Inmunologa (Ciclo Farmacia)

Gua de Trabajos Prcticos

2015

Prof.: Gentile, Teresa

Alvarez, Elida
Malchiodi, Emilio

JTP: Cardoso, Alejandro

Castro, Marisa S.
Costantino, Susana N.
Fernndez, Marisa M.
Gonzlez Maglio, Daniel H.
Paz, Mariela L.
1

ndice
Contenido

Pg.

Prlogo

Propsitos Docentes

Normas de Bioseguridad

Calendario de Tericos

Calendario de Trabajos Prcticos

Bibliografa

10

Seminario: Introduccin a la respuesta inmune (RI)

12

Seminario: Tcnicas Inmunolgicas

18

Trabajo Prctico N 1: Interaccin Secundaria

33

Trabajo Prctico N 2: Interaccin Primaria

38

Trabajo Prctico N 3: Immunoblotting o Western blotting

40

Seminario: Planes de Inmunizacin y Anticuerpos Monoclonales

41

Seminario: Produccin y Control de Inmunoterpicos

52

Seminario: Inmunidad Celular

59

Trabajo Prctico N 4: Inmunidad Celular

69

Actividades de Repaso

70

Taller de Sueros y Vacunas: Cuadro

74

Cuadro Inmunoterpicos

75

PRLOGO
La Inmunologa es una ciencia biomdica que ha ido adquiriendo ms y ms
importancia en la formacin del profesional farmacutico, por la creciente cantidad de
productos inmunolgicos empleados en la prevencin y en el tratamiento de las
enfermedades. Las vacunas, en desarrollo an antes de que existiera la Inmunologa
como disciplina, los anticuerpos monoclonales y las protenas recombinantes son un
campo de aplicacin donde el farmacutico juega un papel fundamental. Las tcnicas
inmunoqumicas, para la produccin de inmunoterpicos, y los inmunoensayos, como
mtodos analticos en el control de medicamentos, son herramientas utilizadas en el
control de calidad, purificacin y ensayos de estabilidad de estos productos en la
industria farmacutica. Por otra parte, el Farmacutico de oficina entrega a los
pacientes numerosos productos inmunolgicos, adems de recibir permanentemente
consultas, cuyas respuestas estn estrechamente relacionadas con la Inmunologa.
Durante el dictado de la materia conocern las distintas relaciones que se
establecen entre los individuos y los agentes infecciosos o nocivos del ambiente en que
vivimos, que conducen al desarrollo de diferentes mecanismos de defensa o que
producen procesos patolgicos.
Junto con ello, aprendern diferentes metodologas que son utilizadas en el
diagnstico inmunolgico de las enfermedades (tests inmunodiagnsticos), o el diseo
de estrategias inmunoqumicas para el estudio y/o purificacin de macromolculas de
inters inmunolgico. La materia est fuertemente orientada a la aplicacin de dichas
tcnicas para la produccin y control de los inmunoterpicos; para su mejor
comprensin, es imprescindible que adquieran una serie de conocimientos tericos y
prcticos, que les brindarn las bases sobre las que se asientan.
Finalmente, es importante que sepan que esta disciplina se encuentra en un
constante avance, por lo que, adems de generar la comprensin de los conocimientos
impartidos, esperamos desarrollar en ustedes la curiosidad y la capacidad para buscar y
comprender los nuevos conocimientos, o profundizar en los ya conocidos y puedan
desenvolverse como profesionales en el imprescindible proceso de formacin
permanente.

PROPSITOS DOCENTES
Los docentes responsables del dictado de la materia Fundamentos de
Inmunologa tenemos como propsitos:

Proporcionar los conocimientos tericos y prcticos sobre los contenidos

seleccionados para el dictado de la asignatura.

Posibilitar la integracin de las diferentes unidades temticas tericas y

prcticas.

Establecer relaciones con las disciplinas afines.

Brindar las herramientas que posibiliten la resolucin de situaciones

problemticas del ejercicio profesional.

Facilitar el desarrollo de una actitud crtica para que los conocimientos

adquiridos se conviertan en el futuro en elementos para un mejor desempeo de
su actividad profesional.

MODALIDAD DE LA CURSADA
La materia ser desarrollada mediante el dictado de clases tericas y clases
prcticas, que incluyen trabajos prcticos, seminarios y talleres.
Tericos: si bien no son obligatorias, les brindarn contenidos imprescindibles que
debern ser incorporados gradualmente para su mejor comprensin. Tendrn una
secuencia que favorecer la interrelacin entre los contenidos de los mismos y aquellos
desarrollados en las clases prcticas.
Seminarios: en ellos se desarrollarn los contenidos de la unidad temtica especificados
en el temario que antecede a cada unidad. Para que los seminarios sean aprovechados
de la mejor manera, los alumnos debern concurrir habiendo ledo el temario, los
conceptos introductorios, y habiendo contestado el cuestionario de orientacin incluido
en cada unidad, haciendo uso de la bibliografa sugerida.
Talleres: en ellos los alumnos realizarn bsquedas bibliogrficas, realizarn
presentaciones y discutirn sobre los temas seleccionados.
4

Trabajos Prcticos: se desarrollarn diferentes tcnicas de laboratorio, que les

permitirn iniciarse en el correcto manejo de las mismas y comenzar a formar un criterio
profesional.

REGULARIZACIN DE LA MATERIA
De acuerdo con la reglamentacin vigente, la regularizacin de la materia la
lograrn alcanzando el 75% de asistencia a las actividades obligatorias y con la
aprobacin de 75 % de las evaluaciones regulatorias que se realizarn a lo largo del
cuatrimestre.
En la calificacin de cada unidad temtica se considerar el resultado individual
de las evaluaciones parciales acerca de los fundamentos de los trabajos prcticos, que
se realizarn al comienzo de cada trabajo prctico.
Asimismo, ser requisito para la regularizacin de la materia la asistencia y
aprobacin de los talleres a dictarse durante el cuatrimestre.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD
La prevencin de accidentes se apoya en el conocimiento de las situaciones
potencialmente peligrosas y en las conductas apropiadas para afrontarlas. La
imprudencia, ya sea por ignorancia, por negligencia o por exceso de confianza, es la
causa de la mayora de los accidentes en nuestro mbito laboral.
Remitindonos al trabajo de laboratorio, consideramos tres tipos de riesgos: A)
fsico; B) qumico; C) biolgico. En este breve compendio, consideramos el riesgo de
clase C, por considerar que los alumnos se han familiarizado con las medidas
elementales de precaucin de las otras dos clases de riesgo, en materias previas.
TODO MATERIAL BIOLGICO, CUALQUIERA SEA SU ORIGEN,
DEBE SIEMPRE CONSIDERARSE COMO INFECCIOSO Y MANIPULARSE TOMANDO LOS
RECAUDOS APROPIADOS.
Modos de infeccin ms frecuente:

Infeccin accidental por pinchazos o cortes con agujas, bisturs, lancetas, pipetas,
etc.

Exposicin de la piel o mucosas a sangre, hemoderivados u otros fluidos

biolgicos.

Inhalacin de aerosoles producidos al agitar muestras, destapar tubos, o durante

una incorrecta centrifugacin.

Salpicaduras en ojos, nariz o boca.

Principales normas de bioseguridad:

Utilizar dentro del laboratorio ropa protectora (guardapolvo, chaqueta, etc), que
debe usarse slo dentro del laboratorio.

Utilizar guantes descartables para la manipulacin de materiales. No tocar con

las manos enguantadas otros elementos de uso corriente (elementos de
escritura, telfonos, etc) ni el propio cuerpo. El empleo de guantes por lo general
reduce la agilidad de aquellos operadores no habituados a trabajar con ellos; por
ese motivo es fundamental acostumbrarse a trabajar siempre con guantes.

Lavarse las manos despus de quitarse los guantes, y cada vez que se retire del
laboratorio.

Utilizar protectores oculares (antiparras) y barbijo especial cuando exista riesgo

de salpicaduras o formacin de aerosoles.

Jams pipetear con la boca fluidos biolgicos ni reactivos. Utilizar siempre

pipetas automticas, propipetas o peras de goma.

Evitar la formacin de aerosoles, los que se producen por el agitado de tubos sin
tapa, incorrecta centrifugacin (sin tapa, tubos con excesivo volumen, o levantar
la tapa de la centrfuga antes de tiempo), etc.

Utilizar material descartable para la toma de cualquier muestra biolgica.

En caso de emplear jeringa y aguja, jams descartar la aguja destapada.

Al finalizar la tarea, realizar siempre una limpieza del lugar de trabajo. Emplear
lavandina diluida al 10%.

No beber, comer ni fumar en el laboratorio.

No guardar comestibles ni bebidas en las heladeras del laboratorio.

CONOCER Y AUTOMATIZAR ESTAS NORMAS CONSTITUYE
LA MXIMA GARANTA DE SU CUMPLIMIENTO.

CALENDARIO DE CLASES TERICAS Inmunologa de Farmacia 2015

MARTES 13-14:30 hs

10/3 Elementos inespecficos de defensa. La respuesta inmune. Clulas que

participan en la respuesta inmune. rganos linfoides primarios y
secundarios.
17/3 Respuesta inmune innata. Respuesta inflamatoria. Clulas que
participan. Mediadores solubles. Sistema complemento.
31/3 Antgenos. Inmungenos. Epitopes T y B. Respuesta inmune mediada
por linfocitos B. Estructura de los anticuerpos. Sitio de combinacin.
Mecanismos biolgicos mediados por anticuerpos. Respuesta primaria y
secundaria.
07/4 Origen de la diversidad de los receptores linfocitarios (BCR y TCR).
Ontogenia y diferenciacin de B y T. Activacin LT y LB. Marcadores
celulares. Seleccin positiva y negativa.
14/4 Molculas del CMH, estructura y funcin. Presentacin y reconocimiento
del Antgeno. Respuesta inmune mediada por linfocitos T. Recirculacin
linfocitaria. Respuesta inmune asociada a mucosas.
21/4 Respuesta inmune mediada por linfocitos T. Activacin y diferenciacin
de linfocitos efectores y de memoria. Acciones reguladoras e inductoras
de la respuesta inmune. Linfocitos T reguladores.
28/4 Diferentes mecanismos efectores de la inmunidad. Citotoxicidad y
Citlisis. Regulacin de la respuesta inmune y su relacin con distintos
procesos infecciosos.
05/5 Clase de consulta 14 h

Dr. Malchiodi
Dra. Alvarez
Dra. Gentile

Dra. Gentile
Dr. Malchiodi
Dr. Malchiodi
Dra. Alvarez

1 PARCIAL PROMOCIONAL: JUEVES 7 de Mayo 14 hs

12/5 Sueros y Vacunas. Adyuvantes.

Dr. Malchiodi

19/5 Tolerancia Inmunolgica Autoinmunidad. Terapias.

Dra Miranda

26/5 Inmunomoduladores. Supresores y estimuladores.

Dra. Miranda

02/6 Hipersensibilidad inmediata. Alergia. Hipersensibilidad de tipo II y III.

Hipersensibilidad retardada. Terapias inmunes.
09/6 Inmunidad de transplantes. Rechazo de injertos. Inmunidad Tumoral.

Dra. Gentile

16/6 Inmunodeficiencias.

Dra. Canellada

23/6 Nuevos desarrollos en vacunas

Dr. Malchiodi

Dra. Canellada

30/6 Clase de consulta 14 h

2 PARCIAL PROMOCIONAL: JUEVES 2 de Julio de 14 hs

CALENDARIO DE TRABAJOS PRCTICOS

Semana 1- (09 al 13 de Marzo)

Seminario Introductorio: Antgenos y haptenos. Generalidades. Antigenicidad:
factores que la condicionan. Inmungenos. Epitopes B y T. Anticuerpos:
estructura y funcin, afinidad y avidez. Respuesta inmune primaria y secundaria.

Semana 2 - (16 al 20 de Marzo)

Seminario Tcnicas Inmunolgicas: Interaccin Ag-Ac. Tcnicas de interaccin
secundaria: fundamentos y aplicaciones.

Semana 3 (23 al 27 de marzo). SOLO comisiones das MIE, JUE y VIE

Trabajo Prctico N 1 (Tcnicas de Interaccin secundaria).

Semana 4 - (30 de marzo al 03 de Abril) SOLO comisiones das LUN y MA

Trabajo Prctico N 1 (Tcnicas de Interaccin secundaria).

Semana 5 - (06 al 10 de Abril)

Seminario Tcnicas Inmunolgicas:
fundamentos y aplicaciones.

Tcnicas

de

interaccin

primaria:

Semana 6 - (13 al 17 de Abril)

Trabajo Prctico N 2 (Tcnica de Interaccin Primaria: ELISA) y
Trabajo Prctico N 3 (Tcnica de Interaccin Primaria: Western Blotting o
Immunoblotting) + Actividades de repaso.

Semana 7 - (20 al 24 de Abril)

Evaluacin N 1 y 2

Semana 8 - (27 de Abril al 1 de Mayo)

Sin clases.

1 Parcial Promocional: Jueves 7 de Mayo de 14 hs

Semana 9 - (11 al 15 de Mayo)

Seminario Produccin de Sueros y Vacunas. Obtencin de Acs monoclonales.
Planes de inmunizacin: generalidades. Ac monoclonales: fundamento de su
produccin. Usos en diagnstico y tratamientos. Ac quimricos y humanizados.

Semana 10 - (18 al 22 de Mayo)

Seminario Inmunidad Celular: respuesta inmune celular. Tcnicas de
enriquecimiento y de purificacin de clulas. HLA y transplante. Tcnicas de
proliferacin celular, de citotoxicidad. Bioensayos. Reaccin de hipersensibilidad
retardada.

Semana 11 - (25 al 29 de Mayo) LUNES feriado, COM01 debe recuperar

Seminario Control y Produccin de Inmunoterpicos: estrategias de produccin
de citoquinas, Acs y/o Ags recombinantes. Purificacin. Control de calidad:
actividad y pureza. Aplicaciones farmacuticas. Produccin de IL2, GM-CSF, IFN
tipo I, anti-TNF, anti-VEGF.

Semana 12 - (01 al 05 de Junio)

Trabajo Prctico N 4 (Inmunidad Celular, Bioensayo).

Semana 13 - (08 al 12 de Junio)

Taller sueros y vacunas.

Semana 14 - (15 al 19 de Junio).

Actividad integradora.

Semana 15- (22 al 26 de Junio)

Evaluacin N 3 y 4

2 Parcial Promocional: Jueves 02 de Julio de 14 hs

BIBLIOGRAFA GENERAL

Abbas-Litchman-Pillai. Inmunologa Celular y Molecular. 6 Edicin 2008.

Elsevier.

Fainboim-Geffner. Introduccin a la Inmunologa Humana. 5 Edicin 2005.

Editorial Mdica Panamericana.

Murphy-Travers-Walport. Janeways immunobiology. 7 Edicin 2007. Garland

Science Publisher (en ingls).

Roitt-Brostoff-Male. Inmunologa. Fundamentos. 11 Edicin 2008. Editorial

Panamericana.

Temas de trabajos prcticos

Roitt-Brostoff-Male. Inmunologa. Fundamentos. 11 Edicin 2008. Editorial

Panamericana.

10

Luttman-Bratke-Kpper. Inmunologa. Manual de tcnicas de investigacin en el

laboratorio. Primera Edicin 2009. Editorial Acribia SA.

Margni. Inmunologa e Inmunoqumica. 5 Edicin 1996. Editorial Panamericana.

-

Interaccin Ag-Ac. Precipitacin. Aglutinacin (int sec) Caps 9 y 35

Int primaria

Caps 8, 35, 38 y 42

Sueros y vacunas

Cap 20

Monoclonales

Cap 37

Celular

Cap 36

Gmez Luca-Blanco-Domenech. Manual de Inmunologa Veterinaria.

-

Valoracin de la respuesta inmune de base humoral

Cap 17

Valoracin de la respuesta inmune de base celular

Cap 17

11

INTRODUCCIN A LA RESPUESTA INMUNE (RI)

TEMARIO
- Caractersticas de la Respuesta Inmune:

Concepto de lo propio y no propio

Elementos de la Respuesta Inmune

Concepto de Antgeno y Anticuerpo

rganos linfoides

- Respuesta Inmune Innata:

Barreras Naturales

Inflamacin

Sistema de complemento

- Respuesta Inmune Adaptativa:

Concepto general del reconocimiento antignico

Antgenos T dependientes e independientes

Anticuerpos: Estructura e isotipos

Tipos de Respuesta Inmune

-Inmunidad Activa y Pasiva (Conceptos generales)

Para un organismo la vida es una interaccin permanente con el medio que lo rodea.
Como consecuencia de este intercambio, los organismos han desarrollado diferentes
sistemas que les permiten sobrellevar las agresiones del ambiente. Estos sistemas son
sencillos o ms complicados segn el lugar de la escala biolgica en que cada organismo
se encuentre. As, los hongos producen sustancias capaces de inhibir el crecimiento
bacteriano como la penicilina y las bacterias tienen una barrera natural de defensa
produciendo enzimas capaces de inactivar las penicilinas liberadas por los hongos. Uno
de estos sistemas, que se ha desarrollado con el simple y complejo fin de asegurar la
perpetuacin de las especies en el medio ambiente, recibe el nombre de sistema
inmune (SI) y ha alcanzado su mxima expresin en los mamferos.
La ciencia que estudia los mecanismos que rigen al SI es la Inmunologa y sus
orgenes se le atribuyen a Edgard Jenner, quien en 1796 introdujo el concepto de vacuna
al descubrir que la viruela ovina o vaccinia brindaba proteccin contra la viruela que
afectaba al hombre. Jenner desconoca los principios de la vacunacin, pero hoy
sabemos que se fundamentan en una respuesta inmune (RI) especfica que se genera
12

contra un patgeno y que persiste en el tiempo. Es por ello que a este tipo de RI se la
llama adquirida o adaptativa. En una infeccin natural hay una etapa que precede a la
respuesta inmune adquirida, se la llama RI innata y presenta una limitada diversidad de
reconocimiento. Ya sea que hablemos de RI innata o adquirida, podremos diferenciar
una etapa de reconocimiento-activacin y otra efectora.
La principal caracterstica del SI es la capacidad de diferenciar lo propio de lo
extrao o no propio, y, excepto en situaciones patolgicas, la RI se desencadenar
contra organismos invasores.
Las clulas involucradas en la RI derivan de un precursor comn o stem cell en
mdula sea que puede ser: un progenitor mieloide, que origina a los granulocitos
(neutrfilos, basfilos y eosinfilos), macrfagos, monocitos y clulas dendrticas (CD); o
un progenitor linfoide, que da origen a los linfocitos T (LT), linfocitos B (LB) y clulas
natural killer (NK). Los rganos en los que se originan y maduran los componentes
del SI se llaman rganos linfoides primarios y en los mamferos son la mdula sea y el
timo. Los rganos linfoides secundarios son los ganglios linfticos, el bazo y el sistema
inmune asociado a mucosas, all se desencadena la RI o hay procesos relacionados con
sta.
La primer barrera de defensa est dada por el SI innato, si bien su especificidad es
limitada, es el primer paso para discriminar entre lo propio y lo extrao. Con el ingreso
de un microorganismo se genera un proceso inflamatorio, que se caracteriza por calor,
dolor, rubor y tumor. La inflamacin es consecuencia de la reaccin a la infeccin que
implica a las clulas residentes (macrfagos y CD), a las clulas endoteliales y a
componentes solubles (sistema complemento entre otros). Al sitio llegan los neutrfilos
en primera instancia que fagocitan al patgeno y luego los monocitos-, y se liberan
citoquinas y quimoquinas. Estas son sustancias capaces de alterar el comportamiento de
otras clulas al interaccionar con receptores especficos. El proceso de inflamacin
aumenta la permeabilidad vascular, permitiendo as mayor extravasacin de sustancias
quimiorreactantes que ayudan a reclutar clulas del SI en el sitio de la injuria.
Si bien esta primera RI tiene un reconocimiento limitado, esto no implica ausencia
de receptores. Estos receptores se caracterizan por interactuar con patrones o motivos
presentes en diferentes grupos de microorganismos (PAMPs), y no con antgenos (Ag)
especficos de cada uno de ellos, siendo esta una diferencia fundamental con la RI
13

adquirida. Se denomina Ag a los componentes de los patgenos que tienen la capacidad

de interactuar especficamente con receptores presentes en los LT o LB y se reserva este
trmino para hablar de RI adaptativa.
Como ejemplo de este reconocimiento PAMP-receptor podemos mencionar: 1) los
pptidos N formilados producidos por las bacterias, que son reconocidos por los
receptores fMet-Leu-Phe guiando a los neutrfilos al sitio de la infeccin; 2) ciertos tipos
de azcares presentes en las superficies bacterianas y virus, reconocidos por los
receptores de manosa de los macrfagos; 3) los motivos CpG presentes en el ADN
bacteriano o el ARN doble cadena de los virus, reconocidos por los receptores tipo toll
(TLR) 9 y 3, 4) los cidos lipoteicoico o lipopolisacridos (LPS) presentes en la pared
bacteriana de ciertos microorganismos, reconocidos por los TLR 2 y 4, respectivamente,
etc. Los TLR, llamados as por haberse descubierto inicialmente en la mosca de la fruta
Drosophyla melanogaster, y luego encontrar sus anlogos en otras especies, se
encuentran en la superficie, o en vesculas endosomales, de macrfagos, CD, etc. Estos
receptores al interactuar con sus ligandos, desencadenan una cascada de seales que
llevan a la activacin de las clulas que los poseen, liberando sustancias coestimulatorias
que tambin intervienen en la RI especfica. Es por ello que algunos autores consideran
a los TLR como un nexo entre ambos tipos de respuesta.
La interaccin de los PAMPs con los Rc de la RI innata llevan a una activacin de las
clulas fagocitas: neutrfilos y macrfagos. Si bien los macrfagos son los fagocitos por
excelencia, los neutrfilos son los primeros en llegar al sitio de la injuria. La finalidad de
la fagocitosis es eliminar al microorganismo mediante mecanismos dependientes o
independientes de oxgeno.
Un mecanismo humoral efector muy importante es el sistema de Complemento. El
mismo est constituido por un grupo de protenas, muchas de ellas de sntesis heptica,
que circulan en el plasma como zimgenos. Puede activarse por las denominadas va
alterna, va de las lectinas o la va clsica, esta ltima involucra la participacin de
anticuerpos (Ac).
La RI adquirida o adaptativa se caracteriza por ser altamente especfica y generar
memoria inmunolgica. Ante la presencia de un patgeno se requieren clulas capaces
de procesarlo y mostrar los pptidos antignicos al SI, para que este los reconozca como
no propios y desencadene mecanismos para eliminarlos. Esta es la etapa de
14

reconocimiento del patgeno. Estas clulas se llaman clulas presentadoras de

antgenos (CPA) profesionales y son las CD, los LB y los macrfagos. Slo estas clulas
pueden presentar los pptidos asociados a las molculas del complejo mayor de
histocompatibilidad de clase II (CMH-II) o CMH-I a los LT. Todos los otros tipos celulares,
a excepcin de los espermatozoides y de los glbulos rojos, son capaces de presentar
Ags, pero esta vez slo asociados a molculas del CMH-I a linfocitos ya efectores. Este
proceso es necesario para la etapa efectora de la RI.
Las molculas del CMH-II sintetizadas en el lumen del retculo endoplsmico (RE) se
asocian con una protena conocida como cadena invariante li, la que evitar la unin al
CMH-II de pptidos presentes en el RE y lo guiar hacia las vesculas exocticas donde li
es removida y el CMH-II se asocia el pptido antignico siendo llevado hacia la superficie
de la CPA. All, los LT CD4+ con sus receptores para antgenos de los LT (TCRs), reconocen
a los pptidos antignicos presentados en el contexto de las molculas del CMH-II. Los
pptidos que se asocian a las molculas del CMH-II se generan por la accin de
proteasas sobre Ags extracelulares que han sido fagocitados o sobre las protenas
secretadas por patgenos intracelulares, como ciertos parsitos, que son capaces de
vivir en el sistema vesicular y han sido incorporadas a los endosomas. stos se
fusionan con el lisosoma para constituir los fagolisosomas que en una etapa posterior se
asociarn con las vesculas exocticas
Los patgenos intracelulares como los virus, sintetizan sus protenas en el
citoplasma de la clula infectada. Algunas protenas son degradadas en pptidos
menores por un sistema cataltico presente en el citoplasma celular llamado
proteosoma. Estos pptidos pasan al RE empleando un transportador de pptidos y all
se renen con las cadenas del CMH-I que son traslocadas al lumen del RE por las
protenas TAP. La molcula CMH-I asociada al pptido, viaja por el Golgi y por el sistema
de vesculas hasta la superficie de la clula. Este proceso lo pueden hacer tanto las CPA
como otras clulas al ser infectadas. En el 1er caso ser una presentacin antignica y
los LT CD8+ reconocern al pptido en el contexto del CMH-I, a travs de su receptor de
superficie (TCR). En el 2do caso ser una respuesta efectora y, en este caso se produce
porque el LT CD8+ ya fue activado anteriormente.
Que la presentacin del Ag a los LT sea por clase I o II es fundamental, ya que eso
determinar si el mecanismo efector ser predominantemente celular o humoral. En el
15

primer caso los mecanismos efectores estarn mediados principalmente por clulas y en
el segundo por Acs secretados por los LB. Los LB reconocen al Ag a travs de una
molcula de inmunoglobulina anclada a su membrana que es lo que se denomina
Receptor del LB o BCR. Cada clon de LB expresa un nico tipo de Ac con una
especificidad dada.
Los Acs son glicoprotenas sricas constituidas en su unidad fundamental de
inmunoglobulina por dos cadenas pesadas y dos livianas. Cada cadena consta de un
nico dominio variable y uno o ms dominios constantes. La combinacin del dominio
variable de la cadena liviana y pesada constituye el sitio de reconocimiento del Ag o
paratope, que es el que le proporciona la interaccin especfica y actividad
inmunolgica. As un paratope se combina con un epitope antignico y se da la
interaccin Ag-Ac. El Ac reconoce al Ag en su forma nativa y no es necesario que las
CPAs los procesen y expresen.
En lneas generales, podemos decir que la combinacin de los dominios constantes
de las dos cadenas pesadas son los que confieren las propiedades biolgicas tambin
efectoras. Un ejemplo es la activacin del complemento.
En los dominios constantes tanto de cadenas pesadas como livianas existen regiones
que determinan el isotipo o clase de la Ig. Se describieron 5 isotipos: , , , y para
las cadenas pesadas y dos para las livianas, y
La RI no es nicamente de tipo humoral o celular, sino que en general estn las dos
presentes con predominio de una forma u otra. La presentacin de Ags tampoco es
estrictamente por una va u otra, sino que existe lo que se denomina presentacin
cruzada.
Un concepto muy importante es comprender que cada vez que ocurre una infeccin
natural, estamos en presencia de numerosos Ags. Estos, a su vez, presentarn en su
estructura molecular zonas restringidas de reconocimiento denominadas epitopes. Cada
epitope interactuar con un paratope de un Ac proveniente de un LB.
Los LT CD4+ activados se diferencian a efectores que pueden ser de tipo 1 2 y se los
llama linfocitos colaboradores o helper (LTh) 1 2. Si el que se activa es un LTh1, se
secretar un patrn de citoquinas que promover una RI efectora predominantemente
de tipo celular junto con la secrecin de cierto isotipo de Acs. Si se activan LTh2,
entonces la RI ser predominantemente de tipo humoral y con un perfil de isotipos de
16

Acs diferente al anterior. Los LTh1 tambin contribuirn a activar a los LT CD8+ para
potenciar la fase efectora citotxica.
Una RI puede ser protectiva controlando al patgeno, autolimitndose y evitando
una reinfeccin con el mismo. As la RI adquirida culmina con una fase reguladora. Este
es el aspecto beneficioso y deseado de la RI.
La RI tambin puede ser daina porque puede haber una reaccin contra Ag propios,
y se producir un fenmeno de autoinmunidad; o puede haber una RI a sustancias
inocuas como los alergenos, y tendremos el cuadro clnico conocido como alergia.

CUESTIONARIO (para responder despus del seminario)

1) Qu entiende por inmunidad?
2) Cun efectiva considera a la RI innata?
3) Considera que RI innata y adaptativa son dos hechos no relacionados?
Fundamente.
4) Dnde se generan los componentes humorales y celulares de la RI?
5) Dnde se monta la RI de reconocimiento antignico?
6) Por qu es importante que la RI sea policlonal?
7) Mencionamos la existencia de diferentes isotipos de Acs. Enumrelos y
discuta si es importante o no su existencia.
8) Qu sucedera si el nico isotipo producido fuese IgM?
9) Una mujer embarazada padece rubola en su infancia. Cmo lo confirma el
obstetra? Por qu no corre riesgo de contraerla nuevamente durante el
embarazo?
10) Mediante un esquema, indique como es la RI ante una primo infeccin y una
reinfeccin con el mismo patgeno.
11) De ejemplos de inmunidad activa y pasiva.

17

TCNICAS INMUNOLGICAS
TEMARIO
- Interaccin Antgeno-Anticuerpo:

Factores que condicionan la interaccin

Concepto de epitope, paratope, hapteno

Afinidad, avidez

Sueros policlonales, Acs monoclonales

Concepto de Monoespecificidad

- Tcnicas de Interaccin Secundaria:

Precipitacin: zona de equivalencia, medio gelosado (IDR y DID)

Aglutinacin: directa, indirecta, reversa

Sistema ABO, Rh. Prueba de Coombs

- Tcnicas de Interaccin Primaria:

ELISA: no competitivos. Sistemas de amplificacin.

Inmunofluorescencia

SDS-PAGE, Inmunotransferencia (WB)

Se desarrollan a continuacin conceptos introductorios de las tcnicas ms

importantes. Los conceptos sern desarrollados durante el Seminario y deber
consultarse la bibliografa indicada.
INTRODUCCIN
Las interacciones antgeno-anticuerpo (AgAc) son asociaciones bimoleculares
de alta afinidad y especificidad. La interaccin entre un Ac y su Ag correspondiente
involucra a varias uniones no covalentes entre el determinante antignico o epitope
del Ag y la regin variable (VH/VL) o paratope de la molcula de Ac. Dado que estas
interacciones son reversibles, las asociaciones Ag-Ac pueden ser disociadas en
condiciones particulares.
La especificidad de un Ac por un Ag ha llevado al desarrollo de una variedad de
ensayos que pueden ser utilizados para la deteccin de cualquiera de los dos
componentes en una mezcla o fluido biolgico. Estos ensayos pueden tener un papel
fundamental en el diagnstico de enfermedades, el monitoreo del nivel de respuesta
18

inmune o la identificacin de molculas de inters mdico o biolgico. Adems,

difieren entre ellos en velocidad y sensibilidad y pueden ser cuali o cuantitativos.
La valencia de los Acs (multi, bi o monovalencia), las caractersticas
fisicoqumicas y nmero de epitopes del Ag, as como el rango de concentraciones (pg,
g o mg) en el que se encuentran ambos reactantes y las condiciones del medio son
factores fundamentales que condicionan la visualizacin o no del complejo inmune
formado. As, un sistema Ag-Ac simplificado podra estar constituido por: una solucin
de un Ag que presenta un nico epitope por molcula y una solucin que contenga
molculas de Ac idnticas y especficas para ese epitope. Tras un perodo de contacto
de ambas soluciones, la velocidad de formacin de complejos Ag-Ac se iguala a la
velocidad de disociacin de los mismos, alcanzando un estado de equilibrio dinmico.
Esta interaccin, que no se visualiza, es conocida como interaccin primaria.
Ag + Ac

Ag-Ac

Sin embargo, si los Acs son al menos bivalentes y el Ag es multivalente

(repeticin de un mismo epitope o diferentes epitopes por molcula), y ambos
reactantes estn en concentraciones del orden de mg/ml, las reacciones producidas
pueden visualizarse macroscpicamente. Estas reacciones observables a simple vista,
son consecuencia del fenmeno de interaccin secundaria, en el que los complejos
inmunes primarios se asocian entre s dando lugar a complejos secundarios de mayor
tamao. Para que esto ocurra no slo se requiere la interaccin epitope-paratope sino
tambin la formacin de una estructura compleja (red) integrada por varias
molculas de Acs interactuando simultneamente con varias molculas de Ag que
presenten varios epitopes. Esta estructura slo se logra trabajando con relaciones AgAc apropiadas y en condiciones fisiolgicas; concentraciones salinas elevadas, pH
extremos y temperaturas superiores a 37 C disgregan los complejos impidiendo su
visualizacin. Estas condiciones extremas pueden llevar a una mala interpretacin de la
reaccin, ya que al no visualizarse los complejos secundarios se concluye que no existi
una interaccin Ag-Ac.
En todos los casos es necesario realizar controles adecuados, que permiten
interpretaciones confiables de los resultados obtenidos.

TCNICAS DE INTERACCIN SECUNDARIA

19

PRECIPITACIN
Se denomina precipitacin a la interaccin secundaria in vitro de un Ag

soluble (protena, hidrato de carbono, etc.) con su Ac especfico.

AGLUTINACIN
Se denomina aglutinacin a la interaccin secundaria in vitro de un Ag

particulado con su Ac especfico. Si el Ag (protena, hidrato de carbono, etc.) se

encuentra presente en la superficie de clulas (como glbulos rojos), bacterias u otras
partculas naturales el fenmeno se denomina aglutinacin directa. Utilizacin tpica:
determinacin de grupo sanguneo ABO.
Cuando el Ag con el que interaccionan los Acs especficos no forma parte de la
estructura de la partcula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la
aglutinacin que tiene lugar se denomina genricamente aglutinacin pasiva o
indirecta. Las partculas utilizadas como soportes pueden ser inertes como el ltex o
bien glbulos rojos, en cuyo caso el mtodo recibe el nombre de hemoaglutinacin
pasiva o indirecta. Utilizacin tpica: HAI Chagas.
Las tcnicas de aglutinacin pueden ser cualitativas o semicuantitativas.
A bajas diluciones del suero la aglutinacin puede estar ausente, debido a un
exceso de molculas de Ac, este fenmeno se denomina efecto de prozona, y de
ignorrselo, puede conducir a un resultado falso negativo.
Es importante recordar que el Ac a investigar por aglutinacin debe ser por lo
menos funcionalmente bivalente. Aquellos Acs que poseen un solo paratope til de
alta afinidad se denominan anticuerpos incompletos o asimtricos (funcionalmente
monovalentes). Para poder evidenciarlos utilizando reacciones de interaccin
secundaria es necesario recurrir a otras pruebas como la Reaccin de Coombs.
Utilizacin tpica: deteccin de anticuerpos anti-Rh (anti-Ag D) en el suero de
mujeres embarazadas Rh negativo (siendo el nio Rh positivo). Esta reaccin se basa
en la utilizacin de Acs anti-Ig humana (suero de Coombs) para producir la aglutinacin
luego de la interaccin del Ag con los Acs incompletos.

PRECIPITACIN EN MEDIO GELOSADO

20

Las macromolculas en solucin son capaces de difundir en un gel; dicha

capacidad depende de la concentracin del gel (que determinar un tamao de poro),
del tamao de la macromolcula en cuestin y de su concentracin. Utilizando geles es
posible hacer difundir Ags y/o Acs, generando un gradiente de concentracin y as
producir una reaccin de precipitacin en la zona de equivalencia, zona donde la
relacin de Ag y Ac es ptima. Existen varias tcnicas basadas en la precipitacin en
medios gelosados, algunas de las cuales se describen a continuacin.
- IDR (Inmuno Difusin Radial): En esta tcnica cuantitativa se utiliza un suero
monoespecfico embebido en el gel, soluciones estndar de diferente concentracin
del Ag y la/s muestra/s a valorar en los pocillos respectivos. Luego de difundir se
formar un halo de precipitacin cuyo dimetro (d) ser proporcional a la
concentracin antignica (cc Ag). Se realiza una curva patrn (r2 vs. cc Ag o d vs. Log cc
Ag) utilizando los estndares y en ella se interpola el valor de la muestra a valorar,
obteniendo as la concentracin del Ag en la muestra. Utilizacin tpica: cuantificacin
de isotipos de inmunoglobulinas totales sricas y del componente C3 del sistema
complemento.
- DID (Doble Inmuno Difusin): Esta tcnica cualitativa se basa en la doble difusin en
un gel tanto del Ag como del Ac, colocados en pocillos cercanos. La formacin de
inmunocomplejos insolubles se visualiza como bandas de precipitacin, cuya posicin
puede variar de acuerdo a las concentraciones y a los tamaos de ambos reactantes.
La comparacin de las bandas de precipitacin formadas por diferentes soluciones de
Ags y una solucin de Ac que los reconozca, permiten sacar conclusiones sobre las
similitudes o diferencias antignicas. Utilizacin tpica: comparacin de antgenos,
comparacin de reactividad de anticuerpos.
TCNICAS DE INTERACCIN PRIMARIA
Las tcnicas de interaccin primaria son mucho ms sensibles que las de
interaccin secundaria y permiten la identificacin de Ags o Acs en situaciones donde
las ltimas no son tiles debido a que estn condicionadas por las concentraciones y

21

las caractersticas fisicoqumicas de ambos inmunorreactantes, as como tambin por

las propiedades del medio de reaccin.
Existen varios tipos de tcnicas que se basan en la interaccin primaria; entre
ellas los enzimoinmunoensayos (EIA), los radioinmunoensayos (RIA), las tcnicas de
inmunofluorescencia (IF), y las tcnicas de western-blotting (WB). Las seales
detectadas sern colorimtricas, radioactivas, o fluoromtricas, y se deben a un
reactivo denominado conjugado, que consta de un Ag o un Ac unido a una enzima, a
un radioistopo (en cuyo caso particular lo denominamos trazador o radioligando), o a
un fluorocromo. Utilizacin tpica: Determinacin de Ac como diagnstico de
infeccin y determinacin de Ags.

ENZIMOINMUNOANLISIS

EIA heterogneos: El conjugado puede ser tanto el Ag como el Ac. Las enzimas ms
usadas en este tipo de tcnicas son la peroxidasa de rbano (HRP o horseradish
peroxidase) y la fosfatasa alcalina (FA).
Los EIA heterogneos son denominados tambin ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay), debido a que en estos ensayos se cuenta con una fase slida
en la que se inmoviliza uno de los inmunorreactantes. Esto permite la remocin de
todo aquello que no interaccione con la molcula inmovilizada con un simple lavado.
La inmovilizacin, tambin llamada sensibilizacin, es la unin del Ag o Ac a la fase
slida.
Los pasos bsicos de un ELISA son:
1- Sensibilizacin con uno de los reactivos inmunolgicos, ya sea un Ag o un Ac,
segn el diseo del ELISA. Posteriores lavados para eliminar el innmunoreactivo no adherido.
2- Bloqueo de los sitios vacos con una protena inerte al sistema. Lavados.
3- Incubacin con la muestra y con los estndares de ser necesarios. Lavados.
4- Incubacin con el sistema de deteccin. Puede ser tanto un Ag o un Ac
conjugado con una enzima. Lavados.
5- Agregado del sustrato de la enzima y un cromgeno.
6- Frenado de la reaccin.

22

Los ELISA no competitivos, pueden ser cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos y

la seal ser siempre proporcional a la concentracin de la molcula incgnita. Existen
distintos tipos de esquemas que pueden plantearse segn el objetivo:

INMUNOFLUORESCENCIA
Esta tcnica se utiliza casi exclusivamente con Ag particulados. Aqu el

conjugado es un Ac unido covalentemente a un fluorocromo como FITC (isotiocianato

de fluorescena) o rodamina que al ser excitados por luz UV emiten luz de color verde o
rojo, respectivamente. Pueden ser cualitativas o semicuantitativas.
La tcnica consiste en inmovilizar el corte de un tejido, clulas, bacterias u otras
partculas naturales sobre un portaobjeto o similar (se denomina a este preparado
impronta) y evidenciar la presencia tanto de Ag como de Ac.
La tcnica puede ser directa (IFD) o indirecta (IFI).
Esta tcnica presenta dos desventajas muy importantes: la primera es que se
debe disponer de un microscopio de fluorescencia y la segunda es la poca
reproducibilidad dado que depende de la subjetividad del operador.

ELECTROFORESIS EN GELES WESTERN BLOTTING- IMMUNOBLOTTING

Las protenas tienen una determinada carga neta a un valor de pH diferente de su

punto isoelctrico (pI), siendo capaces de migrar en un campo elctrico. Bajo estas
condiciones, la velocidad de migracin ser dependiente de su carga y su masa.
PAGE: La electroforesis en gel de poliacrilamida es un mtodo analtico basado en la
discriminacin de protenas segn su carga y su masa. La poliacrilamida es un polmero
con diferentes grados de polimerizacin, que se obtiene al mezclar acrilamida con bisacrilamida en diferentes proporciones. As se genera un gel con diferentes tamaos de
poros que ejerce un "efecto tamiz" sobre las molculas que migran, producindose la
23

separacin diferencial de las molculas en estudio en funcin de la relacin tamao/

carga.
SDS-PAGE: hace uso de gel de poliacrilamida y de un buffer que contiene
dodecilsulfato de sodio (SDS). Por accin del SDS todas las protenas adquieren una
carga homognea negativa al interactuar con el detergente. De este modo, la carga no
influye en la electroforesis y se separarn en funcin de la masa. Esta tcnica puede as
aplicarse para la determinacin de pesos moleculares.
Los geles pueden ser continuos o discontinuos. Los geles discontinuos estn
compuestos por un gel concentrador o stacking y el de corrida o running, esto hace que
las muestras sembradas en el stacking ingresen al mismo tiempo y con menor efecto de
difusin al gel separador.
Una vez finalizada la corrida, las protenas se visualizan mediante una tincin
irreversible que abarca desde el uso de colorantes, como el Coomassie Blue, hasta
marcas radiactivas y el uso de metales tales como el oro y la plata. Para las
glicoprotenas se puede emplear la Tincin de Schiff. Estos mtodos varan en
sensibilidad, es por ello que la no visualizacin de una banda no implica necesariamente
su ausencia.
El Western blotting o Immunoblotting, es una tcnica analtica utilizada para
detectar protenas especficas en una muestra determinada. Mediante una
electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso
molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Luego, las protenas son transferidas a una
membrana adsorbente, tpicamente de nitrocelulosa o de polyvinylidene fluoride
(PVDF), para poner de manifiesto a la protena de inters con anticuerpos especficos
contra ella. Finalmente, se detecta la unin Ag-Ac por actividad enzimtica,
fluorescencia, etc. De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en la
muestra.
Esta tcnica es actualmente imprescindible en varios campos de la biologa, como
la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa.

24

Pasos del Western Blotting

-Preparacin de la muestra
-Electroforesis en gel: La electroforesis en gel ms frecuente es el SDS-PAGE.
Figura 1: Esquema de SDS-PAGE

-Transferencia Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos,
se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de
PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un
campo elctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean se caracterizan por su capacidad de unir protenas
de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad).
Las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las
25

interacciones membrana - protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de

interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba. En las membranas de PVDF, la
unin est basada en interacciones hidrofbicas y de dipolos entre la membrana y las
protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de
exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de
surfactantes.
-Electrotransferencia: Este mtodo se basa en el empleo de una corriente elctrica y
un buffer de transferencia para llevar las protenas desde el gel hacia la membrana. Para
ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo
al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de
transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este
montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y
se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados
durante un tiempo dado. Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y
quedan atrapadas en la membrana.
Tras la transferencia, la membrana se colorea de forma reversible con Rojo Ponceau.
El uso de marcadores de PM pre teidos permite tambin verificar la transferencia sin
necesidad de tincin extra.
- Bloqueo:
En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin proteca, tpicamente de
albmina de suero bovino (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o
casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las
protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que
no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo
podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y los falsos
positivos.
- Deteccin: Se emplea un anticuerpo especfico unido a una enzima que al catalizar
el sustrato genere una reaccin colorimtrica. De esta forma, se pone de manifiesto la
unin la protena de inters (antgeno), as como su localizacin. En el caso de emplear
26

como enzima a la peroxidasa, se puede utilizar 4 Cl Naftol junto con el sustrato de la

enzima que es el agua oxigenada o perxido de hidrgeno, generando as un precipitado
de color violceo insoluble.
En algunos casos, no se disponen de dichos anticuerpos conjugados para la protena
de inters y se requiere entonces del empleo de dos anticuerpos. Un primer anticuerpo,
o anticuerpo primario, que es especfico para la protena y luego se realiza otra
incubacin con el anticuerpo secundario conjugado a la enzima. Por ejemplo, un
anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de reconocer anticuerpos obtenidos
de ratones. Del mismo modo se pueden generar anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo",
etc.
Otro mtodo ms sofisticado y sensible consiste en usar un sustrato que al ser
catalizado por la enzima d una reaccin quimioluminiscente. Las enzimas
anteriormente nombradas pueden ser usadas. En el caso de la peroxidasa, cataliza la
oxidacin del luminol en presencia de perxido de hidrgeno. La fosfatasa alcalina
cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reaccin que genera luz.
Si se coloca una pelcula fotogrfica sobre la membrana, la exposicin a la luz que se
desprende en la reaccin permite detectar la actividad enzimtica, y por ende al
antgeno buscado.
El sistema avidina/estreptavidina es otra opcin de revelado. Consiste en emplear
un anticuerpo primario unido covalentemente a molculas de biotina. Despus la
deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la misma, como la
estreptavidina o la avidina, la que se ha conjugado, por ejemplo, con una enzima.

27

CUESTIONARIO DE ORIENTACIN
1) Qu tipo de uniones participan en la interaccin entre Ags y Acs?
2) Defina y ejemplifique los conceptos de especificidad, afinidad y avidez.
3) Un

Ac

monoclonal,

es

siempre

monoespecfico?

Concepto

de

monoespecificidad. Cmo se obtienen los sueros monoespecficos?

4) Qu es el fenmeno de prozona y cules pueden ser las causas que lo
expliquen?
5) Qu es la hemoaglutinacin pasiva o indirecta?
6) Qu es la isosensibilizacin por Rh? Cmo puede producirse? Fundamento de la
reaccin de Coombs o anti-gammaglobulina directa e indirecta. Describa los
distintos tipos de reacciones de Coombs que pueden realizarse y cmo se
obtienen experimentalmente los antisueros utilizados en cada una de ellas.
7) Cules son las diferencias y semejanzas entre aglutinacin y precipitacin?
Tienen igual sensibilidad?
8) Cules son las leyes fsicas que rigen la difusin de las macromolculas? Cules
son los factores que influyen en la aparicin de las bandas de precipitacin?
9) Compare reacciones de interaccin secundaria y primaria analizando:
sensibilidad, visualizacin de la reaccin y equipos necesarios. En qu casos
utilizara una tcnica de interaccin primaria?
10) Detalle la metodologa general para un ELISA puntualizando las etapas de la
reaccin y todos los reactivos necesarios.

28

11) Detalle las diferentes estrategias que pueden aplicarse a la tcnica de ELISA. En
qu casos se utilizan cada una de ellas? Qu caractersticas debe tener el Ac
marcado a usar en cada caso? (monoclonales, policlonales y/o monoespecficos).
12) Desarrollo de cada uno de los pasos del WB. Cmo se verifica la correcta
transferencia de las macromolculas? Ventajas y desventajas de usar un Ac
primario monoclonal y otro policlonal en un WB.
13) Enumere los componentes de cada buffer a emplear y discuta el porqu de su
inclusin.
14) Cmo se determinan los pesos moleculares de las protenas por SDS-PAGE?
15) Cul de estas tcnicas se realiza a voltaje constante y cul a amperaje constante?
16) Considera Ud. que la ubicacin de la membrana respecto de los polos de la cuba
es importante? Justifique.
17) Qu se debe tener en cuenta para determinar el tiempo de transferencia?
18) Qu conclusiones puede sacar frente a un resultado negativo para una protena
cuando revela un WB con 4 Cl Naftol, y la visualizacin de esta misma protena
con quimioluminiscencia?

29

PROBLEMAS
1) Un inmungeno (I) da origen a un suero policlonal. Dicho suero policlonal fue
enfrentado con los Ags esquematizados a continuacin

(Considere que los epitopes esquematizados como circular y oval son, aunque no
iguales, muy similares estructuralmente)
1.a.- Indique:
a) Con qu Ags podra dar una reaccin cruzada el suero policlonal?
b) Con cules slo podra obtener una interaccin primaria?
c) Con cules podra obtenerse una interaccin secundaria?
1.b.- Cmo hara para que el suero policlonal obtenido con el Ag I se comporte
como monoespecfico?
2) Siguiendo el plan adecuado se inmuniz una cabra con Salmonella typhi con el
fin de obtener Acs para comercializar. a) Cmo demuestra (in vitro) la presencia
de Acs anti-Salmonella en el suero de la cabra? b) Si el tcnico del laboratorio
realiza el ensayo con el suero sin diluir e informa un resultado negativo, porque
tanto el control negativo como el positivo dieron el resultado esperado, Usted
est de acuerdo con este informe?
3) Se desea comercializar un kit que ser empleado para determinar el nivel de Ac
anti-Toxoplasma gondii en el suero de individuos posiblemente infectados. El kit
diagnstico est constituido por glbulos rojos humanos grupo B factor Rhmarcados con protenas purificadas del parsito: a) Qu indicaciones deberan
figurar en el prospecto del kit acerca del procesamiento de los sueros de
individuos que fueran del grupo 0 A? b) Esquematice cmo indicara que se
debe realizar la reaccin precisando cules son los controles necesarios.
30

4) Ud es empleado de un laboratorio que est encargado de producir un lote de

placas de IDR para dosar IgG en el suero de los tigres. a) Indique cul sera el
inmungeno que empleara para inmunizar un lote de cabras y porqu. b)
Cmo evaluara que ese suero reconoce slo a la IgG de tigre y no a otras
protenas del suero?
5) En un laboratorio que se dedica a la produccin de vacunas se est cultivando
Clostridium tetani con el fin de obtener la toxina tetnica que posee un PM: 150
kDa. Cmo demuestra la pureza de dicho Ag? Indique los reactivos necesarios
para efectuar su estudio y el esquema del resultado esperado.
6) El empleo de inmunoterpicos puede ocasionar, como efecto adverso, la
produccin de Acs especficos que limitan su eficacia. Considerando que se
administra un inmunoterpico proteico X Por cul de los mtodos que Ud.
conoce determinara si un individuo tratado con X gener Acs especficos?
Podra determinar el isotipo de estos Acs?
7) En su laboratorio Ud. ha obtenido un Ac monoclonal contra la lumazina sintetasa
de Brucella spp. Se sospecha que pertenece a la subclase IgG2a Cmo
comprobara dicha sospecha?
8) Se desea investigar si existi activacin linfocitaria en ratones inmunizados con el
antgeno CSP de Plasmodium falciparum (agente etiolgico de la malaria). Para
ello se decidi investigar el nivel de IL-2 en el suero de los animales. Disee un
EIA para tal fin.
9) Ud. trabaja en un laboratorio donde se produce el AcMo anti CD25 (cadena
del Rc de IL-2). Luego de la obtencin y purificacin, dicho Ac se somete al
control de calidad donde se busca evidenciar si mantiene su capacidad de Ac.
Sabiendo que la tcnica inmunolgica empleada para esto es el ELISA, explique
cmo cree Ud. que se lleva a cabo mencionando los reactivos y controles
necesarios.
31

10) Se ha purificado una protena y al analizar dicho producto por electroforesis en

geles de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes y sin reductor se
obtuvieron los siguientes resultados:

Si usted dispone de un antisuero especfico para la protena, cmo identificara a

partir de la separacin por SDS-PAGE cul es el componente de su inters.
11) Se ha desarrollado un Ac monoclonal murino anti dicha protena. El Ac
monoclonal obtenido presenta buena afinidad y buen ttulo por ELISA. Cuando se
lleva a cabo el WB con dicho monoclonal para detectar la presencia de la
protena, la reaccin no se verifica, a qu puede deberse?
12) Los parsitos A y B presentan una alta homologa estructural. Sin embargo, la
glicoprotena de 75 kD de la superficie de un parsito A genera, en el suero de los
pacientes infectados, altos ttulos de Acs que son especficos de la infeccin con
A. Para su empresa es de inters obtener esos Acs para transformarlos en
reactivo comercial, por lo tanto:
a-Cmo investigara la presencia de Acs contra esa gliocprotena en el suero de
pacientes infectados? Indique la preparacin de la muestra y el diagrama de la
reaccin. b-Podra discriminar si los Acs presentes corresponden al isotipo IgG
o IgM?

32

TRABAJO PRCTICO N 1
TCNICAS DE INTERACCIN SECUNDARIA
Objetivo:

realizacin

de

tcnicas

de

interaccin

secundaria

cualitativas,

semicuantitativas y cuantitativas.
Tcnicas: Precipitacin en medio gelosado, Aglutinacin directa, Aglutinacin reversa y
Aglutinacin indirecta o pasiva.
1) Aglutinacin indirecta: Control de calidad de un kit de Hemaglutinacin
indirecta en microplaca para deteccin de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi.
Validacin de la estabilidad en el tiempo del mismo kit
Objetivo
Titular semicuantitativamente un control positivo con Acs anti-Trypanosoma
cruzi en kit con y sin tratamiento trmico (15 dias a 37C).
Obs: el criterio de aceptacin ser de un ttulo del control positivo de 32 (+/ 1
dil.) para los kits con o sin tratamiento trmico.
Reactivos y materiales
-

GR de carnero sensibilizado con Ags citoplasmticos de Trypanosoma cruzi.

GR de carnero sin sensibilizar.

Diluyente.

Muestra control positivo.

Muestra control negativo.

Microplaca de 96 pocillos.

Pipetas automticas.

Protocolo:
Hay identificados kits con y sin tratamiento trmico.

33

Muestras

Controles

Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Control
Suero
20 ul
+
Referencia

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20ul
dil 1/4

Control
Positivo

Control
Negativo
GR
Sensibiliz . 20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

Diluyente

GR sin
Sensibiliz.

Homogenizar bien cada dilucin antes de pasar los 20 l al pocillo siguiente. Una vez
finalizado cubrir la placa e incubar a 37 C durante 2 horas.
2) Aglutinacin directa: Reaccin de Hemaglutinacin directa en microplaca
Objetivo
Valorar semicuantitativamente los anticuerpos anti-Rh en una formulacin
comercial.
Reactivos y materiales
-

GR factor Rh (+) humanos.

Anticuerpos a valorar.

Diluyente.

Pipetas automticas

Microplaca de 96 pocillos.

Protocolo:

34

Muestra

Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Suero
a
valorar
Diluyente
GR
Rh +

20 ul
20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

Homogenizar bien cada dilucin antes de pasar los 20 l al pocillo siguiente. Una vez
finalizado cubrir la placa e incubar a 37 C durante 2 horas.
3) Aglutinacin directa: Tipificacin de grupo sanguneo.
Objetivo
Tipificar el grupo sanguneo de diversas muestras de sangre humana.
Reactivos y materiales
-

GR humanos para tipificar

Anticuerpos anti Rh (anti D), anti A y anti B

Portaobjetos

Pipetas automticas.

Protocolo:
1- Limpiar los porta objetos con alcohol 70 % y dejar secar.
2- Colocar una gota de sangre entera.
3- Colocar una gota de anti-suero. (no contaminar la punta del vial)
4- Rotar suavemente el portaobjeto.
5- Observar.

Sangre entera
+
Suero anti-A

Sangre entera
+
Suero anti-B

Sangre entera
+
Suero anti-D

35

4) Aglutinacin reversa: Reaccin de aglutinacin indirecta reversa para el

diagnstico de embarazo.
Objetivo
Determinar la presencia de gonadotropina corinica humana (hCG) en orina.
Reactivos y materiales:
-Muestra de orina.
-Partculas de ltex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales anti hCG.
-Control positivo y negativo.
-Placa de vidrio.
-Gotero descartable.
Protocolo:
1- Limpiar la placa de vidrio con alcohol 70 % y dejar secar.
2- Colocar en cada sector de la placa una gota de muestra o control.
3- Colocar una gota del reactivo de partculas de ltex sensibilizadas sobre cada
gota de muestra o control (agitar el frasco)
4- Homogenizar la suspensin con un tip por muestra (no contaminar).
5- Rotar suavemente la placa.
6- Observar.
5) Precipitacin en medio gelosado: Tcnica de Inmunodifusin radial (IDR).
Objetivo
Cuantificar antgenos en muestras complejas.
Reactivos y materiales:
- Suero humano.
- Placas para IDR comerciales.

36

Protocolo:
1- Se siembra 5 l de muestra a valorar en el pocillo del agar.
2- Se deja difundir 24 hs a 4 C. Las placas deben quedar invertidas.
3- Se mide el dimetro del halo obtenido y se interpola en el cuadro de
calibracin.

37

TRABAJO PRCTICO N2
TCNICAS DE DE INTERACCIN PRIMARIA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Objetivo:
Evaluar la presencia de Acs especficos contra toxoide tetnico en sueros humanos.
Determinar el ttulo de los sueros por dilucin a punto final.
Materiales y Reactivos:

PBS: buffer fosfato 0.01 M pH: 7.4 NaCl 0.15 M

Diluyente: PBSTL, PBS con el agregado de 0.05% Tween y 3% leche descremada

Solucin de lavado: PBST

Conjugado: anti-gamaglobulina humana conjugada a peroxidasa

Sustrato/cromgeno: H2O2 0.03% / OPD (ortofenilendiamina) 0.5 mg/ml en buffer

fosfato citrato pH:5

H2SO4 4 N

Suero 1 y 2

Toxoide tetnico

Placas de ELISA previamente sensibilizadas con toxoide tetnico (10 g/ml en PBS) y
bloqueadas con PBS-leche descremada 3%.

Procedimiento

1. Lavar la placa previamente sensibilizada con el toxoide tetnico y bloqueada con

PBST (3 lavados).
2. Colocar las diluciones seriadas de los sueros 1 y 2 en los pocillos
correspondientes:
a. Filas A B, partiendo del pocillo 3, diluciones seriadas del Suero 1 como
lo indique el docente auxiliar
b. Filas C D, partiendo del pocillo 3, diluciones seriadas del Suero 2 como
lo indique el docente auxiliar
c. Pocillos A1-2, B1-2, C1-2 y D1-2 reservados para blancos de reaccin.
38

3. Incubar 45 min a 37C (en estufa), cubrir bien con papel de aluminio. Cumplida la
incubacin, se descarta el contenido de los pocillos volcando enrgicamente la
placa y escurriendo sobre papel absorbente.
4. Lavar las placas con PBST (4 lavados).
5. Agregado del conjugado: Se utilizar una dilucin del conjugado que ha sido
previamente determinada como ptima. Agregar 100 l/pocillo.
6. Incubar 45 min a 37C (en estufa), cubrir bien con papel de aluminio. Cumplida la
incubacin, se descarta el contenido de los pocillos volcando enrgicamente la
placa y escurriendo sobre papel absorbente.
7. Lavar las placas con PBST (4 lavados).
8. Agregado del sustrato/cromgeno: Preparar la solucin en el momento de usar:
2 ml de solucin de OPD (2,5 mg/ml) + 8 ml de buffer citrato fosfato + 10 l de
H2O2 30% (mantenerla en oscuridad!). Agregar 100 l/pocillo lo ms rpido
posible para evitar el desarrollo de color inespecfico.
9. Incubar en oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min.
10. Frenar la reaccin por el agregado de 100 l/pocillo de H2SO4 4 N.
11. Determinar el ttulo de cada suero como la inversa de la dilucin que brinde una
DO igual al 50 % de la seal (DO) mxima.

39

TRABAJO PRCTICO N 3
TCNICAS DE INTERACCIN PRIMARIA
INMUNOBLOTTING O WESTERN BLOTTING
Objetivos:
Evaluar la presencia de Acs especficos contra toxoide tetnico en sueros humanos.
Comparar esta metodologa con la otra tcnica de interaccin primaria desarrollada
en el Trabajo Prctico N 3 (ELISA).
Materiales:
-

Toxoide tetnico

Soluciones de Acrilamida-Poliacrilamida

TEMED y Persulfato de Amonio

Coomassie Blue

Membrana de nitrocelulosa

Suero humanos a evaluar

Anti globulinas humana conjugado con peroxidasa.

4Cl Naftol

Buffer de corrida y transferencia

Equipo para ensamblaje de geles

Cubas

Fuente de poder

H2O2

Procedimiento
1- Partiendo de membranas ya transferidas, bloqueadas, incubar con los sueros 1 y
2, por 45 min.
2- Lavar 3 veces con agitacin suave con TBS-Tween.
3- Incubar con el conjugado diluido en TBS- bloqueante segn lo indique el
ayudante.
4- Lavar 3 veces con agitacin suave con TBS-Tween.
5- Revelar con 4 Cl Naftol/H2O2.
6- Comparar con lo observado en el gel de poliacrilamida provisto por el docente
auxiliar.
40

PLANES DE INMUNIZACIN y ANTICUERPOS MONOCLONALES.

SUEROS Y VACUNAS
TEMARIO
- Planes de Inmunizacin
- Sueros y Vacunas: generalidades. Diferentes tipos y clasificaciones. Ejemplos.
- Inmunizacin en animales de experimentacin para obtencin de sueros policlonales
- Anticuerpos monoclonales

Obtencin

Produccin

Aplicaciones

Ac quimricos / humanizados / humanos

PLANES DE INMUNIZACIN
Desde las primeras experiencias realizadas por Edward Jenner, en el ao 1776, sobre
la utilizacin de un virus similar al de la viruela humana como inmungeno para conferir
inmunidad a personas sanas frente a las cepas virulentas, hasta los actuales planes de
vacunacin, se puede pensar que el avance obtenido ha sido lo suficientemente amplio
como para lograr una respuesta inmune especifica y protectiva frente a cualquier
patgeno. Sin embargo esto no es as, e inclusive en el siglo XXI se sigue investigando y
desarrollando planes mejorados para vacunar a la poblacin mundial. Los nuevos
desarrollos comprenden desde los antgenos utilizados, los adyuvantes y efectos
sinrgicos por combinaciones de vacunas. Como ejemplo del desafo que an representa
este campo se puede citar el desarrollo de la vacuna contra la inmunodeficiencia
adquirida (SIDA), o el desarrollo de vacunas efectivas en patologas como la malaria. Por
otro lado, aunque parezca un contrasentido, el desarrollo de nuevas vacunas debe
enfrentar rigurosas fases de desarrollo y cumplimiento de legislacin que hacen su
avance muy restrictivo. Adems, el componente econmico para el desarrollo de
algunas vacunas no despierta el inters de compaas farmacuticas.
La inmunoterapia comprende la inmunizacin activa (vacunacin), que puede ser
profilctica o de tratamiento, y la pasiva (seroterapia).

41

Vacunacin
Algunos de los factores a tener en cuenta para el desarrollo de una vacuna son:
1- Inmungeno
En el caso de las toxinas como la tetnica o diftrica encontramos el desafo de
presentar al sistema inmune un Ag que debe ser similar en su conformacin al nativo y a
su vez no presentar ningn grado de toxicidad. As se desarrollaron los toxoides, toxinas
que han sido modificadas de tal forma que sin ser txicas mantienen similitud antignica
tal que permite desarrollar Acs que reconozcan y bloqueen a la toxina nativa. En el caso
de ser microorganismos como bacterias, las mismas pueden estar inactivadas
(microorganismo muerto) o atenuadas, es decir microorganismos que mantienen su
capacidad infectiva, pero que no son capaces de generar enfermedad. En el caso de los
virus, actualmente se usan protenas virales obtenidas por ingeniera gentica (vacuna
hepatitis B) como tambin virus atenuados por tcnicas de pasajes sucesivos en
distintos organismos (Ej. papiloma humano y el virus causante de la poliomielitis).
2- Vas de administracin
Existen diferentes vas de administracin y en parte, stas determinarn la
calidad de la RI generada. Podemos citar la vacuna anti-Polio oral (Sabn) frente a la de
va intramuscular (Salk). En el caso de la Sabn, la administracin oral emula la va
natural de infeccin llevando a la generacin preferencial de Acs del isotipo IgA y muy
buena inmunidad de mucosas. La vacuna Salk, al ser intramuscular genera una muy
buena proteccin para el individuo vacunado a expensas del isotipo IgG, pero no brinda
buena inmunidad de mucosas. Esto hace que la vacuna Sabn sea ms efectiva.
La utilizacin de va intramuscular y subcutnea est muy difundida en vacunas
con agentes muertos o proteicos que son aplicadas cerca de sistemas de ganglios
linfticos.
3- Adyuvantes
Los adyuvantes son sustancias capaces de exaltar y/o modular la RI generada por
el inmungeno que se aplican junto con la formulacin vacunal. En el caso de las
vacunas utilizadas en el humano hasta el momento, la FDA slo aprueba el uso de geles
de hidrxido de aluminio y fosfato de aluminio. En el caso de inmunizacin en animales
de experimentacin se utilizan los adyuvantes de Freund (completo e incompleto), que
originan una gran exacerbacin de la respuesta celular y humoral, pero dado que
42

tambin produce una importante necrosis en el sitio de aplicacin en forma de

granuloma, no es posible su uso en humanos.
4- Edad del individuo
La edad de vacunacin depende de cada vacuna en particular y se relaciona con
la madurez del sistema inmune y su capacidad para responder frente al estmulo.
5- Nmero de aplicaciones
El nmero de aplicaciones puede variar segn el inmungeno y la caracterstica
de la poblacin a la que se va a vacunar. Esto surge de estudios estadsticos donde se
comprueba el grado de proteccin alcanzada. Es de importancia sanitaria y econmica el
poder definir exactamente el nmero de repeticiones que se debe aplicar en cada caso.
Normalmente, se observa que la vacuna no es efectiva en el 100% de la
poblacin vacunada. Existe un fenmeno denominado inmunidad de masas o barrera
sanitaria, que permite la proteccin de los individuos no protegidos dado que la
vacunacin efectiva en el resto de la poblacin, impide la diseminacin del patgeno.
Seroterapia
Se usa este mtodo, tambin denominada inmunizacin pasiva cuando se
necesita neutralizar al patgeno o toxinas liberadas por el mismo inmediatamente. Hay
en el mercado sueros homlogos, es decir provenientes de la misma especie a la cul va
a ser administrado, como el suero antitetnico para humanos que proviene de
hemoderivados, y sueros heterlogos, es decir aplicados en individuos de una especie
diferente a la que le dio origen. Como ejemplo podemos mencionar los sueros antiofdicos, obtenidos en caballos y usados en humanos. El uso de los sueros heterlogos
tiene la complicacin de que ellos mismos se comportan como antgenos que van a
desarrollar en el individuo posibles complicaciones, las mismas pueden ir desde
reacciones leves a reacciones anafilcticas.
Inmunizacin de animales de experimentacin
En general las mismas estrategias usadas en los planes de vacunacin humana
son empleadas en animales de experimentacin, aunque en el caso de los animales los
ttulos buscados sean muy superiores a los buscados en una seroconversin.

43

La edad del animal deber ser tal que su sistema inmune est lo suficientemente
maduro. La eleccin de la especie, dentro de las comnmente utilizadas en bioterios,
deber ser aquella en la cual el inmungeno se presente en una escala gentica ms
diferenciada de la que proviene la sntesis del inmungeno a usar. Adems hay que
tener en cuenta el tipo de antgeno utilizado, dado que si es un polisacrido o una
protena, se esperarn diferentes tipos de respuesta humoral y de memoria
inmunolgica para ese antgeno.
Con respecto a la dosis de inmungeno, sta puede variar e influir en la calidad
de los anticuerpos producidos. En general, en el caso de protenas, depende de la
especie a inmunizar abarcando un amplio rango en el orden de los microgramos a
miligramos por dosis aplicada.
En lo que respecta a los adyuvantes usados, es comn el uso de adyuvante de
Freund completo en la primera dosis, y el adyuvante de Freund incompleto en las
siguientes, para garantizar una mejor respuesta inmune.
Las vas de aplicacin ms usadas son, generalmente, intramusculares y
subcutneas, buscado sitios cercanos a ganglios linfticos como la lnea lateral de la
columna vertebral o los glteos.
El nmero de aplicaciones vara segn el antgeno usado y el animal en
particular, pueden encontrarse grupos de animales endocriados y que presenten una
respuesta inmune diferente. Por lo que sangras exploratrices para el monitoreo del
desarrollo y seguimiento de la respuesta inmune deben ser utilizadas.
En el caso especfico de inmunizacin de ratones para la produccin de
anticuerpos monoclonales, si bien tampoco hay un protocolo nico por todo lo
expuesto, se puede proponer una primera inoculacin con 0.1 mg de antgeno con
adyuvante de Freund completo, un descanso de 4 semanas, luego 2 o 3
reestimulaciones peridicas monitoreando el nivel de anticuerpos especficos y una
ltima estimulacin 3 das antes de la fusin.
En el caso de poseer muy bajas cantidades de inmungeno, se puede recurrir a la
inoculacin intraesplnica con buenos resultados.
ANTICUERPOS MONOCLONALES

44

La respuesta inmune humoral normal frente a un antgeno se establece a partir de

linfocitos B (LB) activados y es policlonal, por lo tanto frente a una inmunizacin se
sintetizarn anticuerpos, provenientes de diferentes clones de LB que van a reconocer
diferentes epitopes del antgeno y la respuesta a cada uno de ellos depender del grado
de antigenicidad de los mismos. Cada clon de LB sintetizar Acs con la misma
especificidad y caractersticas, es decir una poblacin homognea de Acs. Como la
respuesta inmune es la resultante de la activacin de muchos clones, tendremos una
mezcla de muchas poblaciones, resultando as en una poblacin general de Acs
heterognea.
Durante muchos aos se busc obtener una lnea de cultivo celular in vitro permanente
de LB productores de anticuerpos con especificidad y afinidad conocida para un
determinado antgeno, pero dada la baja sobrevida de los LB en medios de cultivo, esto
no se poda lograr. Recin en 1975 los investigadores Kohler (Alemn) y Milstein
(Argentino) trabajando en la Universidad de Cambridge, lograron este objetivo por
medio de una ingeniosa fusin de LB productores de Acs, y una lnea de clulas de
mieloma (cancerosas) que le conferan inmortalidad a los mismos. Sin embargo, este
hallazgo no lleg a ser bien ponderado en todo su potencial y tal fue as, que la tcnica
original no fue patentada en su momento ni por los investigadores ni por la Universidad.
En 1984 este logro signific para estos investigadores el premio Nobel de Medicina. Los
anticuerpos as obtenidos, que derivan de un solo clon celular de LB y que posee
capacidad de replicacin permanente in vitro, fueron denominados anticuerpos
monoclonales (AcMo).
Los AcMo han permitido un avance cualitativo y cuantitativo en diferentes reas tanto
de la ciencia como de la industria y, si bien, las metodologas actuales de obtencin y
produccin de AcMo han sufrido modificaciones de la original, la estrategia bsica en la
produccin de los AcMo se ha mantenido.
Los pasos bsicos para la obtencin de los AcMo se pueden resumir en los siguientes:
1) El primer paso comprende la inmunizacin de un animal con el antgeno deseado. La
utilizacin de diferentes planes de inmunizacin puede variar segn el antgeno. Pero
una vez finalizada la inmunizacin se espera que el animal posea suficientes LB
activados productores de anticuerpos especficos para el antgeno utlizado. Se sacrifica

45

al animal y se extrae el bazo en condiciones de esterilidad, luego se obtienen los

esplenocitos recolectndolos rpidamente en un medio de cultivo nutritivo.
2) La fusin entre los esplenocitos y las clulas de mieloma se realiza generalmente por
el uso de polietilenglicol (PEG), no se conoce bien el mecanismo mediante el cual acta,
pero es sabido que el PEG permite la fusin entre membranas celulares produciendo de
esta manera hbridos por combinacin de diferentes clulas. Este proceso es aleatorio y
produce fusiones entre las distintas clulas presentes en el medio, pero solo la fusin
entre los plasmocitos y las clulas de mieloma pueden formar los hbridos viables para
las condiciones de trabajo, el resto son generalmente lneas abortivas
3) La seleccin post-fusional de los hibridomas se realiza fcilmente dado que las clulas
de mieloma utilizadas son defectivas en la enzima hipoxantil-guanil-fosforribosiltransferasa (HGPRT) la cual permite la sntesis de nucletidos a travs de la va de
reciclaje o salvataje, la cual utiliza como sustrato hipoxantina y timidina. Esta va se
activa especialmente cuando la va sntesis de novo de nucletidos, a travs de la va de
las xantinas, est bloqueada por antagonistas del cido flico como es la aminopterina.
Por este motivo los hbridos son colocados en un medio selectivo denominado HAT
enriquecido en hipoxantinas y timidina adems del agregado de aminopterina como
bloqueante. Por esto, las clulas mieloides deficitarias en HGPRT mueren. Por otro lado,
los esplenocitos no poseen viabilidad prolongada, pero los hbridos de ambos que
combinaron la viabilidad de las clulas de mieloma in vitro y la capacidad de sobrevida
en ese medio que le confiere la presencia de la HGPRTasa de los linfocitos B, les permite
proliferar.
4) El cultivo de los hibridomas se realiza en medios nutritivos de diverso origen como ser
suero fetal bovino o medios ya utilizados en crecimiento de linfocitos aprovechando
factores estimulatorios secretados por macrfagos y otras clulas. Normalmente luego
de 2 3 das se ha incrementado en 100 veces la concentracin de hbridos en esos
medios de cultivo.
5) Deteccin por medio de tcnicas de interaccin primaria tipo ELISA de la presencia de
AcMo de inters en el sobrenadante de cultivo celular. Se seleccionan los hbridos que
tengan crecimiento y produccin de AcMo especficos para el antgeno.
6) El aislamiento de cada clon individual se puede realizar por tcnicas de dilucin lmite
en medio lquido o por aislamiento en agar blando, tcnica similar a la utilizada para el
46

aislamiento de bacterias. Una vez aislado, para asegurarnos su monoclonalidad se

vuelve a realizar el aislamiento. Se suele llamar a este paso reclonado.
7) Una vez aislados los hibridomas se seleccionan por tcnicas de interaccin primaria,
aquellos que secretan los AcMo de mejor calidad, la cual estar dada bsicamente por
su especificidad para el antgeno original y por una constante de afinidad alta.
8) La produccin en escala de los AcMo se pude realizar por expansin de los hibridomas
en reactores fermentadores (sistema industrial) o utilizando la capacidad tumoral del
hibridoma y su implantacin en animales husped con la produccin de lquido asctico
el cual presenta concentraciones en el orden de mg/ml de AcMo.
9) La purificacin de los AcMo de los medios donde se produjeron pueden variar desde
precipitacin en sulfato de amonio, cromatoenfocado o cromatografa de afinidad,
entre otros, pero la eleccin del mtodo de purificacin depender del grado de pureza
necesario de los AcMo para sus aplicaciones posteriores.
Normalmente en los pasos 5,6 y 7 se congelan en nitrgeno lquido parte de los
hibridomas producidos como banco de reserva.
Ventajas frente a los sueros policlonales
1) Produccin ilimitada de anticuerpos a escala piloto o industrial.
2) Fcil conservacin de los hibridomas en nitrgeno lquido.
3) Buena estabilidad de los AcMo en congeladores.
4) Pureza para su posible conjugacin con otras protenas o frmacos.
5) No es necesario contar con antgeno puro para nuevas obtenciones.
Desventajas
1) Los costos de produccin los hacen caros y restrictivos.
2) El tiempo necesario para su obtencin. Si bien es variable, puede tomar desde 6
meses hasta aos.
3) No son utilizables en terapias prolongadas en humanos debido al origen murino.
Aplicaciones
Son innumerables los campos de aplicacin de los AcMo, tanto en investigacin como
en la aplicacin en biosensores, como catalizadores entre otros. En la clnica, son usados
47

como herramienta de diagnstico dada su altsima sensibilidad y especificidad. As, han

llevado los lmites de la deteccin de protenas al orden de fentomoles y an menos. En
el caso de estudios celulares han permitido la identificacin y aislamiento de sub-clases
de clulas, hasta no mucho tiempo atrs, desconocidas.
Con referencia a las aplicaciones teraputicas de los AcMo en enfermedades
autoinmunes, cncer y en trasplantes de rganos apareci una idea revolucionaria que
se denomin bala mgica que consiste en tener un Ac especifico contra una
determinada clula o tejido maligno. El Ac podra transportar un posible frmaco y
llevarlo especficamente al blanco sin afectar al resto de los tejidos sanos. Esta
aplicacin pareci abrir una ventana revolucionaria en la inmuno-farmacologa y si bien
la idea ya ha sido aplicada, han surgido problemas metodolgicos y prcticos que han
llevado a que los AcMo puedan ser aplicados en pocos tratamientos teraputicos.
De algunos desarrollos destacados de este concepto podemos mencionar los siguientes:
1) Utilizacin de las regiones Fab o Fv del AcMo en ausencia de la regin Fc. Por su
menor tamao es de esperar que las reacciones de tipo anafilcticas disminuyan. Por su
inestabilidad estructural se los ha fusionado a otras protenas a fin de estabilizarlos y de
poder tenerlos en forma multivalente. Esto presenta como desventaja que los Fv poseen
un mayor ndice de clearance en tejido blanco y una mayor inestabilidad que los Fab,
pero por otro lado poseen una menor inmunogenicidad. En ambos casos por la falta de
la regin Fc se pierden la capacidad biolgica de activacin de complemento, de
opsonizacin, de mediar reacciones de ADCC, las cuales son importantes en cuanto se
busca eliminar la clula blanco ms que bloquear una funcin. Las aplicaciones van
desde detoxificacin, direccionamiento de toxinas, drogas o radio nucleidos a clulas
tumorales.
2) Acs quimricos: son AcMo que mantienen la regin variable murina fusionada con
regiones constante humana. Se obtienen por ingeniera gentica, poseen una mayor
afinidad que los anteriores, mayor vida media y mantienen la actividad biolgica por la
presencia del Fc. La inmunogenicidad disminuye pero no desaparece. Actualmente la
mayora de los AcMo en uso teraputico son de este tipo.
3) Acs humanizados: Con el fin de aumentar la homologa con los Ac humanos se
sintetizan Acs que solo poseen porciones de la regin variable murina (que le permite
conservar la afinidad por el antgeno) fusionada con cadenas humanas. Se obtienen con
48

el uso de ratones transgnicos. Deberan poseer menor inmunogenicidad aunque la

misma se puede dar incluso con las regiones humanas que poseen.
4) Acs humanos: los mismos no poseen ninguna secuencia procedente de otro animal.
Se obtiene de dadores humanos inmunizados y posteriormente transformando los
linfocitos B por medio de RT-PCR, clonage y display en fagos. Tambin por ratones
transgnicos con genes para codificar inmunoglobulinas humanas, o por ratones
inmunodeficientes a los cuales se les trasplanta mdula sea humana. Estos anticuerpos
deberan poseer menor inmunogenicidad terica si se usasen las secuencias ms
conservadas del ADN de los anticuerpos humanos.
Algunos usos y aplicaciones
En la actualidad se encuentran una docena de AcMos en uso con aplicaciones
teraputicas in vivo. Los mecanismo efectores pueden ir desde el bloqueo de receptores
de clulas diana a la accin citotxica por el transporte de drogas, radio nucleidos o
toxinas a las mismas.
1- Tratamiento en cncer. En el caso de tumores mamarios que posean un estado
metastsico avanzado se est utilizando un AcMo llamado Trastuzumab (Herceptin ), el
cual es capaz de bloquear el receptor HER2 de las clulas tumorales, cuyo ligando es el
Factor de Crecimiento Epidrmico (Epidermal Growth Factor, EGF). El inconveniente que
posee es que si bien este receptor es sobre expresado en un 20% por estas clulas
tumorales no se evita el ataque de tejido sano que tambin expresa, en menor medida,
este mismo receptor.
2- Trasplantes. Los AcMo murino Muromonab (OKT3) se utilizan en el tratamiento del
rechazo agudo, tiene especificidad por la cadena psilon de la molcula CD3. El
mecanismo de accin es por el bloqueo de la unin del TCR con el antgeno. Esto
produce la modulacin del complejo TCR/CD3 en la superficie del LT. De esta manera
solo los LT son eliminados por fijacin de complemento y opsonizacin, mantenindolos
por debajo de un 2%, siendo los valores normales de hasta un 60%. Estos AcMo
presentan algunos riesgos a tener en cuenta al momento de su uso, como la posible
aparicin de Acs neutralizantes que los haga intiles frente a un proceso de rechazo
agudo donde sea nuevamente necesaria la inmunosupresin. Tambin puede ocurrir

49

que el proceso de inmunosupresin severa quede de forma permanente y ser muy

riesgosa para el futuro del paciente.
Otro ejemplo es el uso del Ac Basiliximab (Simulect) en el trasplante de rin.
Este AcMo se une y bloquea al receptor de interleuquina 2 (IL-2R) en los LT. Tiene
especificidad por la cadena alfa del receptor (CD25) Esto no modifica la proporcin
normal de LT circulantes pero evita su activacin como sucede en el rechazo agudo.
Normalmente se utiliza junto con ciclosporina (frmaco inmunosupresor de base) el cual
tiene una accin sinrgica al bloquear la sntesis de IL-2.
3- Enfermedades autoinmunes. La perdida de tolerancia por parte del sistema inmune a
Ag propios, lleva a un ataque de clulas del sistema inmune contra estructuras o tejidos
del propio organismo. En el caso de artritis reumatoidea se ha utilizado Infliximab
(Remicade) el cual es un AcMo que tiene especificidad por el Factor de Necrosis
Tumoral (Tumor Necrosis Factor, TNF). Generalmente se administra conjuntamente con
metrotexato (droga de eleccin) y que acta reduciendo la expresin de molculas de
adhesin celular, tales como E-Selectina, molculas de adhesin intercelular (ICAM-1) y
molculas de adhesin vascular (MCP-1) entre otras. De esta manera reduce
sustancialmente los fenmenos inflamatorios de esta enfermedad permitiendo a las
articulaciones un normal funcionamiento.
4- Tratamiento en alergias. Se han probado AcMo que reconocen el Fc de la IgE, de esta
forma es posible bloquear su unin al receptor de Fc presente en los mastocitos y
basfilos inhibiendo la fase inicial de este tipo de reacciones.

50

CUESTIONARIO DE ORIENTACIN
1) Contestar Verdadero o Falso y justificar
a. La respuesta inmune humoral es siempre del tipo policlonal.
b. Los AcMo se sintetizan in vitro.
c. La fusin de las membranas celulares por el PEG solo se da entre los LB activados
y las clulas de mieloma.
d. El medio HAT no puede utilizarse en la seleccin clonal.
e. La purificacin de los AcMo se realiza con la tcnica ms sensible.
f. El desarrollo de los AcMo humanizados se origin por el bajo costo de
produccin.
g. La constante de afinidad de los AcMo es alta.
2) Por qu cree que en el caso del AcMo OKT3 no se utiliza un suero policlonal anti
TCR?
3) Cree que la utilizacin de los AcMo es siempre ventajosa frente a la utilizacin de los
sueros policlonales en tcnicas de tipo ELISA?

51

PRODUCCIN Y CONTROL DE INMUNOTERPICOS

TEMARIO
-De cada molcula se tratar:

Funcin en el organismo / sistema inmune.

Descripcin qumica

Obtencin. Sistema de expresin

Purificacin

Control de calidad: identidad, pureza, bioensayos

Aplicaciones / Contraindicaciones

-Molculas:

Citoquinas: IL-2, GM-CSF, IFN tipo I

AcMo: Bevacizumab, Infliximab

Obtencin y purificacin de molculas recombinantes

La obtencin de Ags y Acs es de gran inters tanto para el rea industrial como
cientfica. Actualmente, los Ags que se emplean como inmungenos en vacunas, como
reactivos de diferentes kits comerciales o como inmunoterpicos, pueden tener dos
orgenes: los denominados Ags extractivos, que provienen de la clula que los produce y
los recombinantes, que se obtienen por mtodos de biologa molecular.
Con el advenimiento de la Ingeniera Gentica y las tcnicas de Biologa Molecular
estos Ags ahora pueden expresarse en el laboratorio, prescindiendo de su agente
productor. La metodologa puede resumirse en:
a- Obtencin del material genmico que codifica para el Ag en cuestin.
b- Amplificacin de ese material y clonacin en un sistema adecuado.
c- Expresin en un sistema que lo permita
d- Aislamiento y purificacin del Ag expresado.
La clonacin y expresin puede darse en sistemas procariontes, Escherichia coli y
sus variantes es el ms empleado. Tambin existen los sistemas eucariontes de
expresin como las levaduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cereviseae), clulas de
insectos (empleando baculovirus), o las clulas de mamferos (clulas de ovario de
hmster o CHO). Estos sistemas son altamente verstiles, ya que la clonacin permite
52

trabajar con el Ag entero o con fragmentos muy determinados del mismo. Cada uno
tiene sus ventajas y desventajas diferenciales. Adems, hay limitaciones, ya que no
todos los Ags son susceptibles de ser expresados con su plegamiento correcto y no se
logra obtener Ags con el patrn de glicosilacin natural, lo que puede alterar la
inmunogenicidad del mismo.
Para abordar la purificacin de una protena recombinante se puede comenzar con
mtodos de enriquecimiento, como la precipitacin salina o alcohlica, o la
centrifugacin diferencial. Luego el mtodo cromatogrfico a emplear depender de las
caractersticas fisicoqumicas de la macromolcula a purificar y de los contaminantes.
Estas caractersticas son: tamao, forma, carga, hidrofobicidad y conformacin
tridimensional. Los mtodos cromatogrficos incluyen: exclusin molecular (separa por
tamao y forma), intercambio inico (discriminacin por carga), fase reversa e
interaccin hidorfbica (por hidrofobicidad) y afinidad (se aprovechan las interacciones
Ag-Ac, enzima-inhibidor, hormona-receptor, lectina-HdC, etc).
Es muy importante tener en cuenta que: sea cual sea la metodologa empleada para
producir una protena recombinante y purificarla debemos considerar: el rendimiento,
el costo, el tiempo, la conservacin de la actividad despus de los sucesivos pasos de
purificacin y, en caso de necesidades industriales, la capacidad de llevar a grandes
escalas la produccin.
Generalidades sobre ensayos para el control de calidad
Ensayos fisicoqumicos
Control del buen estado del producto: pH, concentracin proteica por OD280 nm
Ensayo de pureza por SDS-PAGE o electroforesis capilar
Ensayo para determinar ausencia de agregados de alto peso molecular
cromatografa de exclusin molecular (HPLC)
Ensayo de identificacin mediante el tiempo de retencin en columnas de fase
reversa (HPLC) o por ELISA
Evaluacin de la glicosilacin por HPLC de fase normal.
Determinacin de isoformas por Isoelectroenfoque

53

 Ensayo de identificacin del isotipo de inmunoglobulina (por doble inmuno

difusin radial o Western Blot)
Impurezas relacionadas con el proceso: protenas del husped (ELISA), ADN del
huesped (RT-PCR)
Ensayos microbiolgicos
Esterilidad
Ausencia de endotoxinas (LAL Test)
Ensayos biolgicos
De acuerdo a cada inmunoterpico. En general relacionados con la unin directa
de la molcula al blanco. Ejemplos: ensayos de induccin de muerte por ADCC o CDC
para AcMo, ensayos de estimulacin o inhibicin de la proliferacin de ciertas lneas
celulares, etc.
EJEMPLOS DE INMUNOTERAPICOS
Aldesleukina (Proleukin, Ilcass, Ilgen-2, Interleukina 2 Aspen)
La IL-2 es una citoquina cuya funcin consiste en la estimulacin de los linfocitos para su
activacin y expansin, tiene funcin autcrina sobre los LT, los cuales la sintetizan, y
parcrina sobre LB, macrfagos, neutrfilos y clulas NK.
En la industria farmacutica, la Aldesleukina (IL-2) se obtiene de manera recombinante,
expresndose la misma en E. coli (sistema procarionte) y siendo purificada luego
mediante diversos mtodos cromatogrficos (intercambio inico, afinidad). Su control
de calidad consiste principalmente en evaluar su identidad (deteccin inmunolgica por
ELISA), en la realizacin de un SDS-PAGE para evaluar pureza y en un bioensayo con
clulas CTLL-2 para evaluar si conserva su funcin biolgica (estimulacin de la
proliferacin de la lnea celular de linfocitos murinos).
La Aldesleukina se utiliza en casos de carcinoma renal metastsico o melanoma maligno
avanzado, para activar al sistema inmune y que ste logre combatir a las clulas
tumorales. Tambin para casos de trasplante de mdula sea para estimular la
proliferacin de las clulas del sistema inmune.
54

La administracin de Aldesleukina puede eventualmente causar una reaccin grave y

potencialmente mortal denominada "sndrome de fuga capilar", caracterizado por la
hipotensin severa, hipoalbuminemia y hemoconcentracin, lo cual lleva a un cuadro de
edema masivo y shock.
GM-CSF (Sargramostim: Leukine o Molgramostim: Molcass, Growgen-GM)
El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrfagos (GranulocyteMacrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF) es una citoquina cuya funcin consiste
en actuar como factor de crecimiento y diferenciacin de la estirpe granuloctica
(neutrfilos, eosinfilos, basfilos) y monoctica (monocitos-macrfagos) durante la
diferenciacin en mdula sea de una clula progenitora mieloide.
El GM-CSF en la industria farmacutica se obtiene de manera recombinante,
expresndose el Sargramostim en Saccharomyces cerevisiae (sistema eucarionte) y el
Molgramostim en

E. coli (sistema procarionte), siendo purificada luego mediante

diversos mtodos cromatogrficos. Su control de calidad consiste principalmente en

evaluar su pureza e identificacin, y en un bioensayo con clulas MO7e (leucemia
megacarioblstica humana) o TF1 (eritroleucemia humana) para evaluar si conserva su
funcin biolgica (estimulacin de la proliferacin de la lnea celular).
El GM-CSF se utiliza en casos de, anemias y hemorragias severas, infecciones y
quimioterapia, y cuando se necesita una recuperacin hematopoytica o estimulacin
de liberacin de clulas madres a circulacin, en casos de (auto)transplantes de mdula
sea.
La administracin de GM-CSF tiene efectos secundarios comunes leves, como ser el
dolor de huesos o sndrome gripal, con fiebre, fatiga, escalofros y dolores musculares.
Se ha reportado el Sargramostim tiene efectos secundarios mucho ms leves que el
Molgramostim.
IFN tipo I (alfa y beta)
Infosfat, Avirostat (-2a). Bioferon, Inter 2-b (-2b)
Blastoferon (-1a). Betaferon (-1b)
La famila de los Interferones de tipo I est formada por el IFN (de origen leucocitario,
que a su vez se subdivide en -2a y -2b) y el IFN (de origen fibroblstico, que tambin
55

se subdivide en -2a y -2b). Todas estas molculas se unen al mismo receptor sobre la
superficie celular y provocan respuestas biolgicas similares. Dentro de sus funciones
como citoquinas se encuentran la accin antiviral, anti proliferativa y el efecto
inmunomodulador.
En la industria los Interferones de tipo I se obtienen de manera recombinante,
expresndose el IFN-2 en E. coli (sistema procarionte) y el IFN en clulas de
mamferos. Se purifica cada uno de manera individual mediante diversas cromatografas
(intercambio inico, afinidad). Su control de calidad consiste principalmente en evaluar
su pureza (HPLC) e identificacin (ELISA), y en un bioensayo con clulas A549 para
evaluar si conserva su funcin biolgica (actividad antiviral sobre clulas de carcinoma
de pulmn humano infectadas con el virus causante de la encefalomiocarditis).
El IFN-2a se utiliza en casos de leucemia de clulas vellosas, hepatitis C crnica,
sarcoma de Kaposi, herpes genital, etc.
El IFN-2b se utiliza para tratar de hepatitis B o D crnicas, sarcoma de Kaposi, leucemia
mieloide crnica y ms.
Tanto el IFN-1a como el IFN-1b estn indicados para el tratamiento de pacientes con
esclersis mltiple.
Los efectos adversos ms reportados han sido los relacionados con un cuadro similar a
gripe: fiebre, escalofros, cefaleas.
Bevacizumab (Avastin)
El Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (Vascular Endotelial Growth Factor, VEGF)
es una citoquina cuya funcin consiste en la estimulacin de la angiognesis por unin a
los receptores VEGFR-1 y R-2 presentes en la superficie de las clulas endoteliales de los
vasos sanguneos. El Bevacizumab es un AcMo anti-VEGF tiene como funcin neutralizar
a esta molcula e impedir que se una a sus receptores y cumpla su funcin, o sea, el
imnunoterpico se utiliza para disminuir la angiognesis, la cual se encuentra
aumentada en algunos tipos de tumores.
El Bevacizumab es un AcMo humanizado que se obtiene por tecnologa de ADN
recombinante y se expresa en clulas CHO (clulas de mamfero), siendo purificado
luego mediante diversos mtodos cromatogrficos (intercambio inico, afinidad). Su
control de calidad consiste principalmente en la realizacin de algn mtodo para
56

evaluar pureza e identidad y en un bioensayo con clulas HUVEC para evaluar si

conserva su funcin biolgica (inhibicin de la proliferacin de la lnea celular de
endotelio vascular).
El Bevacizumab se utiliza en casos de cncer metatsico de colon o de mama, carcinoma
renal o de pulmn avanzado, inhibiendo la neovascularizacin tumoral y por lo tanto, el
crecimiento de estos tipos de tumores.
La administracin de Bevacizumab puede eventualmente causar hipertensin,
problemas en la cicatrizacin y eventualmente riesgo aumentado de perforaciones
gastrointestinales.
Infliximab (Remicade)
El Factor de Necrosis Tumoral Alfa (Tumor Necrosis Factor Alpha, TNF-) es una
citoquina proinflamatoria, principal mediador de la respuesta inflamatoria aguda. El
TNF- se une a sus receptores de tipo I y II (TNF-RI y TNF-RII) para ejercer sus funciones,
los cuales estn presentes en muy diversos tipos celulares.
El Infliximab es un AcMo anti-TNF tiene como funcin neutralizar a esta molcula y
bloquear la unin a su receptor en las clulas blanco, de manera de evitar o enlentecer
el desarrollo de la respuesta inflamatoria. Esta inflamacin se encuentra aumentada o
bien perpetuada en algunos tipos de enfermedades autoinmunes.
El Infliximab es un AcMo quimrico que se obtiene por tecnologa de ADN recombinante
y se expresa en las clulas murinas de mieloma Sp2/0, siendo purificado luego mediante
diversos mtodos cromatogrficos (intercambio inico, afinidad). Su control de calidad
consiste principalmente en la realizacin de algn mtodo para evaluar pureza (SDSPAGE) e identidad (IEF) y en un bioensayo para evaluar si conserva su funcin biolgica.
El bioensayo consiste en detectar la capacidad de neutralizacin mediante un ensayo de
inhibicin de la muerte celular producida por TNF- sobre una lnea celular sensible a l
(L929, WeHi o U937). Otros bioensayos evalan su capacidad para generar ADCC y CDC.
El Infliximab se utiliza en casos de Artrits Reumatoidea, Artritis Psorisica, Enfermedad
de Crohn, Colitis Ulcerosa y Psoriasis.
La administracin de Infliximab puede eventualmente causar Tuberculosis (por
reactivacin de infeccin latente o infeccin primaria), Hepatitis B (por reactivacin del
virus en portadores crnicos) e infecciones oportunistas por patgenos intracelulares.
57

CUESTIONARIO DE ORIENTACIN
1- Por qu es importante aplicar un mtodo de clarificacin o enriquecimiento
previo a un proceso cromatogrfico de purificacin?
2- Realice un esquema para purificar un Ag citoplasmtico soluble de T. cruzi si Ud
dispone de un suero policlonal altamente especfico para ese Ag.
3- Cmo procede para purificar un AcMo presente en un lquido asctico? Y en un
sobrenadante de cultivo?
4- Se obtuvieron dos protenas recombinantes A y B de un sobrenadante de cultivo
que tiene otras protenas. A tiene agregada una colita de 6 His (PM total 28 KDa), que se
considera un epitope lineal y B es una protena fusionada con Trx, que le asegur un
plegamiento globular a la protena (PM total 45 KDa). a) Que procedimiento para
purificar ambas protenas de la mezcla compleja utilizara si Ud dispone de Acs anti-Trx y
anti-His, b) Por qu mtodo verificara si la purificacin fue exitosa? c- Contando con un
Ac monoclonal anti-His y otro anti-Trx realiza un Immuno Blotting (Western) para ambas
protenas resultando positivo para A y negativo para B Cmo lo explica?

58

INMUNIDAD CELULAR
Tomado de la Gua de TP de Inmunologa (Bioqumica) y adaptado.
TEMARIO
- Conceptos generales sobre la respuesta inmune celular
- Evaluacin de la Inmunidad celular:

Pruebas funcionales in vivo: reacciones de hipersensibilidad.

Procesos preliminares a ensayos celulares: principales marcadores celulares,

tcnicas de aislamiento, enriquecimiento y purificacin.

Pruebas funcionales in vitro: tcnicas de proliferacin por Ags, mitgenos y

ensayos de citotoxicidad. Evaluacin de sustancias secretadas. Bioensayos.

Antgenos de histocompatibilidad: generalidades. Tipificacin de los antgenos

HLA clase I y clase II. Aplicaciones.

INTRODUCCIN
La respuesta inmune est constituida por una sucesin de eventos que
comienzan con la presencia de un estmulo antignico y que culminan con la eliminacin
del agente agresor que la provoc. Una serie de eventos de interaccin celular generar
clulas efectoras que en algunos casos secretarn Acs y en otros, actuarn directa o
indirectamente sobre el antgeno mediante la denominada inmunidad celular que esta
a cargo de los linfocitos T (LT).
Los LT reconocen y responden a pptidos extraos slo cuando estos se
encuentran unidos a las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y
son presentados en la superficie de las clulas presentadoras de antgeno (CPA). Los LT
CD4+ reconocen pptidos asociados a molculas del CMH de clase II (CMH II) mientras
que los LT CD8+ los reconocen cuando se encuentran asociados a molculas del CMH de
clase I (CMH-I). Ambos linfocitos reconocen a los pptidos asociados a las molculas del
CMH-I o CMH-II a travs del receptor para antgenos de los linfocitos T (TCR).
La respuesta inmune adaptativa no se inicia en el sitio de ingreso del agente
agresor, sino que ocurre en los rganos linfticos secundarios (bazo, ganglios linfticos,
tejido linfoide asociado a mucosas). Es ah donde ocurre la activacin de los LT, lugar a

59

donde llega el antgeno transportado por linfa y/o, las clulas dendrticas (CDs) que
capturaron a los antgenos en la periferia.
Las CDs (una de las CPA junto con los macrfagos y los LB) son las primeras en
tomar contacto con los antgenos. Los internalizan, los degradan y los presentan en
contexto de molculas de CMH de clase II en los rganos linfoides secundarios a los LT
CD4+ vrgenes. Luego de reconocer al pptido-CMH-II a travs del TCR, los linfocitos se
activan y comienzan a secretar IL-2, un factor de crecimiento autcrino, entran al ciclo
celular y proliferan generndose clones especficos para el Ag que luego se diferenciarn
a linfocitos efectores y de memoria.
La naturaleza del Ag condiciona el perfil de citoquinas secretadas por las CPAs,
guiando la diferenciacin de los LT CD4+ a subpoblaciones de LT CD4+ efectores como
pueden ser Th1, Th2, Th17, entre otros.
La IL-12, entre otras, secretada por las CPAs induce la diferenciacin a la
subpoblacin Th1. Los LTh1 producen IL-2 e IFN, que acta sobre los macrfagos, no
slo estimulando sus funciones microbicidas, sino tambin aumentando la produccin
de IL-12 y citoquinas proinflamatorias, proporcionando un mecanismo de amplificacin
de la respuesta celular. Ms all de su capacidad de activar a los macrfagos, el IFN,
junto con la IL-2, activan a las clulas NK.
La IL-4, entre otras, es responsable de la diferenciacin a Th2. Los LTh2 que
secretan IL-4, IL-5 e IL-13 entre otras, activan preferentemente a los LB, induciendo la
secrecin y el cambio de isotipo de Acs. Este subtipo de LTh juega un papel importante
en la defensa contra parsitos helmintos, y son claves en el desarrollo de enfermedades
de tipo alrgicas.
Las citoquinas IL-1, IL-6, IL-21, IL-23, y TGF promueven la diferenciacin a Th17.
Los LTh17 tienen una importante participacin frente a las infecciones bacterianas y
tambin participan en la aparicin de patologas autoinmunes. Los LTh17 secretan
fundamentalmente IL-17, adems de IL-21 e IL-22. La IL-17 induce una rpida infiltracin
de neutrfilos al tejido infectado.
La activacin de los LT CD8+ vrgenes requiere el reconocimiento de Ags
(microbianos, tumorales, etc.) asociados a molculas del CMH I. Las clulas Th1,
mediante la produccin de IL-2, pueden estimular la expansin clonal de los LT CD8+ y
60

su diferenciacin a clulas citotxicas (LTc) activadas. Los LTc al reconocer a la clula

blanco a travs de sus TCR, inducen una serie de transformaciones que llevan a la
liberacin de las enzimas contenidas en sus grnulos que desencadenan la apoptosis de
la clula blanco infectada o tumoral.
La evaluacin de la inmunidad celular puede realizarse por medio de pruebas
funcionales y/o no funcionales. Con las pruebas no funcionales se puede conocer
solamente el nmero de linfocitos y las relaciones LT/LB, LT CD4+/LT CD8+, entre otras.
Las pruebas funcionales permiten evaluar la capacidad de las distintas poblaciones
celulares de cumplir sus funciones biolgicas. Adicionalmente, este tipo de pruebas
tambin son muy utilizadas para verificar la correcta funcin de otras molculas como
ser los Acs o citoquinas. En este caso, las clulas se comportan como un reactivo.
Pruebas no funcionales:
Citometra de flujo: Permite el anlisis individual de gran nmero de clulas en
tiempos muy cortos generando informacin de mltiples parmetros al mismo tiempo,
entre ellos: tamao celular relativo, granularidad y complejidad interna.
Es una tcnica muy verstil que permite, entre otras cosas, cuantificar distintas estirpes
celulares mediante la marcacin previa de la suspensin celular con anticuerpos
conjugados a fluorocromos especficos para marcadores de superficie. Tambin es
posible determinar parmetros funcionales mediante sondas fluoromtricas como ser el
potencial redox, la capacidad proliferativa de las clulas, la apoptosis, etc.
Pruebas funcionales:
In vivo
Hipersensibilidad cutnea tarda: demuestra la existencia de una respuesta celular
con memoria, es una reaccin de hipersensibilidad mediada por clulas,
fundamentalmente macrfagos y LTh1. Ej: reaccin cutnea PPD para la deteccin de
respuesta de memoria o infeccin por Mycobacterium tuberculosis (Reaccin de
Mantoux o tuberculina).
En este tipo de respuestas se distingue una fase inicial de sensibilizacin en la
que se produce el contacto con el estmulo antignico (en el ejemplo, el ingreso del
bacilo Mycobacterium tuberculosis), y una fase efectora, dependiente de un contacto
61

secundario con el Ag o Ags (inoculacin intradrmica del Ag), que se manifiesta con la
formacin de una induracin y eritema, debido a la infiltracin celular que se concentra
para rechazar el nuevo ingreso.
La fase de sensibilizacin dura de una a dos semanas, tiempo durante el cual los
linfocitos T se activan y expanden tras el reconocimiento del Ag presentado por las
CPAs. La fase efectora ocurre en tejido extralinfoide, se detecta a las 48 - 72 h de ah su
denominacin de hipersensibilidad retardada. Esta demora en la visualizacin de la
respuesta se debe al tiempo que transcurre para que el Ag sea fagocitado por las CDs, el
contacto de ellas con los LT de memoria que reaccionan rpidamente, y el reclutamiento
de los mismos en el tejido expuesto.
In vitro
En algunos casos, previamente a la utilizacin de las tcnicas in vitro, se emplean
mtodos de enriquecimiento celular.
Enriquecimiento por gradiente de Ficoll-Hypaque: la mezcla de F-H otorga una
densidad determinada al medio. Esta mezcla se pone en contacto con una muestra de
sangre entera, y mediante posterior centrifugacin, se separe la capa de clulas
mononucleares del resto de los componentes sanguneos.
Enriquecimiento por adherencia al plstico: los macrfagos y monocitos tienen la
capacidad de adherirse a materiales plsticos, por tal razn se puede enriquecer una
suspensin celular en ellos mediante adherencia a placas de plstico.
Proliferacin celular por mitgenos o antgenos: evalan la capacidad de los linfocitos
de activarse y proliferar frente a mitgenos o a Ags determinados. Los mitgenos son
sustancias capaces de inducir la activacin potencial de todos los linfocitos de
suspensin celular independientemente de su especificidad. Por el contrario, la
proliferacin por Ag induce la activacin slo de aquellos clones con especificidad para
el mismo. Estas caractersticas conducen a diferencias en la seal de respuesta obtenida
y en el tiempo en el cul dicha respuesta se observa.
Hay varios mtodos para evaluar la proliferacin celular. El recuento de clulas es
el ms sencillo para estimar la proliferacin pero es un procedimiento tedioso que
62

conduce a errores importantes. La medicin de la sntesis de ADN es un mtodo muy

efectivo para estimar la proliferacin que se puede realizar evaluando la incorporacin
de timidina tritiada al ADN sintetizado de novo. Es un mtodo fcilmente automatizable,
de gran relacin seal/ruido y que se puede usar para gran nmero de muestras. Su
principal desventaja es la necesidad de disponer de un laboratorio autorizado para el
uso de material radioactivo.
Existe un mtodo inmunoenzimtico que detecta la incorporacin de
bromodesoxiuridina (BrDU) mediante la utilizacin de anticuerpos especficos. Esta
misma determinacin tiene su variante para ser medida por citometra de flujo
utilizando un conjugado marcado con un fluorocromo.
Mediante citometra de flujo tambin se puede determinar la proliferacin
celular empleando la marcacin con carboxifluorescen diacetato succimidil ster (CFSE).
Este ster es incoloro e ingresa por difusin pasiva al interior de las clulas donde el
grupo acetato es clivado por esterasas intracelulares formndose un producto
altamente fluorescente que se conjuga a las protenas intracelulares. Esta tincin se
mantiene en el interior de las clulas y se reparte en las clulas hijas luego de la divisin
celular.
Alternativamente, se pueden usar mtodos no radioactivos que miden el
metabolismo celular como un indicador de la proliferacin. El [3-(4,5 dimetiltiazol-2-yl)2,5-difenil tetrazolium bromuro] (MTT) forma cristales azul oscuros cuando se exponen
a la actividad deshidrogenasa de clulas metablicamente activas. Estos cristales luego
se disuelven y el color de la solucin resultante se mide espectrofotomtricamente. Otra
tcnica incluye la deteccin fluorescente del ATP o del AMPc.

Citotoxicidad Celular dependiente de Anticuerpos (ADCC): es un mecanismo de

accin de los Acs a travs de los cules, clulas tumorales o infectadas por virus, son
marcadas para su destruccin por parte de clulas del sistema inmune, como pueden
ser las clulas Natural Killer (NK). Este tipo de mecanismo es deseable para aquellos Acs
teraputicos empleados en tratamientos oncolgicos.

Citotoxicidad Celular dependiente de Complemento (CDC): es un mecanismo de

accin de aquellos Acs fijadores de complemento. En este caso, los Acs especficos para
63

una determinada molcula blanco, al ponerse en contacto con las clulas que la
expresan y una fuente de complemento, inducirn la lisis celular.

Ensayos de deteccin de sustancias liberadas (Acs o citoquinas): es una evaluacin

de las clulas secretoras.

Bioensayos: son ensayos en los cules las concentraciones de molculas
biolgicamente activas son cuantificadas, en relacin relativa a un estndar de la misma
sustancia, por el efecto biolgico que ellas ejercen sobre clulas blanco aisladas, y
algunas veces, sobre tejidos u rganos.
Los bioensayos que evalan la actividad de las citoquinas se basan en los efectos
biolgicos que ellas inducen incluyendo: estimulacin o inhibicin de la proliferacin
celular, citotoxicidad/apoptosis, actividad antiviral, diferenciacin celular, capacidad de
inducir formacin de colonias, degranulacin celular, o induccin de la expresin de
otras citoquinas o componentes solubles (ya sea de forma intracelular, secretadas o de
superficie). Existen lneas celulares establecidas que dependen completamente de la
presencia de uno o ms factores para su sobrevida y proliferacin. Estas lneas celulares
requieren de la presencia de una/s citoquina/s para continuar su crecimiento, en
ausencia de ellas usualmente mueren por apoptosis.
Lneas celulares:
En ciertas ocasiones se trabaja con cultivos primarios, es decir clulas
disgregadas obtenidas a partir de tejidos u rganos recin extrados. En otras, es
necesario trabajar con lneas celulares establecidas. Las lneas celulares son originadas a
partir de cultivos primarios sometidos a procesos de transformacin de modo que le
confiere a las clulas capacidad ilimitada de multiplicacin. El trabajar con una lnea
celular implica que la poblacin celular se hace uniforme y homognea, conservndose
sus caractersticas durante sucesivas generaciones.
En la actualidad las vacunas para enfermedades como el polio, sarampin,
paperas, rubola y varicela se producen en cultivos de clulas de mamferos. Tambin se
emplean diversas lneas celulares para el control de actividad biolgica de diversos
inmunoterpicos.
64

CUESTIONARIO DE ORIENTACIN
1) Mencione: (a) un mtodo para el enriquecimiento de clulas mononucleares a
partir de sangre perifrica, (b) los marcadores de membrana especficos para LB
y LT, (c) Cmo realiza la identificacin de LTh, LTc y LB?, (d) Cmo podra
separar estas dos poblaciones celulares?
2) Qu entiende por pruebas funcionales linfocitarias? Indique las poblaciones
celulares involucradas.
3) En qu consisten las tcnicas de proliferacin celular? Cules son los antgenos
y/o mitgenos ms utilizados? Fundamente. Indique las poblaciones
involucradas.
4) Qu tipos de reacciones de hipersensibilidad conoce? En qu consisten las
pruebas de hipersensibilidad tarda? Interpretacin de los resultados obtenidos.
En qu casos las utilizara?
5) Qu entiende por bioensayos?

65

PROBLEMAS
1) Indique cul de los siguientes conceptos son verdaderos o falsos. Justifique su
respuesta.
a) La reaccin de hipersensibilidad retardada se caracteriza por la aparicin de
eritema a las 6 horas y es mediada fundamentalmente por LB.
b) El estado de anergia se determina por la hiporreactividad de un individuo a la
prueba de hipersensibilidad cutnea medida con PPD.
c) La deteccin de marcadores de superficie especficos de la poblacin LT es una
buena medida de la capacidad funcional de dichas clulas.
d) Para estudiar la capacidad proliferativa de los LT inducida por antgeno es
necesario purificar los LT a partir de sangre perifrica e incubar dichas clulas con el
antgeno en cuestin durante 5-7 das.
2) A un lote de ratones BALB/c se le administra oralmente glucocorticoides (ampliamente
usados como agentes antiinflamatorios e inmunosupresores) con el fin de
inmunosuprimirlos para favorecer una infeccin experimental. Indique los pasos a
seguir para verificar in vitro la inhibicin de la proliferacin linfocitaria y la inhibicin
de citoquinas pro-inflamatorias por parte de sus macrfagos peritoneales.
3) Se quiere evaluar la presencia de linfocitos especficos (B y T) para un antgeno X
luego de que un individuo fuera inmunizado con una vacuna que se encuentra en
fase de estudio. Mencione qu tcnica/s utilizara y que informacin le brinda.
4) Ud. inmuniz un lote de ratones de la cepa C3H con antgenos de excrecin-secrecin
de Fasciola hepatica y desea evaluar la respuesta obtenida en linfocitos Th. Para ello
realiza los siguientes protocolos:
a) LTh purificados de bazo de los ratones inmunizados cultivados in vitro por
triplicado durante 96 h con los antgenos de F. hepatica, y un control sin antgeno.
b) Macrfagos peritoneales de ratones BALB/c, cultivados por triplicado con los
antgenos (sin antgeno en el caso del control) por 8 h. Luego de dicho lapso se agregan
los LTh purificados de bazo de ratones inmunizados y se cultiva durante 40 h ms.
c)

Cultivo de esplenocitos (todas las clulas presentes en el bazo) de ratones

inmunizados y sin inmunizar, en presencia de antgenos por 72 h.

66

Luego agrega Timidina 3H, y a las 24 h se cosechan las clulas y se registra en contador
de centelleo, obteniendo en cada caso una seal en cpm que es proporcional a la
proliferacin observada.
Indique los resultados esperados para cada protocolo, y a qu se debe cada uno.
5) Cmo se procede para la obtencin de los linfocitos utilizados en el problema 5?
6) Analice este ejemplo de un protocolo de proliferacin inducida por IL-2 de la lnea
celular HT-2.
a) Cul sera el objetivo de este bioensayo?
b) Cul es la muestra biolgica a analizar en este caso? Qu controles sera
necesario realizar?
c) Interprete el grfico donde se muestran los resultados obtenidos para la M1 y
M2.
Materiales
* Lnea celular HT-2 (lnea de linfoblastos murinos dependientes para su crecimiento
de IL-2)
* RPMI 1640 suplementado con SFB 10%, antibiticos, 2 mM de L-glutamina, 5
mg/ml gentamicina, 50 M 2-Mercaptoetanol (2ME) y 100-200 UI/ml IL-2.
* Estndar de IL-2
* Muestras biolgicas a analizar: M1 y M2
* Placas de cultivo de 96 pocillos.
* Solucin de MTT (solucin madre 5 mg/ml en PBS).
* Solucin de lisis MTT (Etanol absoluto).
* Lector de placas de ELISA.
Procedimiento
1) Cultivar las clulas HT-2 en RPMI suplementado con IL-2.
2) Lavar las clulas 3 veces con RPMI para la eliminacin de la IL-2 y resuspenderlas
en RPMI suplementado SIN IL-2.
3) Agregar 100 l de la suspensin celular (3 x 105 cel/ml) a cada pocillo.
67

4) Preparar las diluciones de las muestras y estndar (curvas con 10 diluciones +

controles). Incubar las clulas con 100 l de las mismas por 24 h a 37C con
atmosfera de 5% CO2.
5) Descartar 170 l del medio y agregar 150 l de medio fresco y 20 l/pocillo de la
solucin de 5 mg/ml de MTT a la placa e incubar durante 3 h a 37C con
atmosfera de 5% CO2.
6) Descartar 170 ul del medio de cultivo de las clulas y agregar 100 l/pocillo de
etanol absoluto durante 10 min para disolver los cristales de formazan.

% proliferacin de clulas HT-2

7) Leer la placa a 540 nm y analizar los resultados de paralelismo mediante curvas

Std
M1
M2

Cantidad de IL-2 (ng/ml)

68

Trabajo Prctico N4
INMUNIDAD CELULAR
MONITOREO DEL GRADO DE INMUNOSUPRESIN
Objetivo: Evaluar ex vivo la inmunosupresin inducida por inoculacin de un nuevo lote
de metilacetato de prednisolona (MPA) a ratones BALB/c
Materiales
* Ratones BALB/c (6-8 semanas de vida)
* Metilacetato de prednisolona (lote a controlar, lote control).
* RPMI 1640 suplementado con SFB 10%, antibiticos, 2 mM de L-glutamina.
* Placas de 96 pocillos.
* Solucin de MTT (solucin madre 5 mg/ml en PBS).
* Solucin de lisis MTT (Etanol absoluto).
* Lector de placas de ELISA.
* Concanavalina A (ConA, 10 g/ml).
Procedimiento
1) Inocular a los ratones a razn de 0.6 mg MPA/g de ratn por va subcutnea. Un
grupo control ser inoculado con PBS.
2) Sacrificar a los animales 96 hs post-inoculacin para la extraccin del bazo.
3) Preparar las suspensiones celulares (4x106 cel/ml).
4) Plaquear 100 l suspensin celular/pocillo. Co-incubar con igual volumen de
RPMI o ConA.
5) Incubar durante 48 hs. Determinar la proliferacin celular mediante el mtodo
colorimtrico:
6) Descartar 170 l del medio y agregar 150 l de medio fresco y 20 l/pocillo de la
solucin de 5 mg/ml de MTT a la placa e incubar durante 3 h a 37C con
atmosfera de 5% CO2.
7) Descartar 170 ul del medio de cultivo de las clulas y agregar 100 l/pocillo de
etanol absoluto durante 10 min para disolver los cristales de formazan.
8) Leer la placa a 540 nm.
69

Actividades de Repaso PRIMERA PARTE

1- En un laboratorio de produccin de vacunas se intenta desarrollar una nueva vacuna
contra un microorganismo infeccioso. Para esto, se comienzan a desarrollar en paralelo
planes de inmunizacin en ratones. En uno de los planes se trabaja con un antgeno
proteico de 45 kDa, mientras que en el otro con el polisacrido purificado de la pared
celular de dicho microorganismo. Indique
a- Con cul de los planes, tericamente, se obtendr mejores resultados? Por qu?
b- Cules son las diferencias en la respuesta inmune montada si los Ags son administrados
por va subcutnea o por va oral?
c- Si por un grave error se est trabajando con lotes de ratones que estn preadas,
podran las cras obtener proteccin luego del plan de inmunizacin? Si/no. Justificar
d- Uno de los animales del lote inmunizado con el Ag proteico es no respondedor. Al
estudiarlo en mayor profundidad se evidencia que dicho animal es atmico. Indique cmo
pudo esto afectar la respuesta inmune del animal.
2- En los siguientes casos los individuos implicados sufren mayor probabilidad de sufrir
infecciones. Mencione, para cada uno de ellos, el porqu de esta susceptibilidad.
a- Quemaduras graves en amplia extensin del organismo.
b- Enfermedad granulomatosa crnica (alteracin gentica de la NADPH oxidasa).
c- Hipogamaglobulinemia primaria.
d- Hipocomplementemia por dficit de C3.
3- Polychaco comienza a desarrollar un kit de hemaglutinacin para la deteccin de
anticuerpos anti-Leishmania (parsito causante de la Leishmaniasis que presenta elevada
similitud estructural con el T. cruzi causante de la Enfermedad de Chagas. Ambas patologas
son endmicas en la zona norte de nuestro pas).
Cuando comienzan a realizar el control del kit encuentran que muchos sueros de individuos
no infectados con Leishmania arrojan reacciones positivas cuando todos los controles
funcionan bien.
a- Mencione cules son los controles realizados y la utilidad de cada uno de ellos.
b- Cul es la explicacin que encuentra a esos falsos positivos?
4- En un laboratorio farmacutico se quieren desarrollar kits diagnsticos que permitan
determinar:

70

a- Concentracin de 1antitripsina en suero.

b- Niveles de IgM anti-virus de la rubola en mujeres embarazadas.
Para cada uno de los tems, en qu tcnica Ud. se basara?
5- En un laboratorio farmacutico, el grupo de Investigacin y Desarrollo, produce un
anticuerpo monoclonal anti-protena X para comercializar. Luego del proceso de
purificacin se determina mediante la tcnica de ELISA que dicho Ac mantiene su actividad
biolgica, por esta razn deciden incorporarlo a un kit diagnstico como Ac de captura.
a- Mencione las diferencias que existen entre un AcMo y un suero especfico para esa
protena.
b- Un integrante del grupo considera que ese mismo Ac puede ser biotinilado para utilizarlo
en el mismo kit como Ac de deteccin. Considera que este criterio es adecuado?
c- Cuando el AcMo anti-X es utilizado para la deteccin de la protena en un WB (seguido
del SDS-PAGE), la reaccin da negativo. Qu piensa Ud. que pudo haber ocurrido

Actividades de Repaso SEGUNDA PARTE

6-Un laboratorio quiere comercializar un producto para el tratamiento antirrbico en casos
de emergencia. Para esto, se quiere producir un lote de aprox. 500 ampollas de 0.5 ml cada
una. Indicar de los tems citados cul seleccionaras para su obtencin y porqu.
Inmungeno: virus de la rabia inactivado virus de la rabia atenuado-protena viral
purificada.
Adyuvante: No utilizar - Completo e Incompleto de Freund Sal de aluminio.
Especie animal: ratas conejos caballos.
Va de inoculacin: subcutnea intraperitoneal intravenosa.
Esquema de Inmunizacin: 3 dosis separadas entre ellas por 15 das 3 dosis separadas
entre ellas por 3 meses 3 dosis en la misma semana.
Obtencin del preparado: sangra del animal, obtencin del plasma y pasteurizacin
sangra del animal, obtencin del suero sangra del animal, obtencin del suero,
precipitacin con sulfato de amonio (1/3), resuspensin del precipitado y posterior dilisis
frente a solucin fisiolgica.
Producto a comercializar: suero antirrbico gamaglobulina antirrbica.
7-Se desea desarrollar un anticuerpo monoclonal (AcMo) anti-IL-10 que ser utilizado como
captura en un kit de ELISA para determinar dicha citoquina.

71

a- Mencione cmo realiza el plan de inmunizacin (animales seleccionados, inmungeno,

va de inoculacin, etc.)
b- Mencione los pasos a realizar para obtener el AcMo:
o

Obtencin del hibridoma.

Identificacin del anticuerpo especfico.

Seleccin del anticuerpo que finalmente ser utilizado en el kit.

8-Se encuentran desarrollando una nueva vacuna para lograr proteccin contra una
bacteria X de vida intracelular cuyo principal factor de virulencia es la protena gp27 (27
KDa) fundamental para el mecanismo de infeccin.
a- Describir cules seran los posibles diseos de vacunas.
b- Una vez definida la vacuna se quiere estudiar en un modelo murino si es capaz de
generar respuesta inmune humoral y celular. Qu ensayos podran realizarse?
9-Uno de los fines del tratamiento con GM-CSF es la movilizacin de clulas stem-cell
(CD34+) de mdula sea a sangre perifrica. Cmo evaluara en un individuo tratado que
el tratamiento tuvo efecto y dichas clulas se encuentran en sangre?
10-Qu bioensayos realizara para evaluar la actividad biolgica de los siguientes
compuestos? Explique todos los pasos a llevar a cabo y controles necesarios.
Procesamiento de los resultados.
a- TGF, sabiendo que estimula la proliferacin de clulas Mulv1 (fibroblastos de pulmn)
b- IL-1, sabiendo que estimula la expresin de ICAM-1 (molcula de superficie) en las
clulas U-138MG (glioblastoma humano)
c- Rituximab, anticuerpo quimrico con especificidad para el CD20 presente en los LB,
utilizado para el tratamiento de leucemias y linfomas.
11-El Basiliximab es un anticuerpo monoclonal quimrico IgG1, compuesto por regiones
constantes humanas (70%) y regiones variables murinas (30%) con un peso molecular de
144 KDa.
Tiene especificidad por la cadena receptor de IL-2 (IL-2R o CD25): impide la unin de la
IL-2 a su receptor, de esta forma bloquea los efectos de la IL-2 sobre las clulas (linfocitos T
o LT). Debido a este mecanismo, la unin de Basiliximab al CD25 produce una disminucin
en la produccin de IL-2, con la consecuente deprivacin de esta citoquina y muerte de los
LT dependientes de ella.

72

La aplicacin fundamental del Basiliximab es la profilaxis del rechazo agudo en

transplantes de rin, junto con terapia inmunosupresora convencional. Se ha visto
tambin que Basiliximab ha sido eficaz en el tratamiento de enfermedades autoinmunes
mediadas por LT, como la esclersis mltiple.
En estudios clnicos de fase IV se detect una baja inmunogenicidad de la molcula, ya
que menos del 10% de los pacientes desarrollaron anticuerpos anti-Basiliximab.
a- Realice un esquema del AcMo indicando todas las regiones posibles indicando especies y
cadenas
b- Explique por qu el 10% de los pacientes tratados con Basiliximab desarrollan Acs antiBasiliximab. Qu nombre general reciben estos anticuerpos?
c- Disee el ensayo que fue utilizado en el estudio fase IV para detectar los Acs antiBasiliximab en los pacientes tratados. Detalle reactivos, esquema y controles
d- Cmo realizara el control de pureza de un lote de producto final ya envasado? Tcnica,
esquema de los posibles resultados
e- Disee el bioensayo de inhibicin por Basiliximab de la proliferacin de una lnea celular
sensible a IL-2 (HT-2 o CTLL-2). Detalle reactivos, esquema, pasos, controles y
procesamiento de los resultados (dibujando curvas sigmoideas).
f- Cmo hara para evaluar si el Basiliximab es capaz de desencadenar ADCC y/o CDC?
Detalle reactivos, esquema, pasos y controles.

73

TALLER SUEROS Y VACUNAS

El siguiente cuadro se completar luego de la finalizacin del taller
BCG

SABIN

SALK

HEPATITIS B

HEPATITIS A

CUADRUPLE

Suero anti
tetnico

Suero
antiofdico

AO
Ag UTILIZADO
ADYUVANTE
ENFERMEDADES
QUE PREVIENE
FORMA
FCEUTICA
VIA ADM.
N DOSIS
TIPO RTA
% PROTECCIN
TIEMPO
PROTECCIN
GRUPO ETARIO

74

SEMINARIO DE INMUNOTERAPICOS
El siguiente cuadro se completar durante la clase correspondiente
IL2

GM CSF

INTER. ALFA 2A 2B

BEVACIZUMAB

INFLIXIMAB

FUNCIN

DESCRIPCIN QCA.

OBTENCIN

SIST. DE EXPRESIN

PURIFICACIN
CONTROL DE
CALIDAD
APLICACIONES
CLNICAS

PRECIO DE MERCADO

75

76