TCNICAS DE ESTUDIOS CROMOSMICOS

Los cromosomas son las estructuras en las que se organiza la cromatina

nuclear y que tienen una expresin dinmica en las distintas fases del
ciclo celular. En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de
compactacin que alcanza su mximo nivel en la metafase. Los
cromosomas se tien fcilmente cuando estn condensados y pueden
ser individualizados con el microscopio ptico. Cada cromosoma
contiene una molcula de ADN lineal asociado a distintas protenas y el
contenido de genes es variable aunque est en relacin con su tamao.
Por eso, cualquier alteracin en el nmero o la estructura de los
cromosomas puede ser causa de enfermedades. Para la deteccin de
estas alteraciones se desarrollaron numerosas tcnicas y todas ellas
requieren de un observador entrenado que las interprete. La
citogentica es la rama de la biologa que se encarga del estudio de los
cromosomas y sus anomalas. Los humanos tenemos un nmero total de
46 cromosomas y este nmero vara segn las especies. Los 46
cromosomas estn constituidos por 23 pares de homlogos y cada
miembro del par proviene de un progenitor.
El cariotipo es la constitucin cromosmica de un individuo y es un
estudio de rutina en gentica mdica. Los cariotipos se pueden informar
presentando todos los pares cromosmicos ordenados de acuerdo a su
tamao, que en un principio eran recortados de la fotografa de una
metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores automticos. De los
23 pares, el par de cromosomas sexuales se seala por separado para
indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un individuo se
indica primero el nmero total de cromosomas y seguidamente los
componentes del par sexual precedido de una coma. As, el cariotipo
normal de un varn se escribe 46,XY y el de una mujer 46,XX. Las
anomalas cromosmicas son una causa ms importante de abortos
espontneos, retardo mental y malformaciones.
Las principales tcnicas son:
A.
B.
C.
D.

El bandeo cromosmico
FISH
CMA
HGC

A. EL BANDEO CROMOSMICO

Con la tcnica convencional de tincin con Giemsa los cromosomas se

tien intensamente y en forma homognea y se los puede contar y
agrupar por su aspecto general y eso era lo nico que se poda hacer en
los primeros cariotipos. La identificacin de cada cromosoma vino
posteriormente con las tcnicas de bandeo. Estas tcnicas que generan
bandas transversales permiten definir a cada cromosoma y estudiar su
estructura. Cada cromosoma tiene del patrn de bandas caracterstico y
existen varias 3 tcnicas de tincin con fines especficos. El bandeo G es
el ms utilizado en citogentica clnica. El bandeo G se logra con un
tratamiento controlado con tripsina antes de la coloracin con Giemsa y
produce bandas claras y oscuras en los cromosomas. Las bandas
oscuras contienen ADN rico en bases A-T que replica tardamente y son
pobres en genes constitutivos y las bandas claras contienen ADN rico en
G-C que replica tempranamente y tienen muchos genes constitutivos
Cuando un cromosoma est ms elongado puede mostrar un mayor
nmero de bandas y esto se aprovecha para estudiarlo con mayores
detalles. Esta metodologa que permite buscar alteraciones estructurales
mnimas se conoce como bandeo de alta resolucin y se logra
sincronizando el cultivo y con preparaciones hechas en profase o
prometafase, es decir, antes que los cromosomas alcancen su
compactacin mxima. Los cromosomas en la mitad de la metafase
muestran un nivel de resolucin de 400 bandas mientras que los de alta
resolucin alcanzan niveles de resolucin de 550 y hasta de 850 bandas.
Las tcnicas de bandeo ms usadas:
G

R
Q

Tincin con Giemsa previo tratamiento controlado con

tripsina que degrada las protenas y produce bandas claras
y oscuras. A las oscuras se las llama G+.
Tincin con Giemsa previo tratamiento con calor. El bandeo
R es el reverso del bandeo G.
Tincin con mostaza de quinacrina o acridina. Se examina
con microscopio de luz fluorescente y se ven bandas
brillantes en distintas intensidades. Las bandas ms
brillantes se corresponden con las G+.
Tincin con Giemsa o fluorocromos (actinomicina D o
cromomicina) y tratamiento previo con calor o lcalis.
Muestra las regiones cromosmicas que contienen
heterocromatina que son las centromricas de todos los
cromosomas y las secciones en 1q, 9q, 16q y distal de Yq.

B. FISH (HIBRIDACIN FLUORESCENTE IN SITU).

La hibridacin fluorescente in situ es una tcnica de laboratorio que

determina cuntas copias de un segmento especfico de ADN existen en
una clula. Tambin se utiliza para identificar cromosomas con
estructuras anmalas. En el laboratorio, se modifica qumicamente un
segmento de ADN y se lo marca de manera que pueda ser visto
fluorescente (muy brillante) utilizando un microscopio especial. Este ADN
se conoce como "sonda". Cuando se las coloca en las clulas bajo ciertas
condiciones, las sondas pueden detectar segmentos homlogos de ADN.

Por ejemplo, si se sospecha que un beb padece del sndrome de Down

de trisoma 21 y se realiza una amniocentesis durante la gestacin, las
clulas detectadas en el lquido amnitico pueden estudiarse a travs de
una hibridacin fluorescente in situ. Una sonda hecha para el
cromosoma 21 puede determinar la cantidad de copias del cromosoma
21 que el beb posee. Con un microscopio especial, se vera que las
clulas del beb con trisoma 21 contienen tres "marcas" o tres reas
brillantes, en donde la sonda detect los tres cromosomas #21. El
estudio de hibridacin fluorescente in situ no reemplaza un estudio
cromosmico estndar, sino que lo complementa segn el defecto
congnito del que se trate.

La hibridacin fluorescente in situ se puede utilizar para detectar

anomalas
cromosmicas
estructurales
(como
las
deleciones
submicroscpicas) que se encuentran ms all de la resolucin de los
estudios
cromosmicos
de
bandeo
extendido.
"Telmero" es un trmino que se utiliza para describir los extremos de
los cromosomas. Cuando se utiliza la hibridacin fluorescente in situ
especficamente para buscar anomalas cromosmicas en esta zona, se
la denomina examen subtelomrico FISH.

C. CMA (ANLISIS DE MICROARREGLO CROMOSMICO).

El CMA es un nuevo anlisis que se utiliza para detectar desequilibrios

cromosmicos a una resolucin mayor que las tcnicas cromosmicas
estndar actuales o las tcnicas FISH.

Una muestra del ADN del individuo a examinar y una muestra de ADN
para control se disponen en un orden (arreglo) particular sobre un
portaobjetos de vidrio. A las muestras de ADN se aade colorante
fluorescentes. Luego se colocan los portaobjetos en un lector especial
que mide el brillo de cada rea fluorescente.

Este proceso busca identificar un cambio en el nmero de copias de

ADN. Los cambios en los nmeros de copias de ADN pueden representar
cambios observados en la poblacin general, los cuales no causan
enfermedades genticas. Sin embargo, algunos cambios en los nmeros
de copias pueden indicar una anomala cromosmica, como un
desequilibrio cromosmico, prdida o ganancia. Los tipos de anomalas
cromosmicas pueden incluir pequeas reordenaciones cromosmicas,
pequeas duplicaciones de material cromosmico (trisomia), o pequeas
supresiones de material cromosmico (monosomia).

Entre los tipos de microarreglos tenemos:

a) Microarreglos que detectan ganancias y prdidas de genes:
Ciertas prdidas o ganancias cromosmicas estn relacionadas con la
progresin del cncer y los patrones de estos cambios son importantes
para establecer un pronstico clnico. Con el uso de microarreglos y el
anlisis de sus resultados se podra predecir cules regiones
cromosmicas
contienen
genes
que
inician
y
mantienen procesos tumorales. Los resultados pueden ser visualizados

en diagramas jerrquicos
progresin del tumor".

referidos

como

" modelos en

rbol

de

La tcnica de Microarreglos de Hibridizacin Genmica Comparativa

permite visualizar ganancias y prdidas o cambios en el nmero de
copias de un gen particular involucrado en determinada patologa. En
este tipo de microarreglos se usan grandes porciones de ADN genmico
que sirven como ADN inmovililizado en el plato y cada punto o spot de
ese ADN representa una regin cromosmica conocida. La mezcla a
hibridizar contendr ADN genmico marcado, proveniente de tejido
enfermo y tejido sano. Si el nmero de copias del gen de inters estn
aumentadas, una gran cantidad de ADN de la muestra se hibridizar en
los puntos o spots del microarreglo que representan el gen involucrado,
mientras que al utilizar muestra proveniente de tejido sano slo un
pequeo nmero se hibridizar en el mismo punto. Dicha diferencia en
la cantidad de material hibridizado podr reflejarse en fluorescencias
dismiles
y
as
ser
detectado
por
el escner y
por
los programas de lectura.
b) Microarreglos que detectan mutaciones en el ADN
Cuando se utilizan los microarreglos para detectar mutaciones o
polimorfismos en una secuencia gnica, el ADN inmovilizado suele ser
un nico gen; el material colocado en otros pozos puede diferir
solamente en uno o en unos cuantos nucletidos. Un tipo de secuencia
que suele utilizarse para este tipo de anlisis son los Single Nucleotide
Polymorphism (SNP) o Polimorfismo de nucletido nico, pequea
variacin genticaque puede ocurrir dentro del ADN de un individuo. En
este tipo de experimento se necesita ADN genmico derivado de una
muestra normal para ser usado en la mezcla de hibridizacin. Una vez
que los investigadores han establecido que un SNP se relaciona con una
enfermedad de inters, pueden usar la tecnologa para detectar quines
tienen o son susceptibles de tener la enfermedad. Cuando el ADN
genmico de un individuo se hibridiza con un arreglo cargado de varios
SNPs, el ADN muestra (target) se hibridizar con mayor frecuencia con
los SNPs asociados al individuo a estudio. Estos puntos del microarreglo
tendrn mayor fluorescencia y se demostrar que dicha persona es
susceptible o tiene determinada enfermedad.

D.

HGC (HIBRIDACIN GENMICA COMPARADA)

En la HGC se produce la hibridacin de ADN tumoral y ADN normal

frente a cromosomas normales. Esta tcnica presenta la ventaja de no
necesitar material en fresco, ya que el ADN se puede obtener de tejido
en parafina. Con ella se pueden conocer alteraciones numricas
(prdidas o ganancias de material genmico), pero no la presencia de
translocaciones recprocas. Su aplicacin al estudio de los tumores ha
puesto de manifiesto que en la mayora de las neoplasias hay
alteraciones genticas.
Fundamento de la hibridacin genmica comparada:
La HGC consiste en la hibridacin competitiva entre ADN tumoral (test) y
ADN normal (referencia) sobre metafases normales en presencia de un
exceso de ADN Cot-1 humano. Previamente, el ADN tumoral y el ADN
normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes (por ejemplo,
el ADN tumoral con un fluorocromo verde y el ADN normal con uno rojo)
lo que permitir su posterior identificacin mediante un microscopio de
fluorescencia. El anlisis digital de las metafases capturadas cuantifica
la proporcin de verde y de rojo en todos los cromosomas de manera
que si existe una ganancia de material gentico en una determinada
regin cromosmica se producir un aumento de la fluorescencia verde
a ese nivel, mientras que si hay una prdida de material gentico se
producir una disminucin de la fluorescencia verde y por tanto un
aumento relativo de la fluorescencia roja. El cariotipo posterior se realiza
sobre la base de la tincin con DAPI de los cromosomas.
La HGC ha sido la primera tcnica combinada de citogentica e
hibridacin in situ fluorescente que ha permitido realizar un anlisis
global del genoma. Puesto que las alteraciones en el nmero de copias
de ADN de determinadas regiones tienen una gran importancia en la
patogenia del cncer, la HGC ha despertado gran inters en el estudio
de las neoplasias. La HGC ha sido utilizada de forma ms amplia en el
estudio de los tumores slidos que de las neoplasias hematolgicas,
entre otras razones por la dificultad que entraa obtener mitosis en los
tumores slidos, y porque los reordenamientos no recprocos y las
amplificaciones gnicas se producen con ms frecuencia en ellos que en
las neoplasias hematolgicas. No obstante, puesto que la HGC no
requiere metafases de las clulas tumorales y no est afectada por
la seleccin clonal inherente a los cultivos celulares, se ha utilizado en
hemopatas malignas. Las neoplasias linfoides B representan
el grupo ms estudiado y ms concretamente los linfomas no Hodgkin
(LNH) en los que se ha demostrado que las amplificaciones constituyen
una alteracin ms frecuente de lo que se supona, y que se asocian
generalmente a linfomas agresivos. Otra aportacin importante de la
HGC al conocimiento de la patogenia de los linfomas ha sido la
demostracin de que la amplificacin es otro mecanismo que causa

sobreexpresin de la protena bcl-2, aadido al ya conocido mecanismo

de translocacin.