Microbiologa General

Facultad de Ciencias Exactas

ANEXO: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS
ANAEROBIAS
Funciones del oxgeno en la nutricin
Como elemento constituyente del agua y componentes orgnicos, el oxgeno es un
componente universal de las clulas y se proporciona en grandes cantidades en el
agua.
Sin embargo, muchos organismos requieren adems oxgeno molecular.
Se trata de organismos que dependen de la respiracin aerbica para cubrir sus
necesidades energticas y en los que el oxgeno molecular funciona como agente
oxidante terminal. Tales microorganismos se denominan aerobios obligados.
En el otro extremo fisiolgico estn aquellos microorganismos que obtienen su energa
mediante reacciones que no implican la utilizacin de oxgeno molecular y para los
cuales esta forma qumica del elemento no acta como nutriente. Para muchos de estos
grupos fisiolgicos el oxgeno molecular acta como txico celular o como inhibidor del
crecimiento. Tales microorganismos son anaerobios obligados.
Han sido usados varios trminos, entre ellos aerobio obligado, anaerobio obligado,
anaerobio aerotolerante, anaerobio facultativo y microaerfilo con el fin de subdividir las
bacterias en base a su relacin con el oxgeno.
Estos trminos reflejan un espectro continuo de bacterias que no pueden tolerar el
oxgeno hasta aquellas que lo necesitan para su crecimiento.
Los microorganismos anaerobios pueden ser clasificados en dos grupos principales:
l- Anaerobios obligados
ll-Anaerobios aerotolerantes
Con fines prcticos consideremos las bacterias anaerobias obligadas como aquellas
que no se multiplican en la superficie de un medio slido nutricionalmente adecuado,
incubado en aire ambiental o en una incubadora de CO 2 (que contenga 5-10% de CO2
en el aire).
Dentro de este grupo se establecen dos categoras:
l.a- Anaerobios obligados estrictos
Estos microorganismos desarrollan en superficies de agar expuestas a niveles de
O2 de 0.03% como mximo.
l.b- Anaerobios obligados moderadamente
Son bacterias que desarrollan cuando se exponen a niveles de O 2 de 2-8%.
El trmino anaerobio aerotolerante (grupo ll), es usado por algunos microbilogos para
describir bacterias anaerobias que tendrn un crecimiento limitado o escaso en agar
expuesto al aire ambiente o en incubacin con 5-10% de CO 2, pero muestran buen
crecimiento bajo condiciones anaerobias.
Los anaerobios facultativos crecen bajo condiciones anaerobias o aerobias
determinadas.
Los microaerfilos requieren oxgeno como aceptor terminal, pero no desarrollan en la
superficie de medios slidos con aire (21% de O 2) y crecen con escaso desarrollo, si lo
hacen, en condiciones anaerobias.

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En el desarrollo de medios y sistemas para el cultivo de anaerobios deben ser
considerados dos factores fundamentales que pueden afectar el crecimiento de los
anaerobios en el laboratorio.
El ms importante es el efecto inhibidor del oxgeno atmosfrico y sus derivados txicos.
El segundo factor limitante es el potencial de oxidorreduccin (Eh) del medio de cultivo.

Resumiendo:
Aerobios obligados
Microaerfilo
Anaerobios facultativo
Estricto
Obligado

Moderadamen
te

Anaerobio
Aerotolera
nte
Tolerancia al oxgeno

Probablemente sean mltiples las razones por las cuales los anaerobios varan
en su tolerancia al oxgeno.
Una de las razones es que la tolerancia al O 2 de muchos anaerobios obligados
moderados depende de su produccin de enzimas superxido dismutasa,
catalasas y peroxidasas, que son protectoras contra la toxicidad de los productos
de oxidorreduccin.
Una teora muy difundida es que la exposicin al O 2 produce una serie de
reacciones, mediada por flavoprotenas, que llevan a la produccin del radical
superxido (O2-), perxido de hidrgeno (H2O2) y otros productos de
oxidorreduccin txicos:
Sustrato + O2
O2- +

O2- + H2O2 + productos txicos

H2O2 OH- radical hidroxilo, potente oxidante biolgico

OH- + O2

1O2 singlete

Ciertos microorganismos producen enzimas capaces de contrarrestar estos

productos txicos, como la SUPERXIDO DISMUTASA y las CATALASAS.
Mediante la superxido dismutasa (SOD) se transforman los radicales
superxido en oxgeno molecular y perxido de hidrgeno.
O2- + O2- +2H+ SOD

H2O2 + O2

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El perxido de hidrgeno se convierte inmediatamente en oxgeno y agua,
mediante las catalasas.
2H2O2

Catalasa

2 H2O + O2

Otra enzima que destruye el perxido de hidrgeno es la PEROXIDASA, se

diferencia de la catalasa en que no libera oxgeno en la reaccin.

H2O2 + 2H+

Peroxidasa

2 H2O

Potencial de oxidorreduccin (Eh)

En la naturaleza el lmite superior de Eh es + 820 mv, que podra encontrarse
en algunos ambientes con oxigenacin considerable.
En los tejidos humanos sanos con suministro sanguneo intacto prevalecen
condiciones de oxigenacin y el potencial redox es de alrededor de + 150 mv.
En contraste, el lmite inferior de Eh en la naturaleza vara alrededor de 420
mv.
Un ambiente anaerobio o un medio de cultivo rico en hidrgeno podra tener
ese Eh bajo. El intestino grueso de los humanos, que contiene enormes
cantidades de anaerobios estrictos obligados, posee un Eh de alrededor de 250
mv.
Por lo tanto, para el cultivo de microorganismos anaerobios es esencial el
mantenimiento de un bajo potencial redox.
Para tal objetivo se incorporan agentes reductores tales como tioglicolato y Lcistena.
Con el fin de analizar la relacin que existe entre Eh y el O 2 sobre la
supervivencia y crecimiento de las bacterias anaerobias fueron realizados
numerosos estudios de los cuales pudieron extraerse importantes
conclusiones.
Ha sido ampliamente demostrado que la extraccin del O 2 de los medios de
cultivo, para evitar su toxicidad, es ms importante que establecer un bajo Eh.
Por lo tanto, el rpido logro y mantenimiento de una baja tensin de O 2 o la
ausencia es un requerimiento
esencial para el cultivo de anaerobios en
sistemas anaerobios moderados, como la jarra de anaerobios o la cmara de
guantes.
Medios de cultivos para bacterias anaerobias
El metabolismo anaerbico es menos eficiente que el aerbico para la
obtencin de energa, por lo tanto los medios de cultivo deben ser ms ricos
que los de uso comn para aerobios o anaerobios facultativos, adems
requieren una incubacin ms prolongada.
Los medios empleados para la recuperacin de anaerobios deben incluir tipos
no selectivos y enriquecidos.

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Medios de cultivo no selectivos
Por lo general los anaerobios son bacterias muy exigentes. Se emplean medios
complejos que llevan: hidrolizados de carne, peptonas, extracto de levadura,
hemina, vitaminas, etc.
El medio requiere sustancias reductoras como tioglicolato, glucosa, cido
ascrbico, cistena, hierro, etc.
Como ejemplos:
Medio de Schaedler
Caldo de soja triptona 10 gr
Peptona
5 gr
Extracto de levadura
5 gr
Dextrosa
5 gr
Cistena
0.4 gr
Hemina
0.1 gr
Tris Buffer
0.7 gr
Agar
15.5 gr
Agua destilada c.s.p.
1000 ml
Ph
7.6
Luego se suplementa con sangre desfibrinada al 5% y vitamina K 10 g/ml.
Medio Tioglicolato enriquecido (MTE)
Triptona
17 gr
Peptona de soja
3 gr
Dextrosa
6 gr
ClNa
0.5 gr
Tioglicolato de Na
0.5 gr
Agar
0.7 gr
L-cistena
0.25 gr
Sulfito de Na
0,1 gr
Hemina
5 gr
Solucin
de 4 ml
resarzurina (0.01%)
Agua c.s.p
1000ml
PH
7.0
Luego de esterilizardo y enfriado se suplementa con 0.1 g/ml de vitamina K y
10 mg/ml de NaHCO3.
Medios de cultivo selectivos
Por lo general las muestras a procesar para el aislamiento de microorganismos
anaerobios contienen mezclas de anaerobios obligados, facultativos y/o
aerobios.
Las especies presentes en pequeas cantidades pueden pasar inadvertidas si
se usan medios no selectivos.

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Incorporando distintas sustancias a los medios mencionados anteriormente se
obtienen diferentes medios selectivos. Agentes selectivos:
Violeta de genciana: elimina bacilos esporulados aerbicos.
Azida sdica: inhibe el crecimiento de bacilos Gram positivos esporulados
aerbicos.
Fenil etil alcohol: inhibe bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos.
Neomicina: inhibe Gram negativas facultativas.
Vancomicina+Kanamicina: selecciona bacilos Gram negativos anaerobios.
Sistemas anaerobios para el cultivo de bacterias anaerobias
Estudios comparativos han demostrado que los siguientes sistemas son
satisfactorios para el cultivo e incubacin de bacterias anaerobias.
1- Tcnica en jarra anaerobia
Con catalizador:
a-Evacuacin-reemplazo
b-Mtodo del sobre generador de gas descartable
Sin catalizador:

Fijacin del O2 por limaduras de Fe

2- Tcnica de la cmara anaerobia de guante

3- Tubos con pelcula de agar con siembra por estras en medios PRAS.

1- Tcnica en jarra anaerobia

Existen diferentes marcas en el mercado por ejemplo: Brewer, GasPak, Oxoid,
Mclntosh, entre otras.
La jarra Oxoid, utilizada en el TP, es de policarbonato, tiene una capacidad de 3.5
lt, cerrada con una tapa de metal pesado y una abrazadera de metal.
El centro de la tapa tiene dos vlvulas Schrader y un manmetro.
Las vlvulas se utilizan en la tcnica de evacuacin-reemplzo (E/R).
En la parte interna de la tapa se ubica el catalizador.
La remocin del oxgeno ocurre por reaccin con el
hidrgeno agregado al sistema en presencia del
catalizador.
H2 + O2

catalizador

H2

El uso de un catalizador activo en cada sistema es

importante.
La jarra de Brewer, ms antigua, utilizaba un
catalizador de paladio en la tapa que tena que ser
calentado con una corriente elctrica para ser activo.

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La jarra GasPak usa un catalizador en fro compuesto de bolitas de almina
cubiertas de paladio, que no requieren calentamiento.
El catalizador en fro es ms conveniente para usar y no tiene riesgo de
explosin.
El catalizador en fro de paladio puede ser inactivado en la jarra por la
produccin de SH2 u otros productos voltiles de las bacterias.
Se recomienda reemplazarlo por uno nuevo o uno reactivado cada vez que se
utiliza la jarra.
Puede reactivarse mediante el calentamiento en estufa a 160-170C durante 2
horas. Luego se guarda en un secador.
En estos sistemas las condiciones anaerbicas se producen o bien utilizando un
sobre generador de gases o mediante la tcnica de evacuacin-reemplazo.
En la tcnica de anaerobiosis por evacuacin-reeplazo se extrae el aire de la jarra
hasta 51-61 mm Hg, luego se lava con corriente de N 2. Este procedimiento se
repite dos veces.
Por ltimo se llena la jarra con una mezcla anaerbica de N 2:85%, CO2:5% e
H2:10%.
En la tcnica del sobre generador de gases se emplean sobres conteniendo, por
ejemplo, cido ctrico o tartrico, bicarbonato de sodio y borohidruro de sodio.
En el momento de utilizarse se corta el extremo del sobre y se hidrata con un
volumen de agua, luego se cierra inmediatamente la jarra.
En el sistema se producen las siguientes reacciones:
C6H8O7 + NaHCO3
NaH4 B + 2 H2O

Na3(C6H5O7) + 3 H2O + 3 CO2

NaBO2

+ 4 H2

El H2 generado reacciona con el O2 del aire, en presencia del catalizador produciendo

H2O.
Dentro de la jarra se colocar un indicador de Eh, independientemente de la tcnica
empleada. Para lo cual se encuentra en el comercio tiras de azul de metileno que en
condiciones de anaerobiosis vira del azul al blanco.
Una alternativa consiste en colocar dentro de la jarra un tubo de ensayo con unos
mililitros de una mezcla de azul de metileno + NaCO 3 + glucosa.
El indicador es azul cuando est oxidado e incoloro cuando est reducido. El
cambio de color ocurre alrededor de los +11 mv.
Conjuntamente con el viraje del indicador de Eh ocurre un calentamiento de la tapa
de la jarra luego de los 40 minutos y se observa condensacin en la superficie
interna dentro de los 25minutos.
La tcnica E/R resulta ms econmica que el generador de gas y permite que las
condiciones de anaerobiosis se establezcan ms rpidamente.
En los sistemas sin catalizador la anaerobiosis se logra mediante Fe finamente
dividido, cido ctrico, CO3Na2 y tierra silcea como soporte (Kit comercial Merck). En
el momento de usar se humedece con un volumen de agua, el O 2 del aire es fijado
con avidez por el Fe dando los siguientes productos:

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Fe(OH)2 + Fe(OH)3 + Fe2O3 + FeO + H2 + CO2
En breve tiempo se registra el descenso del O 2, creando una atmsfera anaerbica
rica en CO2.

La tcnica empleada en el TP es una adaptacin del Kit comercial.

Se utiliza lana de Fe embebida con una solucin cprica (CuSO 4.5H2O al 0.5%,
tween 80 0.25%, pH 2).
Como generador de CO2 se coloca un tubo conteniendo una solucin acuosa de
KHCO3 y cido ctrico.
2-Cmara anaerobia de guante
Una cmara anaerobia de guante es un sistema anaerobio autoabastecido que
permite procesar muestras y realizar la mayor parte de las tcnicas bacteriolgicas
para aislamiento e identificacin de bacterias anaerobias sin exposicin al aire.
Pueden construirse de diferentes materiales, incluyendo acero, acrlico o fibra de
vidrio. La ms ampliamente usada es la de plstico vinlico flexible.
Una vez adquiridas el funcionamiento de estas cmaras es econmico porque
permiten el uso de medios convencionales y el costo de los gases es mnimo.
Los materiales se colocan y se retiran de una pre-cmara flexible. Las condiciones
anaerobias se mantienen por una constante recirculacin de la atmsfera dentro
de la cmara plstica (85%de N2. 10% de H2 y 5% de CO2) a travs de un
catalizador de paladio en fro.

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3-Medios PRAS en tubos arrollados

Esta tcnica utiliza medios PRAS: medios previamente reducidos y
anaerbicamente esterilizados.
El medio se envasa en tubos con tapn de caucho butlico bajo gas libre de O 2 y se
esterilizan y mantienen en ambiente anaerbico.
Luego de esterilizados se enfran en una mquina giratoria lo que resulta en una
capa fina de agar en la superficie interna de los tubos.
El sistema requiere el agregado de un agente reductor, como L-cistena en la
frmula del medio de cultivo.
Todas las inoculaciones de estos medios sean lquidos o slidos se realizan bajo
corriente de CO2.
Cada tubo con PRAS se convierte as en su propia cmara de cultivo anaerbico y
puede ser colocado en un incubador de aire ambiental para su incubacin.
Permiten la inspeccin de las colonias en cualquier momento sin la exposicin al
O2.
Distribucin en la naturaleza de las bacterias anaerbicas.
Las bacterias anaerbias estn ampliamente distribuidas en la tierra, pantanos,
sedimentos de lagos y ros, ocanos, aguas residuales, alimentos y animales.
La mayor parte de estas hbitat tienen una tensin de oxgeno baja y un Eh
reducido, resultantes de la actividad metablica de los microorganismos que

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consumen oxgeno a travs de la respiracin. Si el oxgeno no es reemplazado, se
mantienen las condiciones anaerobias en el ambiente.
Importancia de las bacterias anaerobias
a-

En bacteriologa clnica: los microorganismos anaerobios pueden dar

cualquier tipo de infeccin, muchas de alta gravedad. Estos microorganismos
pueden pasar inadvertidos, ya que lo ms comn es encontrarlos en cultivos
mixtos.
bEn el control sanitario de alimentos: como ejemplos Clostridium
perfringens y Clostridium Botulinun causan el deterioro de alimentos e
intoxicaciones graves. En estos casos es necesario demostrar la presencia
de la toxina, el aislamiento y la tipificacin del germen.
cEn la industria:
Fermentacin de hidratos de carbono, distintas especies del gnero
Clostridium producen acetona, butanol e isopropanol. Actualmente, la
sntesis qumica ha desplazado en parte al proceso microbiolgico.
Procesos fermentativos en los que se utilizan bacterias fermentativas y
bacterias anaerobias estrictas.
B. metanognicas
An. estrictos

Hidratos de carbonos

An. facultativas

Ac. Grasos + alcoholes + CO2 + H2

CH4
Procesamiento y examen de una muestra para el aislamiento de bacterias
anaerobias
El procesamiento mnimo debe incluir:
1-

La observacin directa-Caractersticas microscpicas. Los frotis

de las muestras deben ser examinadas previamente coloreados por la
tcnica de Gram. Este paso es muy importante porque puede sugerir la
presencia de bacterias anaerobias que se caracterizan por su coloracin
irregular y pleomorfismo. Adems orientar sobre los medios selectivos a
utilizar y servir como control de calidad, debiendo recuperarse todos los
tipos morfolgicos en proporcin aproximada a la que se observ.
2Siembra en medios slidos-Relacin con el O 2.Se siembra: una
placa de agar sangre en aerobiosis, otra en anaerobiosis una tercera
placa en microaerofilia. La microaerofilia se logra colocando en un
recipiente hermtico una vela encendida que al extinguirse dar una
atmsfera con 4% de O2 y 5-10% de CO2 aproximadamente.
3Siembra en medios lquidos. Los medios lquidos, como el
tioglicolato, deben ser purgados antes de la siembra y suplementarse con
vitamina K y CO3HNa.
Se inoculan con pipeta Pasteur llegando al fondo y sin introducir aire. Los
medios de cultivo lquidos son considerados el respaldo de los medios
slidos.

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Los cultivos de bacterias anaerobias son de desarrollo lento, por lo tanto
deben incubarse 48 hs. antes de la primera observacin.
Los cultivos negativos se mantienen en incubacin durante dos semanas
con observaciones peridicas.
4Aislamiento de las colonias desarrolladas. Deben verificarse la
anaerobiosis y observar las caractersticas macroscpicas.
Realizar la observacin microscpica previa coloracin de Gram. Siembra
en medios selectivos
5Pruebas bioqumicas destinadas a la identificacin del
microorganismo. Se recurre en primer lugar a un conjunto de pruebas
bioqumicas que permiten la identificacin en grupos preliminares. Luego,
dentro de cada grupo se procede a la identificacin definitiva. Existen en
el comercio microsistemas completos para la identificacin de los
anaerobios por ejemplo: API-20 y Minitek.
La identificacin de los anaerobios tambin puede llevarse a cabo
mediante el anlisis de los productos metablicos de la fermentacin,
cidos voltiles y no voltiles, por cromatografa lquido-gas.