIO
-
Qu otros medios se utilizaran para el cultivo de Rhizobium.
Cul es la ruta metablica que utiliza el Rhizobium.
Cul sera la importancia industrial del aislamiento y cultivo de

Rhizobium.
96
PRCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
I.
FUNDAMENTO TEORICO
La deteccin de microorganismos contaminantes en alimentos y

bebidas constituye una prctica habitual en
cualquier laboratorio de
Bromatologa. Para ello se
utilizan
medios selectivos, indicadores y
generales que
nos
permiten identificar desde el total de bacterias
contaminantes (realmente slo se detecta una cierta parte de la poblacin
total) hasta grupos de bacterias concretas, de especial inters como
agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de
indicadores de procesos sufridos por el producto durante su manufacturado
o almacenamiento.
II. PROCEDIMIENTO
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de
distinguir la presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias
contaminantes:
Escherichia
coli
Samonella
typhimurium Proteus
morganii
Enterobacter
aerogenes.
El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales
del agua contaminada en solucin fisiolgica, siguiendo el esquema
que se representa a continuacin:
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.9 ml ClNa 0.9%
97
MUESTRA
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:

1) Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1
ml de las diluciones 10-5, 10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar comn, e
incubarlas a 37C durante la noche en posicin invertida. Tras incubar 24
horas se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por los factores de
dilucin correspondientes.
2) Determinacin de bacterias coliformes. Se extiende 0.1 ml de las
diluciones
10-5 y 10-4 sobre dos placas de agar MacConkey, incubndolas de la
forma descrita. Una vez crecidas, se cuentan las colonias rojas y las
rosceas y se multiplican ambos nmeros por los factores de dilucin. Una
vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y
se extiende un inculo denso sobre la superficie de una placa de agar
EMB, incubando a continuacin a 37C durante toda la noche. En este
medio, confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a colonias
negras con reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da
colonias ms rosceas y nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar
el porcentaje de E.coli, sobre el total de coliformes.
3)
Determinacin de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml
de las diluciones 10-5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se
incuban a 37C durante 24-48 horas. Sobre este medio
Salmonella y
Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de
las
colonias se vuelvan rosa, mientras que los
eminentemente
fermentadores no crecen o viran hacia el amarillo (una buena forma de
detectar coliformes).
Con estos datos, hay que deducir el nmero de bacterias (por ml) de
agua contaminada que dan colonias rosas. Para confirmar si se trata de
Salmonella o Proteus, hay que reinocularlas en caldo de urea y en TSI.
Sobre caldo de urea la estirpe de Proteus debe generar color azul.
Salmonella da negativo para ambas actividades. En TSI nicamente la
estirpe de
Salmonella debe
aparecer con precipitados negros (por
produccin de SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto de
los caracteres siguientes:
Fondo*
S. typhimurium
A+G
P. morganii
A+G
(*) A indica produccin de cido y
Pendiente
Alcalino
Alcalino
G de gas.
III. RESULTADOS
98
Ennegrecimient
o
S
No
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN

LAS DIFERENTES PRCTICAS
1.- SOLUCIN DE AGUA OXIGENADA AL 10%
PREPARACIN
Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua
destilada
2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%
PREPARACIN
Azul de metileno
5.0 gr
Agua destilada
100 ml
3.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE GRAM
A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA
FRMULA:
Cristal violeta
2.0 gr
Etanol al 95%
20 ml
Oxalato de amonio
0.8 gr
Agua destilada
80 ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el cristal violeta en el etanol
2.- Disolver el oxalato en el agua
3.- Mezclar las dos soluciones
B) SOLUCION DE LUGOL
FORMULA
Yoduro de potasio
10.0 gr
Agua destilada
20.0 ml
Yodo metlico
5.0 gr
Etanol, aforar a
100.0ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua
2.- Agregar el yodo metlico y disolver
3. Aforar a 100 ml con etanol
C) SOLUCIN DE ALCOHOL ACETONA
FORMULA
Acetona
1
volumen
Etanol al 95%
2 volmenes
D) COLORANTE SAFRANINA
FORMULA
Safranina
0.5 gr
Agua
destilada
100.0 ml
PREPARACIN
Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus
aforara a 100 ml con ms
agua.
4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN
A) COLORANTE FUCSINA FENICADA
99
FORMULA:
Fucsina bsica 5.0 gr
Fenol 25.0 grs
Etanol al 95% 50 ml
Agua destilada aforar a 500 ml
PREPARACIN
1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a
ebullicin
2.- Aadir la fucsina bsica y disolver
3.- Aadir el etanol y mezclar
4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada
B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO
FORMULA
cido clorhdrico 3.0 ml
Etanol al 95 100.0 ml
PREPARACIN
Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando
C) COLORANTE AZUL DE METILENO
FORMULA
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100.0 ml
5.- MEZCLA CRMICA
Dicromatode potasio
cido sulfrico concentrado
Aguadestilada
20.0 gr
20.0 ml.
250.0 ml.
100
BIBLIOGRAFIA
BARRETO, Miriam. 1994. Manual Prctico de Microbiologa General.
Canoabo
CARPENTER, Philip.
1969.
Microbiologa.
2da Edicin.
Editorial
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PELCZAR. 1990. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial. Mc Graw-Hill. Mxico.
WALTER, W.G. 1980. Introduccin a la Microbiologa. Editorial
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GRASSINI, Luis. 1967. Microbiologa Agraria. UCV-Facultad de Agronoma.
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BLAIR, J. 1970. Manual Clnico de Microbiologa. Bethesda. AMERAtlas, Ronald M. Ecologa Microbiana y Microbiologa ambiental.
Pearson, Espaa, 2006.
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101

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

MICROORGANISMOS IN VIVO, COLORACION VITAL..........

COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL...........................

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FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia,

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II. MARCO TEORICO

2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN

Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe

Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar

Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo

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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

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8. Cmo promovera la cultura de bioseguridad.

Tambin puede observarse a la stilonichia, ms pequea que el

Grafique la Observacin y Resultados

III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Grafique la Observacin y Resultados

Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco?

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2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

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CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES

Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo.

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Grafique la Observacin y Resultados

Qu es un colorante y cules son sus propiedades?

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II. MARCO TERICO

Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logr producir en Aspergillus

colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin

Cultivo de Aspergillus flavus

Disolver los componentes antes mencionados y despus se agrega el

1. EXAMEN DIRECTO CON KOH 10%

Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados

Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente

Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrn o negro con la

1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y

II. MARCO TERICO

Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una

ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente

camisa metlica cilndrica.

para la instalacin de la fuente calorfica (gas,

II.3 ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA

III. MATERIALES Y EQUIPO

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben

mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los

ESTERILIZACIN CON CALOR SECO

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II. MARCO TEORICO

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Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO