UNILASALLE

CENTRO UNIVERSITARIO LASALLE

Disciplina 02775

BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

Regente: Prof. Mauricio Pereira Almero

AULA 9
Organizao gnica em eucariotos e procariotos
Extrao de DNA, PCR e Sequenciamento

ORGANIZAO
GNICA:
Procariotos
Eucariotos

GENES

http://passel.unl.edu/pages/printinformationmodule.php?idinformationmodule=957882007

GENES

http://jp.senescence.info/thoughts/genetic_engineering.html

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
HAPLIDE e CIRCULAR
Pequeno: 4,6x103 kb (Escherichia coli)
PRATICAMENTE SEM INTRONS (colinearidade)
DNA NO ASSOCIADO A HISTONAS

APRESENTA OPERONS
SUPERPOSIO de GENES
GENES PRXIMOS ORIGEM DE REPLICAO
DNA ACESSRIOS
Plasmdeos, Bacterifagos e Elementos transponveis

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
IMPORTNCIA da HAPLOIDIA
EXPRESSO DE TODOS OS GENES
SEM RELAO DE DOMINNCIA

MUTAES SO SEMPRE
EXPRESSADAS
SELEO NATURAL

http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/User:Alexei_Ilinykh/Sandbox_1

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS

http://slideplayer.com.br/slide/50886/

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
COLINEARIDADE: Nucleotdeos x Aminocidos
Seqncia de Cdons (DNA) IGUAL seq. de AA
No h processamento de RNA (geralmente)
No h INTRONS (geralmente)
Economia de espao

http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture13.html

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
OPERON
Conjunto de genes nos procariotos (e em alguns eucariotos) que se
encontram funcionalmente relacionados, contguos e controlados
coordenadamente, sendo todos expressos em apenas um mRNA.

CONSIDERAES
OPERON
O modelo do Operon foi desenvolvido para explicar a regulao dos
genes que codificam as enzimas necessrias para o uso de lactose em
E. coli, onde a transcrio de um conjunto de genes estruturais
contguos regulados por dois elementos controladores.

Um destes elementos, o gene regulador, codifica um repressor, que,

sob condies apropriadas, se liga ao segundo elemento, o operador.
O operador sempre contguo ao(s) gene(s) estrutural(ais) cuja
expresso ele regula. Quando o repressor est ligado ao operador, ele
impede estericamente que a RNA polimerase transcreva os genes
estruturais do Operon. A transcrio iniciada em promotores que
precedem os genes estruturais na extremidade 5 e so contguos
regies operadoras. Sendo assim, as regies operadoras esto
geralmente situadas entre os promotores e os genes estruturais que
eles regulam.

CONSIDERAES
OPERON
Operon lac

http://www.icb.ufmg.br/labs/lbcd/grupo7/iniciar/aulaexp/exp1-2.html

https://www.youtube.com/watch?v=oBwtxdI1zvk

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
SUPERPOSIO DE GENES
COMPACTAO DO GENOMA
PRODUO DE DIFERENTES PROTENAS

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
GENES PRXIMOS ORIGEM DE REPLICAO
AUMENTO NO NVEL DA EXPRESSO GNICA
Genes mais importantes

http://wwwabi.snv.jussieu.fr/erocha/research/order.html

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
DNA ACESSRIO (plasmdeos)

http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
DNA ACESSRIO (plasmdeos)
Extracromossmico - 1 a 200 kb

Replicao Autnoma
Tem sua prpria origem de replicao
Plasmdeos Grandes - nicos (cpia-nica)

Plasmdeos Pequenos - vrias cpias (multicpia)

Funo no essencial vida:
Fixao de nitrognio PLASMDEOS COL
Reprodutivos PLASMDEOS F
Resistncia a antibiticos PLASMDEOS R
Metais pesados e toxinas bacterianas OUTROS PLASMDEOS.

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
PLASMDEOS COL
Relacionados fixao do nitrognio no solo;

http://oquimiajuda.blogspot.com.br/2011/05/especial-moleculas-gas-nitrogenio.html

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
PLASMDEOS F
Transferem genes (plasmdeos) para outras bactrias
Codificao o pilli F ou sexual

Promoo contato ou conexo entre clulas - CONJUGAO

Transferncia do material

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
PLASMDEOS F

https://www.youtube.com/
watch?v=VU7brO7A36w

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
PLASMDEOS R
Relacionados resistncia antimicrobiana;

http://scienceblogs.com.br/meiodecultura/tag/plasmideo/

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
OUTROS PLASMDEOS
Metais pesados e toxinas bacterianas

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0085487

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
PLASMDEOS (DNA RECOMBINANTE)
Clonagem molecular
Engenharia gentica
Indstria: produo de
biofrmos, enzimas de
interesse comercial,
Agricultura: plantas
transgnicas
http://soumaisenem.com.br/biologia/engenharia-genetica/tecnologia-do-dna-recombinante

Veterinria: animais
transgnicos

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
BACTERIFAGOS (vrus de bactrias)
Ciclo ltico - reproduo do prprio material
Ciclo lisognico - incorporao do prprio material

Transduo restrita

reproduo

Transduo generalizada

http://people.audrn.net/profiles/blogs/the-capture-of-cytos-by
http://wikiciencias.casadasciencias.org/wiki/index.php/Bacteri%C3%B3fago

ORGANIZAO GNICA
DE PROCARIOTOS
BACTERIFAGOS (vrus de bactrias)

http://people.audrn.net/profiles/blogs/the-capture-of-cytos-by

ELEMENTOS GENTICOS
TRANSPONVEIS

RECOMBINAO STIO-ESPECFICA
RECOMBINAO STIO-ESPECFICA
GUIADA por uma ENZIMA de RECOMBINAO
RECONHECE SEQUNCIAS ESPECFICAS
NO NECESSITA PAREAMENTO de BASES (homologia)
DESCOBERTA em BACTRIAS/vrus
CAPACIDADE de CERTOS VRUS de INTEGRAR seu GENOMA ao da BACTRIA
GENES que CODIFICAM INTEGRASES
RESPONSVEIS pela TRANSPOSIO

ORGANIZAO GNICA
ELEMENTOS TRANSPONVEIS (TRANSPOSONS)
GENES QUE MUDAM DE POSIO NO GENOMA
PROCARIOTOS (e EUCARIOTOS)

MESMO CROMOSSOMO

DESLOCAM-SE no GENOMA
CROMOSSOMOS DIFERENTES
LONGOS PERODOS de QUIESCNCIA

NO ABANDONAM a CLULA
SEM CAPACIDADE INFECCIOSA

ORGANIZAO GNICA
CARACTERSTICAS (TRANSPOSONS)
% nos procariotos? (46% do Genoma Eucaritico)
AMBAS as EXTREMIDADES com SEQUNCIAS SIMILARES
REPETIES TERMINAIS STIOS para ENZIMAS
NORMALMENTE CODIFICAM a ENZIMA para a TRANSPOSIO
TRANSPOSASES
CRIAM DUPLICAES do STIO de INSERO, no DNA ALVO
REPETIES DIRETAS = orientadas no mesmo sentido
EXISTEM em CPIAS MLTIPLAS no GENOMA
PRINCIPAL FONTE de MUTAES no GENOMA

ORGANIZAO GNICA
MECANISMO GERAL de TRANSPOSIO

https://www.youtube.com/watch?v=0d76-gbOYtg

ORGANIZAO GNICA

ORGANIZAO GNICA
Importncia (TRANSPOSONS)

ORGANIZAO GNICA
DE EUCARIOTOS
HAPLIDE e CIRCULAR
DIPLIDE E LINEAR

Cromossomos (organizados
em pares de homlogos);

ORGANIZAO GNICA
DE EUCARIOTOS
PRATICAMENTE SEM INTRONS (colinearidade)
PRESENA DE INTRONS

http://pt.wikipedia.org/wiki/Usu%C3%A1rio:Yleite/DNA_n%C3%A3o-codificante

ORGANIZAO GNICA
DE EUCARIOTOS
DNA NO ASSOCIADO A HISTONAS
DNA ASSOCIADO A HISTONAS

http://colegioamerica.edu.uy/MATERIAL/BIOLOGIA/Seccion%203/3%20-%20Capitulo%2017.htm

ORGANIZAO GNICA
DE EUCARIOTOS
APRESENTA OPERONS
AUSNCIA (raras excees) DE OPERONS

Exceo

Caenorhabditis elegans
Nematdeo: 15-25% dos genes

ORGANIZAO GNICA
DE EUCARIOTOS
SUPERPOSIO de GENES

NO H SUPERPOSIO de GENES

http://nar.oxfordjournals.org/content/30/20/4432/F1.expansion

http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/pietas-agnieszka-2004-11-22/HTML/chapter1.html

ORGANIZAO GNICA
DE EUCARIOTOS
ACMULO DE GENES PRXIMOS ORIGEM DE REPLICAO

NO H ACMULO GENES PRXIMOS ORIGEM DE REPLICAO

http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication.htm

ORGANIZAO GNICA
DE EUCARIOTOS
DNA ACESSRIOS
DNA ACESSRIOS

http://www.wisegeek.com/what-is-mitochondrial-dna-analysis.htm#didyouknowout

http://evolutionaryroutes.wordpress.com/2011/08/31/the-taming-of-the-chloroplast/

ORGANIZAO GNICA
PROCARIOTOS EUCARIOTOS
Procariotos genomas menos complexos,
pequenos, circulares, poucos genes, operons e
unidades genticas acessrias.
Eucariotos genomas mais complexos,
grandes, lineares, muitos genes, sem operons e
sem unidades genticas acessrias.

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)

http://www.ufrgs.br/labimet/membros/apoio-tecnico/

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Diferentes salas;
Sala para extrao;
Sala para PCR;
Sala para revelao do gel;

Diferentes bancadas;

http://www.lance-ufrj.org/estrutura-e-arredores.html

Diferentes finalidades
(manipulaes e
equipamentos);

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Capela de exausto
EPC;
EVACUAO - produtos
qumicos, txicos, vapores
agressivos, partculas ou lquidos
em quantidades e concentraes
perigosas, prejudiciais para a
sade;
http://apendiciencia.blogspot.com.br/2011_05_01_archive.html

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Capela de Fluxo laminar
Cmara quase isolada onde ar
filtrado

constantemente
injetado em uma s direo na
rea de trabalho por um motor,
garantindo
um
ambiente
renovado e limpo;

http://www.analiticaweb.com.br/produtos_detalhe.php?an=7d06ca3e128bc079be1349975e0f6b98&Bid=p46c062c88277d

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Estocagem de reagentes e amostras
4C (geladeira) - REAGENTES;
-20C (freezer) DNA/RNA;
http://www.lojasbrejao.com.br/ofertas/geladeira-arnofacilite-crb39-342lts/

http://decoracao.vocedeolhoemtudo.com.br/utensilios/freezer-vertical/

Atividades de enzimas de degradao

(DNAases e RNAases);

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Destilador de laboratrio
gua destilada (bidestilada ou tridestilada);
MilliQ (gua milli-Q
ou gua deionizada ou
gua ultrapura);
GUAS PURAS

http://www.joinville.udesc.br/portal/departamentos/de
c/labmes/equipamentos.php

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Vidraria
Erlenmeyer

Bcker

Vidro borosilicato

http://www.fcf.usp.br/Departamentos/FBF/Disciplinas/Farmacotecnica/instrum
entos/BEQUER1.HTM

http://pt.wikipedia.org/wiki/Erlenmeyer_(bal%C3%A3o)
http://www.prolab.com.br/vidrarias-para-laboratorio/frascos/frasco-reagentegraduado-tampa-azul-

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Outros materiais
Pipetas

Ponteiras

Tubos

http://www.jprolab.com.br/produtos_detalhe.php?idProdut
o=16&Cat=1
http://personal.us.es/cubo/

http://pos.icb.ufg.br/pages/37159-boas-praticas-e-manuseio-das-pipetas-htl

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Esterilizao
Autoclave (calor mido sob presso);
Ponteiras, meios de cultura, gua
destilada, tubos eppendorfs, etc;

http://labsetupsolutions.com/autoclaves/

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Isolamento de cidos nuclicos
Picotador de gelo
(manuteno de DNA e RNA);

http://econolab.com.br/v2/?wpsc-product=maquina-de-gelo-em-escamas-40kg-dia-hexicryo

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Isolamento de cidos nuclicos
Banho maria (5C acima da Tamb
at 120 C);

http://www.prolab.com.br/produtos/equipamentos-para-laboratorio/banho-maria-para-laboratorio

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Isolamento de cidos nuclicos
Centrfugas (macro e
microcentrfugas);

http://www.labosistema.pt/default.aspx?tabid=67&c
ategoryid=24&category=centrifugas_de_bancada&l
anguage=en-us

http://www.analiticaweb.com.br/produtos_detalhe.p
hp?an=6291ba38f669ab42df583d33c40e80e1&Bid
=p4519788614715

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Migrao (cidos nuclicos e amplificados)
Cubas de eletroforese;

http://www.prolab.com.br/produtos/equipamentos-para-laboratorio/cubas-de-eletroforese

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Amplificao de genes
Termicicladores;

http://www.scilifesolutions.co.uk/products-page/pcr/te-peltier-cooling-pcr-thermocycler/

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA (Bsica)
Boa foto = bom
diasnstico;

Revelao (gel)

http://dc388.4shared.com/doc/BJ4wYJVY/preview.html
http://www.alphalabs.co.uk/product-information/molecular-biologyproducts/clarit-e-Electrophoresis-Systems/electrophoresisaccessories.aspx

LABORATRIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
Regras gerais de segurana:
Bom senso:
nunca trabalhar sozinho (corpo tcnico);
no comer ou beber na bancada;
no cheirar solues ou reagentes;
nunca pipetar com a boca;
sempre usar jaleco e luvas;
lavar imediatamente a pele aps contato com
reagentes qumicos;
etc;

INTRODUO TCNICAS EM BM

Extrao de DNA

Objetivo;
Procedimentos gerais;
Mtodos;

INTRODUO TCNICAS EM BM

Objetivo
Maior recuperao de DNA (ex: xng);
Remover o mximo de inibidores;
Remover ou inibir nucleases;
Maximizar a qualidade de DNA extrado;

INTRODUO TCNICAS EM BM

Procedimentos gerais
Ruptura ou lise celular

(ex. ruptura mecnica,

solubilizao com detergentes e
sonicao)

Agentes quelantes

(EDTA, citrato)
Removem ctions divalentes
necessrios para atividade de
nucleases

Desnaturao ou inativao
de protenas
(ex. proteinase k)

Liberao e separao dos

cidos nuclicos de
protenas
(mtodo de extrao)

Precipitao

(ex. etanol e isopropanol)

RNase
(remover RNA)

INTRODUO TCNICAS EM BM

Procedimentos gerais

https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/microbial-genetics7/tools-of-genetic-engineering-82/southern-blots-451-11697/

http://maswheat.ucdavis.edu/education/animations/anim_dna.htm

INTRODUO TCNICAS EM BM

Tipos de material
Tecidos animal (muscular, reprodutivo,
sanguneo, sseo, etc);
Tecido vegetal (folhas)
Fezes;
gua;
Solo;

INTRODUO TCNICAS EM BM
o

Mtodos
Extrao Fenol-Clorofrmio (orgnico);
Extrao Chelex (resina de troca inica);
Extrao com NaCl (no-orgnico);
Kit comercial;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao Fenol-Clorofrmio
Procedimentos gerais
1) Lise celular;
2) Digesto de protenas;
3) Liberao de DNA na soluo e remoo de DNA
protico;
4) Precipitao do DNA da soluo aquosa;
5) Purificao do DNA;
6) Secagem e armazenamento;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao Fenol-Clorofrmio
Reagentes (funes e composio)
1) Lise celular (tampo):
- SDS (Sodium Dodecyl Sulfate): surfactante
detergente aninico;
- EDTA (EthyleneDiamine Tetracetic Acid): agente
quelante que remove ctions divalentes essenciais para
atividade de nucleases. Extrao: EDTA 0,5M pH=8,0
(NaOH);
2) Digesto de protenas:
- Proteinase k enzima proteltica usada para digerir,
desnaturar ou inativar nucleases;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

*composto orgnico inibidor enzimtico

o Extrao Fenol-Clorofrmio
3) Liberao de DNA na soluo e remoo de DNA
protico
- Fenol: equilibrado com tampo (TE Tris*/EDTA).
Contem 0.1% hidroxiquinolina (cor amarelada) and 0.2%
b-mercaptoetanol (funes antioxidantes).
- Clorofrmio/lcool isoamlico: frequentemente
preparado a 24:1 (v/v). Auxilia na preveno de
formar espuma.
Informaes adicionais:
- Fenol+clorofrmio desnaturam as protenas;
- Fenol - Solubilidade diferencial de protenas, lipdios e
cidos nuclicos;
- Clorofrmio auxilia na eliminao de traos de fenol;
- lcool isoamlico auxilia na separao da fase aquosa da
fase com fenol;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao Fenol-Clorofrmio
4) Precipitao do DNA da soluo aquosa (concentrao do
DNA)
- Etanol 95% (frio) (2 volumes)
- Isopropanol (lcool isoproplico) (1 volume)
- Sal: Acetato de sdio
5) Purificao do DNA
- Etanol 70%: auxilia na purificao do DNA, pois alguns
solutos podem ser precipitados.
6) Secagem e armazenamento
- Temperatura ambiente ou vcuo;
- Ressuspendido em TE;
- Armazenado em -20C (4C);
Informaes adicionais:
- Isopropanol menos voltil do que etanol e, por isso,
mais difcil de ser eliminado. Alm disso, solutos como o
Cloreto de Sdio so mais facilmente coprecipitados
quando utilizado o isopropanol.

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao Fenol-Clorofrmio
Na prtica: http://www.youtube.com/watch?v=JNl1kjw9ZDQ

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao orgnica (Fenol-Clorofrmio)
Prs:
- produz quantidades relativamente puras de DNA de alto peso
molecular;
- DNA dupla fita;
Contras:
- Demorado;
- Risco aumentado de contaminao da amsotra (muitas trocas de
tubos);
- Utilizao de reagentes txicos;
Informaes adicionais:
- Fenol: O fenol (hidroxibenzeno) corrosivo e irritante das membranas mucosas.
Potencialmente fatal se ingerido, inalado ou absorvido pela pele. Causa queimaduras
severas e afeta o sistema nervoso central, fgado e rins (Wikipdia);
- Clorofrmio: Pode ser fatal se for aspirado ou inalado. Causa irritao pele, olhos e
trato respiratrio. Afeta o sistema nervoso central, rins, sistema cardiovascular e
fgado. Pode causar cncer dependendo do nvel e durao de exposio (Wikipdia).

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao Chelex
Procedimentos gerais
1) Lise celular e remoo de contaminantes e inibidores;
2) Digesto de protenas;
3) Armazenamento;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao Chelex
Reagentes (funes e composio)
1) Lise celular e remoo de contaminantes e inibidores
- Soluo de Chelex 5% (5g/100ml)
2) Digesto de protenas
- Aquecimento 95-100C;
3) Armazenamento
- Armazenado em -20C (4C);
Informaes adicionais:
- Chelex 100: composto de copolmeros de estireno divinilbenzeno contendo ons de
iminodiacetato que atuam como grupos quelantes, ligando ons polivalentes como Mg2+.
Atravs da remoo do Mg2+, as nucleases so inativadas e, o DNA protegido.

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Introduo s tcnicas de BM bsicas

o Extrao Chelex
Prs:
1) Mtodo relativamente rpido;
2) Contaminao minimizada;
3) Elimina inibidores de PCR;
Contras:
1) Produz DNA fita simples;
2) O DNA degrada mais rpido com relao ao extrado por
Fenol-Clorofrmio?!?!;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Gel de agarose
1) Preparao
- Agarose, gar-gar ou gar: um hidrocolide extrado de diversos
gneros e espcies de algas marinhas vermelhas que consiste em uma
mistura heterognea de dois polissacardeos, agarose e agaropectina;
- Preparao: agarose+soluo tampo TE (TEB ou TAE);
- Concentrao: 0,5%-2% (ex. 1% - 0,3g agarose + 30ml TAE 1x);

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Gel de agarose
2) Aplicao
- Com as amostras de DNA (~5L), aplicada tambm uma amostra cuja
concentrao conhecida. O DNA do bacterifago em concentraes
conhecidas de 20, 50, 100 e 200 ng/L geralmente utilizado;

*Ladders: marcadores
de peso molecular

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Gel de agarose
3) Corrida
- Eletroforese (separao de fragmentos);
- Princpio: cidos nuclicos possuem uma carga devido a grupamentos
fosfato. Sob condies apropriadas (tampo TEB ou TAE) que so
responsveis pela desnaturao das conformaes secundrios e
tercirias, fragmentos lineares simples migram mais rapidamente do que
longos, em uma matriz de separao (agarose ou acrilamida meios
porosos). Sob as mesmas condies, DNA fita simples migra mais
rapidamente do que DNA fita dupla.
- Tampo de colorido;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Gel de agarose
4) Visualizao
- Corantes intercalantes (fluorescem sob luz UV)
*Brometo de etdio (Bet): Quando se expe esta substncia a luz
ultravioleta, emite uma luz vermelho alaranjada, que se intensifica ~20
vezes depois de haver-se unido a uma cadeia de DNA.
*GelRedTM: Usa o mesmo princpio do Bet, mas... muito mais sensvel,
estvel e seguro (ambiente e sade humana)

Bet

GelRed

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Gel de agarose

5) Fotodocumentao

- Direta;
- Cmara;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Gel de agarose
6) Interpretao
- Resultado;

Ladders

Ladders

Amostras

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Mtodo espectrofotomtrico
1) A absorbncia a 260nm proporcional quantidade de cidos nuclicos;
2) A absorvncia a 280nm proporcional quantidade de protenas e fenol,
a 325nm proporcional quantidade de partculas em suspenso e outros
e 230 nm proporcional quantidade de contaminantes orgnicos;
3) O grau de pureza frequentemente estimado atravs da razo
A260/A280 que deve ser entre 1,8 e 2,0 (abaixo de 1,8 a amostra estaria
contaminada com protena e fenol);

Absorbncia
260nm

Equivalncia
~50g/ml dsDNA
~37g/ml ssDNA
~40g/ml ssRNA
~20g/ml oligonucletidos (ss)

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Picogreen (Invitrogen)
1) O PicoGreen apenas emite fluorescncia quando se liga com o DNA dupla

fita. Se esse reagente no est ligado molcula de DNA no apresenta

colorao e, consequentemente, no detectada fluorescncia
2) So necessrias outras amostras com DNA j quantificado para calibrar a
curva padro;
3) Atravs fa fluorescncia emitida por essas amostras, possvel
mensurar, de forma acurada a quantida de DNA;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Determinao da concentrao e grau de pureza

Prs e contras
1) Gel de agarose: prs barato; contra: inacurcia e toxicidade
(bet);
2) Espectrofotometria: prs rpido e barato; contras: inacurcia
(calibragem)
3) Picogreen: prs alta acurcia; contras: demorado, consome
muitas ponteiras (amostras para a curva padro devem ser
realizadas com rplicas ou trplicas)

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Geral
1) Processo termodinmico e enzimtico de polimerizao
do DNA atravs de reaes cclicas;
2) Inventada em 1983 por Kary Mullis (Prmio Nobel de
Qumica 1993);
3) Uma das tcnicas mais comuns utilizadas em laboratrios
de pesquisas mdicas e biolgicas (sequenciamento de
genes de interesse, diagnsticos de doenas hereditrias
e infecciosas, testes de paternidade, medicina forense e
outros);
4) Tipos de PCR:
5) Apesar de ser amplamente utilizada ainda
- Conventional;
muito misteriosa...(mal entendida?)!

- Hot start;
- In situ;
- Inverse;
- Long;
- Multiplex;
- Nested;
- Competitive;
- Touchdown;
- Degenerate;
- Fast;
- Real-time;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Reagentes
1) DNA;
2) dNTPs (desoxirribonucleotdeos trifosfatos);
3) DNA polimerase (Taq DNA polimerase ou Taq suporta elevadas T);
4) Inciadores (primers);
DNA
dATP
5) Soluo tampo;
Taq polimerase
dCTP
Primers
6) gua (destilada ou Milli-Q);
dGTP
Tampo

gua

Thermus aquaticus

Milli-Q

dTTP
(nucleotideos)

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Reagentes
7) Magnsio (Mg++)
- Mg++ um co-fator enzimtico que desempenha um papel de extrema
importncia na atividade da enzima Taq;
- Sua concentrao em torno de 1,5 mM aplicvel a maioria das
necessidades;
- Se a concentrao de Mg++ muito baixa, temos pouco ou nenhum produto;
- Se a concentrao de Mg++ muito elevada, a PCR tem baixa
especificidade e, assim pode gerar um arraste (smear);
- Adicionado no tampo ou jusnto com a reao;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Etapas
1) Desnaturao (desnaturation) D
D
1) 2 (95C)
- O DNA desnaturada a altas T (94-96C);
2) 50 (95C)
D A
3)
50
(52C)
2) Associao (annealing) A
x35
4) 1 (72C)
- Ligao dos iniciadores (primers) nas regies de 5) 5 (72C)
E
interesse;
6) i (4C)
3) Extenso (Extension)
E polimerase (DNApol);
- Ligao e ativao da DNA
- Atravs da adio de nucleotdeos nas extremidades 3
dos iniciadores (normalmente 70C atividade tima da
DNApol);
Termociclador
- Taq: 1000 nt a cada 30 s (72C);

http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Etapas
- Final: Nmero de cpias de 1 molcula de DNA aps 34
ciclos: 1.580.000.000;
CYCLE NUMBER
AMOUNT OF DNA

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34

1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1,024
2,048
4,096
8,192
16,384
32,768
65,536
131,072
262,144
524,288
1,048,576
2,097,152
4,194,304
8,388,608
16,777,216
33,554,432
67,108,864
134,217,728
268,435,456
536,870,912
1,073,741,824
1,400,000,000
1,500,000,000
1,550,000,000
1,580,000,000

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Problemas e comentrios adicionais
1) Qualidade de DNA
2)Taq polimerase (diferentes tipos)
- Baixa fidelidade (incorporao de nucleotdeos errados ausncia de
proofreading);
- Quantidade 2,0-2,5 U (0,5 l) em um volume final de 100 l. Caso seja
colocada uma quantidade muito maior isso pode inibir a reao;
- Sensvel a descongelamento e agitao excessiva;
Formao de ala
2) Primers
- Evitar excesso;
Autocomplementaridade (alas);
- Complementaridade (dmeros);
- Bom desenho de primers (programas ex. Primer3);

GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT

HOTGACTTC

ACTGAA

Tm = 71oC

Formao de primer dimer

Temperatura de
anelamento
(Tm)

Contedo GC (%GC)
Primers de 20nt
Tm= 4 x (C + G) +2 x (A + T)

5 GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3
5 CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH3

3OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC
GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH 3

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Problemas e comentrios adicionais
3) dNTPs
- A concentrao numa reao pode variar de 20 a 200 M sendo importante
que as quatro devam variar em concentraes equivalentes;
- Quando esto em excesso (um nucleotdeo ou todos) podem ocorrer erros
de incorporao de bases, gerando cpias alteradas;
- Sensveis a descongelamentos consecutivos;
4) Temparatura de anelamento;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Purificao dos produtos de PCR

Porque purificar o DNA?
1) Evitar problemas no sequenciamento (a PCR deve estar limpa e sem
contaminantes);

Bandas inespecficas
A

C+

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Purificao dos produtos de PCR

Como purificar o DNA?
1) Kits comerciais (geralmente mais eficientes mas, mais caros) ;
2) Protocolo ExoSap:
- Combinao de duas enzimas: Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), que
degrada os nucleotdeos no incorporados e a Exonuclease I (EXO), que
degrada primers residuais e demais produtos simples fita no desejveis.
- Protocolo: 8 L de PCR + 0,5 l de Exo I (10U/l) + 1 l SAP (1U/ l).
Incubar em termociclador por 1 hora 37C e 15 minutos a 80C.
Conservar a 4C.

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Hot Start PCR

A enzima DNA polimerase pode demonstrar uma pequena

atividade temperatura ambiente, durante a montagem do
experimento;
Pode catalisar a extenso da extremidade 3`, levando depois a
degradao da extremidade 5`(a DNApol possui atividade
exonuclease) e, assim destruindo o primer e o substrato;
Hot Start permite a inibio da atividade da polimerase
durante o preparo da reao: A DNApol esta ligada a anticorpos
(ant) e no funciona a temperatura ambiente;
O aumento da temperatura libera os ant e a reao se inicia;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

In situ PCR

Reao de PCR que ocorre

dentro da clula numa lmina;
Pode ser realizado em
clulas ou tecidos fixados;
til para acompanhar
infeces;

http://www.lf2.cuni.cz/Projekty/prusa-dna/newlook/defa4.htm

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Inverse PCR (IPCR)c

DNA
cortado
em
pequenos
fragmentos por enzimas de restrio;
Ligao do produto DNA circular;
DNA novamente tratado com
enzimas de restrio gera produtos
com sequencia interna conhecida, que
pode ser usada na PCR;
PCR realizada com primers
complementares s sequncias internas
de interesse;
http://link.springer.com/protocol/10.1385%2F1-59259-686-X%3A79#page-1

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Long PCR

PCR cuja extenso mais longa

que as PCR convencionais (> 5Kpb);
DNApol amplifica alvos maiores;
- alta fidelidade (6.5x) prooreading;
Objetivos:
- Clonagem de cDNA de longos
transcritos;
- Mapeamento de sequncias;
- PCR de genoma mitocondrial;

http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/long-and-accurate-dna-amplification.html

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Multiplex PCR

PCR com dois ou mais conjuntos de

primers,
para
amplificao
de
diferentes fragmentos de uma mesma
amostra;

Objetivos:
- identificao de vrios vrus
- identificao de delees em genes
em doenas degenerativas (Distrofia
muscular de Duchenne)

http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nested PCR

uma variao da PCR

convencional, na qual so utilizados
dois pares de primers (ao invs de
um) para amplificar um mesmo
fragmento;
Duas PCR: primeira com a fita
parental, em seguida em uma
segunda PCR com a fita menor;
Aumenta a especificidade!
http://www.google.com.br/imgres?imgurl=&imgrefurl=https%3A%2F%2Flaikaspoetnik.wordpress.com%2Ftag%2Fvir
us%2F&h=0&w=0&tbnid=TTbFAmfH6NcGJM&zoom=1&tbnh=209&tbnw=241&docid=ucIn
BEbhhcINM&tbm=isch&ei=tbgIVIa6H4jEggSnpILgBg&ved=0CAUQsCUoAQ

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Competitive PCR

adicionada a reao uma quantidade

conhecida de um fragmento de DNA
(competidor);

Esse
competidor
deve
conter
sequncias para os mesmos primers
utilizados para amplificar o alvo;
Quantidade de DNA-alvo pode ser
derterminada pela razo Alvo (T) /
competidor (C)

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Touchdown PCR

Modificao da PCR convencional que pode resultar na

diminuio de amplificaes no especificas;
Temperatura de anelamento
- comea mais alta que e temperatura tima de anelamento dos

primers;

- diminuio de 1C a cada um ou dois ciclos, at atingir a

temperatura especfica;
- aps atingir essa temperatura ela mantida nos ciclos
restantes;

Objetivo:
Aumentar a especificidade, evita amplificao errnea;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Degenerate PCR

O que so primers degenerados?

Primers que possuem um numero de opes
em vrias posies na sequncia
Exemplo:
5- TCGAATTCVCCYAAYTGRCCNT-3
A+C+G =V
C+T= Y
A+C+G+T= N
Objetivo: avaliar polimorfismo ;

http://acgt.cs.tau.ac.il/hyden/

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Fast PCR

Kits especficos (ex. GeneAmp Fast PCR Master Mix);

PCR pode ser realizado de forma mais rpida, para algumas
aplicaes, tais como:
- genotipagem de animais transgnicos;
- PCR de colnia;
Select primers with Tms of 6469C;
Change the initial template denaturation/enzyme activation step to
98C for 30 sec
Change the denaturation step at each cycle to 92C for 1 sec
Combine annealing and extension steps into a single step at
70C for 20 sec

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Real-time quantitative PCR

Porque a PCR convencional no uma tcnica quantitativa?

- O crescimento linear no nmero de cpias ocorre at um
determinado nmero de ciclos, ou seja, ocorre uma SATURAO;
- CAUSAS:
* Perda de atividade da Taqpol;
* Todas as enzimas disponveis esto ocupadas com a sntese de DNA;
* Acmulo de produtos amplificados que pareiam entre si (produtos
inespecficos);
* etc;

Como foi resolvido?

Diluio seriada (end-point solution)
Padro externo
Controle interno (competitivo);
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/microbiology/ch05s03.html

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Real-time quantitative PCR

Metodologia de PCR + Sistema de deteco de sinais

Fluorescentes;
Deteco, quantificao e amplificao de DNA em uma
nica etapa;
-Agilidade na obteno de resultados;

Tcnica quantitativa
- Quantificao do nmero de molculas produzidas a cada ciclo;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Real-time quantitative PCR

Etapas de amplificao de uma PCR convencional

- Temperaturas e tempos diferentes;
- Curva de dissociao;

Coleta de dados
- Fase exponencial da reao;
Reagentes de uma PCR convencional + Corante
- Intercalantes de DNA de dupla fita (dsDNA);
- Oligonucleotdeos marcados;
Plataforma de instrumentao
- Termociclador + Sistema ptico;
- Computador com software para aquisio de dados e anlise final;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Real-time quantitative PCR

PCR em Tempo Real

- Coleta de dados na fase
Exponencial;
- SEM manipulao psPCR;
- Resultados quantitativos;
- Requer concentraes de DNA/cDNA 1000 x menor;
- Tempo de reao reduzido;
- Maior reprodutibilidade, sensibilidade e preciso;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Amplificao via PCR (Polymerase Chain Reaction)

Real-time quantitative PCR

Todas as aplicaes da PCR tradicional;

Quantificao de carga viral;

Quantificao de expresso gnica;
Testes de eficincia teraputica;
Deteco de agentes infecciosos;
Caracterizao de agentes (Genotipagem)

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento
Mtodos
1) Sanger;
2) Shotgun;
3) Pyrosequencing;

Plataformas

1) Roche /454 FLX: 2004;

2) Illumina Solexa Genome Analyzer: 2006
3) Applied Biosystems SOLiDTM System: 2007;
4) Helicos HeliscopeTM : recently available;
5) Pacific Biosciencies SMRT: 2010

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento

Tcnica de didesoxi ou dideoxi (chain termination or dideoxy methodSanger) (1980-1995)

- Etapas: desnaturao, ligao do primer e extenso de bases, terminao,
eletroforese e leitura;

P
T

G
deoxinucleotdeo
OH

G
dideoxinucleotdeo

H
P

OH

http://www.youtube.com/watch?v=JHv7IxxgxW4

OH

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento

Tcnica de didesoxi ou dideoxi (chain termination or dideoxy methodSanger):

- Prs e contras: funciona bem para sequenciamento de 500-750 pb, mtodo
caro e demorado.

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento

Shotgun sequencing method (1995-2005)

1) Princpios
- Digere parcialmente o genoma (ou grande fitas de DNA);
- Etapas: fragmentao, clonagem de fragmentos em vetores, os clones so
sequenciados diversas vezes e criao de um mapa fsico para ordenar as
sequncias;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento

Shotgun sequencing method (1995-2005)

2) Prs e contras: Produz leituras menores (25-500bp), mas em nmero

muito maior em pouco tempo; alta cobertura, mas o processo de
montagem requer muito mais capacidade computacional; menor preciso
(que compensada pela alta cobertura);

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento

Pirosequenciamento (segunda gerao)

1) Princpios
- Sequenciamento por sntese, na qual luz visvel gerada e sua intensidade
proporcional ao nmero de nucleotdeos incorporados;
- Diferentes etapas;

- Durante a sntese de DNA, dNTPs so

fixados a extremidade 3 da fita sintetizada.
Duas molculas de fostato so liberadas como
(PPi).

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento

Pirosequenciamento
1) Princpios

- A enzima ATP sulfurilase utiliza PPi e

adenosiae 5-fosfosulfato para produzir
ATP ;
-A enzima Luciferase utiliza ATP para
converter luciferina em oxiluciferina e
assim, liberar luz (a quantidade de luz
liberada proporcional ao nmero de
nucleotdeos adicionados a nova fita de
DNA). Assim, se a sequncia tem 2As
seguidos, duas vezes mais luz liberada;
- Depois da reao completa, a enzima
apirase destri qualquer trao de
dNTPs;.

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento
Pirosequenciamento
1) Princpios

- Leitura (a luz detectada atravs

de uma cmera CCD especial);

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento
Pirosequenciemanto
2) Preparao de amostras

- O DNA fragmentado em (300-800 bp) e as

extremidades so polidas atravs da
remoo de qualquer base no pareada;

- Adaptadores so aderidos a cada

extremidade;
- Adaptadores contm biotina a qual se liga a
uma bead que contm na sua superfcie (cada
bead contm um nico fragmento de fita
simples de DNA).
-leo aderido as beads e uma soluo de
emulso criada (microreator);

- A PCR ento realizada dentro de cada

microreator. Ao final, cada bead produz
milhes de cpias idnticas de DNA;

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento
Pirosequenciemanto
2) Preparao de amostras

- Depois da PCR em emulso, o leo

removido e as beads so colocadas em
uma placa picotiter (em cada poo cabe
somente uma nica bead);
- As enzimas vistas anteriormente, so
aderidas as beads dentro de cada poo;
- A placa est acoplada a um chip de
fibra ptica, ligada a uma cmera CCD;

http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA

Introduo s tcnicas de BM bsicas

Sequenciamento
Pirosequenciamento
3) Prs e contras:
- Prs: Alta acurcia, mais automatizado, elimina a necessidade de primers
marcados, no necessita de eletroforese.
- Contras: produz sequncias menores e no tem uma resposta luminosa boa
depois de 5-6 nucleotdeos idnticos;

Marcadores moleculares
(marcadores gentico-moleculares)

- Um marcador molecular definido como qualquer fentipo

molecular oriundo de um gene expresso ou de um
segmento especfico de DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998);

- Entidades genticas que manifestam

herdveis de maneira mendeliana;

Trs tipos principais

MORFOLGICOS
BIOQUMICOS
DNA

polimorfismo

MARCADORES MORFOLGICOS
- At os meados da dcada de 60, os marcadores utilizados em
estudos de gentica e melhoramento eram controlados por genes
associados a caracteres morfolgicos;
- Em geral, caractersticas fenotpicas de variao discreta so
utilizadas como marcadores morfolgicos desde os tempos de
Mendel, como fentipos de fcil identificao visual, ex.: plantas.
So afetados pela ao gnica de
dominncia, efeito ambiental, pleiotropia e
epistasia
PLANTAS
PLANTA INTEIRA OU ADULTA

Por outro lado, marcadores bioqumicos ou de DNA, podem ser

utilizados a partir de amostras de clulas ou de tecidos de partes
da planta (folhas, embries, cotildones, plen, etc.) e tambm
em qualquer estgio de desenvolvimento da planta
ELETROFORESE

MARCADORES BIOQUMICOS (isoenzimas ou

isozimas)
- Na dcada de 1960, um novo tipo de marcador gentico
(proteico/enzimtico) foi desenvolvido: as isoenzimas (isozimas)

- Isoenzimas foram definidas como diferentes formas moleculares

(variantes) de uma mesma enzima, apresentando funo idntica ou
similar, presente num mesmo indivduo (Markert & Moller, 1959);
- o resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma
das enzimas;

Castro et al. (2003)

MARCADORES BIOQUMICOS (isoenzimas ou

isozimas)
- A premissa bsica de se utilizar dados enzimticos que diferenas na
mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico so resultantes de
diferenas ao nvel de sequncias de DNA que codificam tais enzimas;
- Assim, se os padres de bandas de dois indivduos diferem, assumese que estas diferenas possuem base gentica e sejam herdveis. O
controle gentico das isoenzimas ocorre atravs de vrios genes, que
podem ser alelos de um mesmo loco (aloenzimas), ou estar situados
em diferentes locos;
Vantagens em relao aos marcadores morfolgicos:
a) determinao genotpica dos locos em qualquer da planta ou indivduo,
b) ocorrncia de um nmero razovel de alelos;
c) ausncia de efeitos deletrios associados com alelos isoenzmicos;
d) herana Mendeliana simples com codominncia entre alelos na maioria
dos locos,
e) ausncia de efeitos epistticos, pleiotrpicos e ambientais.

MARCADORES BIOQUMICOS (isoenzimas ou

isozimas)
Desvantagens das isoenzimas em relao aos marcadores de
DNA:
a) Sofrem influncia ambiental;
b) Limitado em nmero;

MARCADORES DE DNA
- Marcadores de DNA so derivados de pequenas regies regies
do DNA que apresentam polimorfismo entre indivduos dentro de
uma espcie;
- Polimorfismo detectado na seqncia de DNA;
Vantagens em relao aos marcadores bioqumicos :
- No objeto de influncias ambientais;
- Potencialmente ilimitado em nmero;
*Maior desvantagem a necessidade de tcnicas e
equipamentos mais complexos.

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
SEQUENCIAMENTO
SEQUNCIA DE DNA/RNA
MARCADOR
MOLECULAR

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
MARCADORES MOLECULARES
DNA mitocondrial
(mtDNA)
Varivel em ORGANIZAO e
TAMANHO (ex: 16Kb em humanos a
500 kb em algumas plantas);

12 - 20 genes codificadores de
protenas (envolvidos na respirao
celular);

http://en.wikipedia.org/wiki/Human_mitochondrial_genetics

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
MARCADORES MOLECULARES
DNA mitocondrial
(mtDNA)
Desde as dcadas de 70-80, do sculo passado, o mtDNA
passou a fazer parte de muitos, seno da maioria dos estudos
envolvendo estrutura populacional, relaes filogenticas e o
entendimento de vrios aspectos biolgicos e evolutivos de
uma grande variedade de organismos;
Caractersticas vantajosas;

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
MARCADORES MOLECULARES
DNA mitocondrial
(mtDNA)
Caracterstica vantajosas (prticas):
- N de cpias: cada clula contm centenas e cada mitocndria,
dezenas de cpias;

- Regies bem conservadas (exs: citocromo b e citocromo oxidase

I);
- Genes sem introns e regies intergnicas curtas;

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
MARCADORES MOLECULARES
DNA mitocondrial
(mtDNA)
Caracterstica vantajosas (gentico-evolutivas):

- Altamente varivel em pop. naturais devido alta taxa de mutao;

- Molcula clone (herana materna);

- Evoluo de forma neutra (no relacionados a Adaptao);

- Taxa evolutiva tipo relgio (clock-like) (ausncia de seleo positiva);

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
MARCADORES MOLECULARES
DNA mitocondrial
(mtDNA)

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDO DE CASO
Procambarus clarkii

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDO DE CASO
Ponto de introduo;

Vrias populaes;
Pergunta:

- Relao de parentesco
entre
indivduos
das
diferentes populaes?
- marcador
mtDNA;

molecular:

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDO DE CASO
Passos para obteno das sequncias:
Extrao de DNA;
Amplificao do gene de interesse (coI);
Purificao do produtos de PCR;
Sequenciamento
- Duas fitas FORWARD/REVERSE: confirmao de algumas
posies;

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDO DE CASO
CROMATOGRAMAS OU ELETROFEROGRAMAS

http://viagene.blogspot.com.br/2011_01_01_archive.html

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
PRTICA

National Center for Biotechnology Information (NCBI)

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDO DE CASO
National Center for Biotechnology Information (NCBI)

- Analisar, por homologia, a validade da nossa sequncia;

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
ESTUDO DE CASO
ALINHAMENTO
- Alinhar as sequncias no banco de dados;

http://www.massey.ac.nz/~strewick/Text%20Files/DNA%20Toolkit.htm

ANLISES BIOLOGIA
MOLECULAR
Mutao
- Alterao na sequncia de nucleotdeos do DNA;
PONTUAL;
INVERSO;
DELEO*;
INSERO*;
TRANSLOCAO;