MAYARA GELINSK

RICARDO ANDRADE
SILVANA A. ARMELIN RODRIGUES

PCR: REAO EM CADEIA DA POLIMERASE

E MINIPREPARAO DE DNA (MINIPREP)

Prof. Odair Jos Andrade Pais dos Santos

Biologia Molecular II

Londrina
2015

SUMRIO

CAPITULO I - PCR: REAO EM CADEIA DA POLIMERAS

1. INTRODUO

2. OBJETIVO

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR 7

3.2 MATATERIAL PARA ELETROFORESE EM GEL 7
3.4.2 TCNICA DA PCR 8
4. PREPARO PARA ELETROFORESE EM GEL
5. RESULTADOS E DISCUSSO
6. CONCLUSO

13

14

CAPITULO II - MINIPREPARAO DE DNA (MINIPREP) 4

1. INTRODUO

15

2. OBJETIVO

17

3. MATERIAL E MTODOS

18

3.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR 18

3.2 MTODOS

19

4. RESULTADO E DISCUSSO 24
5. CONCLUSO

25

6. BIBLIOGRAFIA 26

3
PCR: REAO EM CADEIA DA POLIMERAS
1 INTRODUO
A tcnica de amplificao de segmentos de DNA, a qual usa a reao em
cadeia da polimerase, conhecida como PCR, sigla do ingls Polymerase Chain
Reaction, tem trazido novas possibilidades nas mais variadas reas da Cincia
(ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).
Na reviso elaborada por Templeton (1992apud VERLENGIAet al., 2013)
sobre The polymerase Chain Reaction: History, MethodsandApplications,ele coloca a
tecnologia de PCR como um resultado de uma srie de descobertas significativas da
pesquisa cientfica na poca, a qual teve incio com a descoberta, por Arthur
Knorberg em 1955, da primeira DNA polimerase, sendo purificada pela primeira vez
em 1958.
Em 1985, o Dr Kary B. Mullis, tornou publica a moderna tecnologia da PCR
pela

primeira

vez,

no

Simpsio

de

Gentica

Humana

da

Sociedade

Americana,sendo esta desenvolvida para diagnsticos de anemia falciforme (SAIKI

et al., 1985 VERLENGIA et al., 2013).
As molculas de DNA ou cDNA podem ser amplificadas milhares ou milhes
de vezes, devido a simplicidade e rapidez do processo envolvido na tcnica da PCR
(ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).
De acordo com Verlengiaet al. (2013), so os iniciadores oligonucleotdeos ou
primers que comandam a replicao ou amplificao enzimtica in vitro das
sequncias de DNA (alvo) na PCR e geram dessa forma um nmero exponencial de
cpias das sequncias desejadas, quantidades da ordem de nanogramas de cidos
nucleicos.
Zaha, Ferreira e Passaglia (2014) detalham que a PCR consiste de ciclos
repetidos de desnaturao do DNA de fita dupla, hibridao dos iniciadores nos
alvos de fita simples e sntese da nova cadeia por uma DNA polimerase. O cido
nucleico de fita dupla convertido em fita simples com a desnaturao do DNA
quando exposto a temperaturas elevadas (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014), a
desnaturao do DNA-alvo demanda de 3 a 5 minutos em temperaturas entre 94C
e 95C previamente ao 1 ciclo e mantida nos demais ciclos por 30 a 60 s.

4
Temperatura e tempo de desnaturao so dependentes da extenso e
quantidade de G e C da sequncia-alvo (VERLENGIA et al., 2013).
O pareamento entre bases nitrogenadas dos iniciadores e sequncias
especficas do DNA-alvo promovem a hibridao dos iniciadores, quando em
temperaturas adequadas obtidas a partir das sequncias dos iniciadores. H
interao por complementariedade das bases entre iniciadores e sequncias-alvo
(VERLENGIA et al., 2013).
Uma DNA polimerase termoestvel promove a sntese da nova cadeia de
DNA unindo os desoxinucleotdeos trifosfatos na extremidade 3 OH livre no duplex
formado entre o DNA-alvo e o iniciador, sendo essa nova sequncia de nucleotdeos
complementar a sequncia-alvo (VERLENGIA et al., 2013)..
O tamanho, o nmero de cpias do DNA-alvo e a temperatura aplicada na
etapa de sntese dos produtos de PCR influem no tempo de extenso. A Taq DNA
polimerase atua em temperaturas de 20 C e 85 C. A temperatura de 72C a mais
empregada para a extenso dos iniciadores e a qual a Taq DNA polimerase tem seu
melhor desempenho. Na demanda de tempo de extenso muito longo, por conta de
produtos maiores do DNA-alvo, faz-se necessrio adicionar gelatina ou albumina
srica bovina soluo tampo da reao com o objetivo de ampliar a atividade e
estabilidade da Taq DNA polimerase (VERLENGIA et al., 2013).
De acordo com Verlengiaet al. (2013), as etapas de desnaturao,
hibridao e extenso da PCR requerem ciclos de temperaturas variveis e tais
temperaturas devem ser totalmente adequadas para que se possa manter a
estringnciarequerida para a hibridao dos iniciadores s sequncias-alvo e
garantir as condies timas para a desnaturao e a extenso do DNA de fita
dupla. A estringncia est relacionada com as condies da hibridao, pois so
elas que formam ou no as pontes de hidrognio essenciais para manter as fitas de
cidos nucleicosunidas. Os fatores temperatura, condies inicas e concentrao
de molculas que dificultam a formao de hbridos promovem o controle da
estringncia.
A alta estringncia mantm a hibridao de sondas com grande similaridade
sequncia apenas ea baixa estringncia, diminui a especificidade e aumenta a
probabilidade de pareamento inadequado de nucleotdeos. Zaha, Ferreira e
Passaglia (2014) explicam que a PCR demanda de aquecimento e resfriamento
rpido das amostras e isto possvel de ser realizado com um aparelho denominado

5
termociclador, o qual possibilita controlar e alternar temperaturas em perodos
programados de tempo de acordo com os ciclos de PCR desejados, como por
exemplo, aquecer uma amostra a 95C para desnaturar o DNA-alvo, reduzir a
temperatura para 45-65C para proporcionar o anelamento dos iniciadores, elevar
novamente a temperatura para 68 C 72 C para a extenso da cadeia da DNA
(polimerizao). So as etapas de desnaturao, anelamento e polimerizao,
repetidas vrias vezes (20 a 30 ciclos) que possibilitam a amplificao do DNAmolde
A PCR uma tcnica muito sensvel, a qual permite amplificar o DNA
mesmo a partir de uma amostragem muito pequena e por conta dessa importante
caracterstica tem sido possvel a sua aplicao em diferentes nveis de pesquisa,
tais como, testes de identificao gentica, medicina forense, diagnstico de
doenas infecciosas, controle de qualidade industrial, etc (ZAHA; FERREIRA;
PASSAGLIA, 2014).
De acordo com Zaha, Ferreira e Passaglia (2014), as molculas
biolgicas como DNA e RNA por exemplo, possuem carga eltrica negativa as quais
em contato com um campo eltrico migram na direo do polo oposto: positivo; a
migrao depende da forma e da razo carga/massa da molcula. A eletroforese
promovida em um gel de agarose, promove a migrao de molculas de DNA de
tamanhos e velocidades diferentes atravs da rede de poros do gel. As molculas
menores migram mais rapidamente sobre o gel e assim a eletroforese viabiliza a
separao das molculas de DNA de acordo com suas dimenses.
Para analisar os resultados da eletroforese em gel basta corar o DNA
presente no prprio gel, tornando-o visvel, onde a molcula de DNA se liga ao
corante e ao ser exposta luz UV resulta uma cor avermelhada fluorescente (ZAHA;
FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).
.
.

6
2 OBJETIVO
Realizar

tcnica

de

PCR,depolymerasechainreaction.

reao

em

cadeia

da

polimerase

7
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR
1L de DNA (no faz parte do MIX)
1,5 L de primer F (20 pmolL)
1,5 L de primer R (20 pmolL)
0,2 L de enzimaTaq DNA polimerase (5 U L) (no faz parte do MIX)
5L de tampo 10X Rnx Buffer (Invitrogen), especfico da enzima Taq DNA
polimerase
1L de desoxiribonucleotdeos (10mM)
1,2 L de cloreto de magnsio (50mM)
gua ultrapura estril para um volume final de 50 L
1,2 L Magnsio
TubosEppendorf ou tubos de microcentrfuga
Micropipetas automticas
Ponteiras descartveis para as micropipetas
Frascos para descarte
Termociclador

3.2 MATATERIAL PARA ELETROFORESE EM GEL

Forma para acondicionar o gel
Fita adesiva
Gel de agarose 1% em tampo TBE 1 x concentrado.
Microondas
Micropipeta automtica
Ponteiras descartveis para as micropipetas
Frascos para descarte
Bquer
Basto de vidro

8
3.3.1 MTODOS
3.4.2 TCNICA DA PCR
O MIX para a PCR foi preparado na quantidade suficiente para 9 amostras,
uma para cada aluno e uma amostra extra devido ao resduo que fica retido no
bquer e dessa forma no comprometer as quantidades necessrias na preparao
do MIX.
O MIX para a PCR foi preparado diretamente nos tubos Eppendorfs,
utilizando-se de micropipetas automticas,nas seguintes quantidades:
13,5 L dePrimer F
13,5 L de Primer R
45 L de Tampo
9 L de desoxiribonucleotdeos (DNTP)
10,8 L de Magnsio
347,4 L de gua
Cada aluno preparou o seu material de PCR. Foi preparado 48,8 L de Mix
no tubo eppendorf, o qual na sequncia recebeu 0,2 L de Taq DNA polimerase, com
o auxlio de uma micropipeta, de modo que a micropipeta a dispensasse
cuidadosamente em um dos lados da parede interna do eppendorf e 0,1 L de DNA
dispensado pela micropipeta no outro lado da parede do eppendorf.
A tcnica da PCR ocorre semelhana do processo natural celular de
replicao do DNA, logo a tcnica foi desenvolvida respeitando-se as etapas
naturais com o auxlio do termociclador, equipamento que permite o controle e a
alternncia das temperaturas requeridas em cada um dos trs passos do ciclo da
PCR.
Iniciou-se temperatura ambiente (laboratorial), de 20-25 C, seguida da
subida da temperatura para 90C,a qual uma fase importante de estabilizao do
material da amostra de DNA.
Passo 1 Para a desnaturao: aplicou-se a temperatura de 94 C por 5.
Na busca pela desnaturao das molculas indesejadas e pelo desnovelamento do
DNA, separando-se a cadeia dupla em dois filamentos de DNA, que normalmente
so unidos por ligaes de hidrognio e que por serem ligaes fracas se quebram

9
com a temperatura elevada, ao contrrio das ligaes entre as molculas de fosfato
e desoxirribose que se mantm unidas, por ligaes covalentes mais fortes.
Passo 2 Para a hibridao: nessa etapa aplicou-se a temperatura de 57 C
por 2:30 minutos, buscando-se

a ligao dos iniciadores (primers) ao DNA da

amostra.
Passo 3 Para a Extenso: aplicou-se a temperatura de 72 C por 2
minutos. Nessa etapa no pode haver variao da temperatura, para a polimerase.
Normalmente aps isso, d-se incio repetio dos ciclos, os quais
normalmente acontecem de 30 a 40 ciclos). Foram repetidos poucos ciclos neste
procedimento devido ao curto tempo da aula prtica.
4. PREPARO PARA ELETROFORESE EM GEL
A forma do gel foi preparada, tendo as suas extremidades fechadas com fita
adesiva, dando-lhe o aspecto de uma caixinha e foi mantida na superfcie nivelada
da bancada do laboratrio. O pente foi adaptado de maneira que no atingisse o
fundo da forma.
A agarose (polissacardeo) foi diluda com gua em bquer, com o auxlio de
um basto de vidro e levada ao forno microondas para solubilizar, sendo monitorada
pra que ela no fervesse.
O gel foi cuidadosamente despejado na forma, at atingir a espessura de 5
mm, ou seja at formar o Slot, na profundidade ideal (Figura 1)

10
Figura 1 Pente sobre a forma com gel

Fonte: os prprios autores, 2015

Esperou-se o tempo de gelificao da agarose, o qual ao gelificar adquiriu o

aspecto turvo (Figura 2), como era o esperado. Aps esse tempo, as fitas adesivas
das laterais da forma foram removidas e o pente foi tambm removido
cuidadosamente a fim de no danificar os slots, conforme a Figura 2.

11
Figura 2Forma com gel gelificado e com aspecto turvo,aps a retirada
dopente. possvel observar-se os poos de gel formados pelo pente, onde sero
depositadas as amostras de DNA

Fonte: os prprios autores, 2015

A amostra foi aplicada no gel com o auxlio de uma micropipeta automtica,

ajustando-se o seu volume e aspirando-se a amostra.
Usando-se as duas mos para ter-se a firmeza necessria, mergulhou-se a
ponta do tip (ponteira da micropipeta)bem acima da regio central do slot, sem
afundar o tip no fundo do slot e a amostra foi dispensada lenta e cuidadosamente
no slot, pequeno poo de gel.
A fim de aprimorar a tcnica, foi possvel praticar com as micropipetas,
coletando-se pequenas amostras sobre o papel na bancada com a micropipeta e
dispensando-se a amostra no fundo do slot (Figura 3).

12
Figura 3 Amostras sobre o papel e a forma com gel para prtica

Fonte: prprios autores, 2015

13
5 RESULTADOS E DISCUSSO

A tcnica da PCR foi realizada respeitando-se os trs passos de um ciclo

semelhante ao natural: desnaturao, hibridao e extenso. O procedimento teve
continuidade com o preparo e gelificao do gel utilizado em eletroforese, da mesa
que recebe o pente e o gel para a aplicao da amostra nos pequenos poos de gel.
Contudo no houve continuidade com a eletroforese e, portanto, no h resultados a
serem demonstrados e analisados.
Quando a eletroforese realizada, aps a aplicao da amostra de DNA nos
poos de gel aplica-se uma corrente eltrica sobre esse gel, porque tanto DNA como
RNA possuem carga eltrica negativa e quando colocadas num campo eltrico
tendem a migrar em velocidades diferentes e em direo do eletrodo oposto:
positivo. A eletroforese em gel possibilita a separao das molculas de DNA
conforme o seu tamanho. Molculas menores migram mais rapidamente no gel
(ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).
Segundo Zaha, Ferreira e Passaglia (2014), para analisar os resultados da
eletroforese em gel necessrio colocar o DNA em evidncia e uma forma simples
para resolver isso corando-se o DNA presente no gel.Quando uma quantidade
mnima suficiente de DNA se liga a um corante, como por exemplo, o brometo de
etdio

recebem

luz

ultravioleta,

ocorre

fluorescimento

em

cor

avermelhada.Contudo, o corante citado perigoso e mutagnico e a radiao UV

promove queimaduras, logo tem sido empregados corantes alternativos como o
sybrgreen que cora o DNA de verde ou azul e no necessariamente demanda da
luz UV para a visualizao dos resultados.

14
6 CONCLUSO
A PCR uma tcnica simples e extremamente rpida, pois permite
amplificarin vitro as partes de interesse de uma amostra de DNA. Estas amostras
podem representar quantidades muito pequenas de material gentico, podendo ser
amplificadas milhes de vezes e em poucas horas.

15
MINIPREPARAO DE DNA (MINIPREP)
1 INTRODUO
O termo "plasmdeo" originalmente foi introduzido pelo bilogo molecular
Joshua Lederberg. De modo geral, o plasmdeo bacteriano so molculas de DNA
circulares de fita dupla independentemente do DNA cromossmico. Neste sentido
cada plasmdeo contm uma seqncia de DNA portadores de genes plasmidial cujo
tamanho pode variar de 5 a 400 kilobases pares de bases. Estes elementos
genticos podem ser transferidos entre as mesmas espcies ou entre espcies
diferentes. (NASCIMENTO, A. C. A; ESPREAFICO, M. E, LARSON, P. L. M,
MONESI, N; ROSI, N. M. M; RODRIGUES V. 2003)
Nas pesquisas de engenharia gentica e biologia molecular a capacidade de
replicao independente e recombinao gnica dos plasmdeo so amplamente
estudadas. Funcionando como ferramentas biolgicas os vetores de genes de DNA
os quais ao ser inserido em outra seqncia gentica estes podem replicar conforme
as divises celulares possibilitando clonagem, crescimento para seqenciamento,
manipulao gnica do fragmento.
Em sntese, entre os mecanismos que viabilizam a remoo dos plasmdeo
para novo arranjamento, podemos destacar a minipreparao de plasmdeo
conhecido como (MINIPREP). A minipreparao consiste na amplificao e extrao
do DNA de interesse. Por esse modo, parte da cultura de bactrias transformadas
centrifugada e submetida a solues que permitem a exposio e o armazenamento
dos plasmdeos aps a lise bacteriana. (FIGUEIREDO, G. S. F, REIS, A.C. de M,
CASTRO, A.S, BORGES, N. C. R., 2003)
Na prtica laboratorial a tcnica da lise alcalina a mais freqente nas
montagens de DNA recombinante de plasmdeo. Conforme Soares (2011) o mtodo
de isolamento por lise alcalina baseia-se na diferena em desnaturao, em
condies alcalinas (pH ~12) entre o DNA plasmidial circular e o cromossomal de
alto peso molecular.
Alm destes, outros componentes celulares, tambm so separados, tais
como protenas, lipdeos, lquidos, polissacardeos, cidos nuclicos, molculas
orgnicas de baixo peso molecular tambm so separados.

16
Moreira (2003), explica que mtodo de extrao por lise inicia-se com a
suspenso das clulas, coletadas atravs de centrifugao, com a soluo I (Tris,
EDTA). O EDTA remove ons de Mg

2+

da superfcie celular, desorganizando a sua

estrutura e reduzindo a atividade das nucleases que podem degradar o plasmdeo.

Na segunda etapa, a soluo de tampo (ou soluo II) de lise contm hidrxido de
sdio (NaOH) elevando o pH amostra para (12 a 12,5), e o SDS, cujo a finalidade
desnaturar completamente DNA plasmdeo e o DNA genmico, em outras palavras ,
separar o DNA em cadeias simples.
De acordo com Schaefer (2006) ao incorporar soluo III, acetato de potssio
(ou acetato de sdio) com pH 5,5, a amostra neutralizado sob condies de alta
concentrao de sais, fazendo com que o DNA cromossomal precipite, enquanto
que o DNA plasmidial permanea em soluo. Por fim, a centrifugao final produz
um extrato claro com o DNA plasmidial em soluo.
Ao final para purificar a amostra, eliminando molculas indesejveis, pode-se
empregar na amostra um fenol-clorofrmio ou etanol tornando a mais viscosa. Em
seguida, o excesso do sobrenadante removido atravs do uso de um centrifuga e
posteriormente so submetidas secagem, posteriormente as amostras
ressuspendidas em gua Mili Q e seguem para desnaturao em temperatura
ambiente, ou estufa a 37 C. (FIGUEIREDO, G. S. F, REIS, A.C. de M, CASTRO,
A.S, BORGES, N. C. R., 2003)

17
2 OBJETIVO
Extrair DNA plasmidial bacteriano em pequena escala aplicando o mtodo
de lise celular alcalina.

18
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 MATERIALPARA A TCNICA PCR
Cultura bacteriana em meio LB
Tubos eppendorfs
Centrifuga
Micropipetas
Clorofrmio
NaOH 0,2M
SDS 1%
Tampo de lise ( 25Mm Tris-HCL Ph 8.0, 10Mm EDTA pH 8.0, glicose 50Mm)
Isopropanol
Etanol 70% gelado
Gelo
Folha de papel toalha (descartante)
Micropipetas.

3.2 MTODOS

19

Aps crescimento das bactrias por 16 horas, a 37 C, em meio LB contendo

antibitico (agente seletivo), sob vigorsa agitao de 250 rpm, foi realizado a
transferncia de 1,0mL da cultura bacteriana de aspecto turvo em tubos de
microcentrifuga do tipo eppendorf e centrifugado por 3 minutos a 14.000 rpm, a
temperatura ambiente. Nesta parte do processo as clulas bacterianas que estavam
em suspenso no meio lquido se precipitaram na parte inferior do tubo e
apresentado aspecto claro. Conforme figura 1, abaixo.
Figura -1: Precipitao de clulas bacterianas em suspenso no meio lquido

Fonte: prprios autores, 2015

No segundo momento, retirou-se o sobrenadante no hipoclorito 1% e
manteve-se o eppendorf invertido para a secagem do precipitado, tendo cuidado
para no remover o sedimento celular.
Na terceira etapa, com uso de uma micropipeta realizou-se a ressuspenso
das clulas em vrtice fazendo uso de 100 uL de tampo de lise (25mM Tris-HCL ph
8.0), 10mM EDTA Ph 8,0, glicose 50mM). As clulas

ressuspensas com essa

soluo tamponada de modo que as Rnase foram lisadas de todas as molculas em

nucleotdeos, mas o ADN no foi afetado.
Para lise celular bacteriana foi adicionado 200 uL de soluo alcalina recm
preparada (NaOH) 0,2M ; SDS 1%).
E homogeneizando levemente por inverso o tubo por 6 vezes com cuidado
para que o DNA liberado em pequenos fragmentos no contaminar a amostra.

20
Adicionado 150 uL de soluo III que foi preparado com 60.0 mL de 5M de acetato
de potssio, 11,5 mL de acido actico glacial e 28,5 ml de gua. Incubado no gelo
por 10 minutos. Ao fim, resultaram numa suspenso clara e viscosa, com
componentes moleculares no fundo, conforme figura 2, abaixo.
Figura-2: Suspenso clara e viscosa

Fonte: prprios autores, 2015

Ao utilizarmos o composto de, SDS 1% como um detergente inico ele
rompeu as membranas celulares e desestabilizou todas as interaes hidrofbicas
destas molculas. Ou seja, seria uma espcie de emuslficante lipdico. E o pH
elevado do

hidrxido de sdio (NaOH) de 0,2 M desnaturou tambm outras

macromolculas atacando os ons. Desta forma o aspecto claro da amostra porque

as clulas forma lisadas e a viscosidade aumentada pelo aumento da
concentrao de macromolculas na soluo lisadas.
E o baixo pH da soluo de acetato de potssio, neutralizou o NaOH
fazendo com que o pH da amostra retorna-se a ficar neutro. As molculas de DNA
cromossmico e as outras macromolculas formam um precipitado, porque eles se
ligam um ao outro formando uma massa desnaturada, mas os plasmdeos no
precipitam mas se renaturam e no se agrega como as outras molculas porque so
circulares superenrroaladas, conforme demonstra figura abaixo.

Figura-3: DNA plasmdico.

21

Fonte: prprios autores, 2015.

Portanto, DNA do plasmdeo permanece em soluo enquanto que as
protenas e outras molculas de DNA precipitam.
Aps esse resultado, o sobrenadante de aspecto lmpido foi transferido para
um novo tubo eppendorf previamente rotulado e descartado o pellet no hipoclorito a
1%. Adicionou-se volume de clorofrmio 1:1, na capela aproximadamente 450 ul
utilizando para precipitar os cidos nuclicos, e depois foi misturado com auxilio do
vrtex e centrifugado por 3 minutos a 14.000 rpm, conforme imagem abaixo.
Figura-4: Centrifugao da suspenso com clorofrmio.

Fonte: prprios autores, 2015.

Novamente transferido a fase aquosa para um novo tubo eppendorf foi
adicionado 0,7 mL de isopropanol para precipitar o DNA cromossmico, pois as
molculas de DNA tm carga negativa devido aos fosfatos sendo altamente solveis
em gua, mas no solvel em solventes orgnicos.
Realizado esta etapa, a amostra foi incubado no gelo por 10 minutos e
posteriormente centrifugado por 15 minutos a 14.000
rpm.
Figura-5:

Amostra incubada em gelo.

22

Fonte: prprios autores, 2015

Posteriormente aplicou-se o etanol a 70% gelado invertendo a mistura,
realizando a lavagem para acelerar o processo. Ao final, a amostra foi invertida
sobre o descarte (folha de papel toalha), conforme demonstrado abaixo, figura 6
etanol a 70%.
Figura-6: Etanol a 70%

Fonte: prprios autores

Descartado o sobrenadante o sedimento ficou visvel neste ponto, observe a
figura 7, abaixo.
Figura-7: Sobrenadante de isopropanol invertido sobre o descarte.

Fonte: prprios autores, 2015.

Posteriormente o sobrenadante formado com uso do etanol foi removido
invertendo o tubo do eppendorf sobre o descarte (folha de papel toalha) e o restante

23
retirado com auxilio de uma micropipeta permanecendo o pellet deixando o secar
por 5 minutos.
Depois de o etanol ter sido evaporado foi aplicado ao precipitado 50 uL de
gua Milli Q para ressuspender e ao final o sobrenadante foi removido com auxlio
de micropipeta.

4 RESULTADO E DISCUSSO

24
O tampo de lise celular tradicionalmente composto por um detergente
SDS, associado a um coquetel de inibidores. Quando aplicado o componente de
hidrxido de sdio (NaOH) na amostra ocorre a desnaturao protenas, enzimas,
incluindo DNA cromossmico e plasmidico, de modo que o pH tem de ser
rapidamente reduzido no passo seguinte mas o DNA cromossmico sofre espcie de
cozimento levando mais tempo para resnaturar do que o DNA plasmidico. Portanto o
DNA cromossmico sendo maior, de peso molecular maior, clivado mais rpido.
(OLIVEIRA, 2008)
E quando aplicado o SDS 1% ele rompeu as ligaes hidrofbicas (lipdicas).
No final para preservar o ph da amostra, neutralizando o alto pH do hidrxido de
sdio (NaOH) o acetato de potssio equilibra os grupos ionizantes. Ou seja, a lise
alcalina faz por diferena de desnaturao por pH, isto torna possvel isolar o DNA
cromossmico do DNA plasmidico.

5 CONCLUSO

25

Realizando uma comparao visual, podemos observar que o DNA

cromossmico e maior que o DNA plasmidico. Tal como para o DNA genmico, a
extrao de DNA plasmidico envolve a lise celular e purificao do plasmdeo. As
molculas supernrrolados e extremamente pequenas, j o DNA cromossmico,
maior e menos superenrrolado. Alm disso, a extrao do DNA plasmidico pode
ser completado com uso da amplificao pelo PCR.

BIBLIOGRAFIA

26

Labuto, L. B. D.; Lopes, J. M. P.; Sousa, Z. A. R.; Andrade, V. N.; Borges.N. C. R.

Protocolos otimizados para arranjamentos de clones e minipreparao de
DNA. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2003. 4 p. Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia. Circular Tcnica, 22. Disponvel em:
http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/188650/1/tales2003.pdf
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Rodrigues, V. Tecnologia do DNA recombinante. Universidade de So Paulo.
Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, p13. 2003, Disponvel em:
http://webcache.googleusercontent.com/search?
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Schaefer, R. Tcnicas em biologia molecular. Embrapa Sunos e Aves, 2006.1922p. 2006. Disponvel em:
http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/58217/1/doc116.pdf
Moreira, K. A. Produo e purificao de DNA plasmidial a partir de Escherichia
coli recombinante. f.8, 2005. Universidade Federal de Pernambuco- Tese
apresentada ao Curso de Doutorado em Cincias Biolgicas. Disponvel em:
http://webcache.googleusercontent.com/search?
q=cache:ijluao8nlJoJ:www.liber.ufpe.br/teses/arquivo/20040824143214.pdf+&cd=9&
hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br
Figueiredo, G. S. F, Reis, A.C. de M, Castro, A.S, Borges, N. C. R. Purificao e
seqenciamento de DNA protocolos otimizados. p 51. VIII ENCONTRO DO
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