UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE NUTRICIN Y DIETTICA

Laboratorio: Actividad Enzimtica.

Invertasa de levadura
Introduccin
Las enzimas catalizan las reacciones disminuyendo la energa libre de activacin
necesaria para que las mismas ocurran. La molcula sobre la cual la enzima acta se
denomina sustrato, esta molcula se transforma obtenindose el producto. La molcula de
enzima no se modifica al trmino de la reaccin y puede continuar catalizando la misma
repetidas veces.
La conformacin de una enzima es mantenida por las interacciones que se establecen
entre las regiones especficas de los aminocidos que componen la cadena polipeptdica.
Debido a ello la misma es susceptible ante cambios en el ambiente en el cual se encuentra,
siendo dos de los factores ms importantes la temperatura y el pH. Cuando estos varan de
forma tal que la conformacin de la protena es alterada, la enzima pierde su actividad. Esto
provoca que cada enzima tenga sus condiciones ptimas de funcionamiento tanto de pH
como temperatura.
Invertasa de levadura
La sacarosa, comnmente conocida como azcar de mesa, es un disacrido
compuesto por -D-glucosa y -D-fructosa unidos mediante enlace glicosdico -1,2. Cuando
este enlace es roto en la reaccin de hidrlisis, se genera una mezcla equimolar de glucosa y
fructosa.
La sacarosa puede ser hidrolizada en presencia de una enzima comnmente
denominada invertasa o sacarasa (Figura 1):

Figura 1. Estructuras qumicas generadas por

la hidrlisis de sacarosa, catalizada por la
enzima invertasa (o sacarasa).

La denominacin sistemtica de la invertasa es -fructofuranosidasa, (-Dfructofuranosidasa, -D-fructofuransido fructohidrolasa), debido a que la reaccin catalizada
por esta enzima es la hidrlisis del residuo terminal -fructofuransico. Existe otra enzima, la
-D-glucosidasa, que tambin cataliza esta reaccin, escindiendo la unidad terminal de la
glucosa. La sacarosa tambin puede ser hidrolizada de manera no enzimtica en medio
cido.
La invertasa es una enzima muy utilizada en la industria alimenticia ya que debido a su sabor
ms dulce y a que no cristaliza tan fcilmente, se prefiere a la fructosa sobre la sacarosa. Un
amplio rango de microorganismos sintetizan invertasa pudiendo, por lo tanto, emplear la
sacarosa como nutriente. A escala comercial es biosintetizada por las cepas de levadura
Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carsbergensis. El estudio de la actividad
invertasa presenta un gran inters tanto desde un punto de vista acadmico como de
investigacin aplicada, siendo uno de las enzimas ms conocidas. A modo de ejemplo
podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cintica se estudi en profundidad
(estudios clsicos de Michaelis-Menten) y que fue utilizado industrialmente.
A diferencia de otras enzimas, la invertasa presenta actividad relativamente elevada en
un rango amplio de pH (desde 3,5 a 5,5) con el ptimo en pH= 4,5. En cuanto a la
temperatura, el mximo de actividad se registra alrededor de los 55C. El valor de la
constante de Michaelis-Menten vara segn las diferentes isoformas entre 2 mM y 5 mM.
La actividad de la invertasa es inhibida en presencia de metales pesados, por ejemplo
1+

los iones Ag atacan a la histidina de la cadena peptdica inactivndola. El sulfato de cobre

en concentraciones elevadas tambin presenta un efecto inhibidor.
Objetivo:
En el presente trabajo prctico se realizar la extraccin de la invertasa de levadura y,
posteriormente, se verificar su accin sobre una solucin de sacarosa. La misma se
comprobar mediante el test de Fehling, el cual permite detectar la presencia de los
productos de la hidrlisis de este disacrido (glucosa y fructosa).

Protocolo de trabajo:
A- Obtencin de la enzima
Colocar 7,5 g de levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) en un mortero y
homogeneizar en 15 ml de bicarbonato de sodio 0,1M (buffer de extraccin). Mezclar
e incubar a temperatura ambiente durante 20' agitando peridicamente.
Filtrar cuidadosamente y recuperar el filtrado, el cual contiene la enzima, y ser el
extracto enzimtico (EE) a utilizar. Tomar una alcuota de 2 ml del EE y hervirla a
calentando directamente al mechero, este ser el extracto enzimtico hervido (EEH)
B- Proceso enzimtico
Realizar una batera de tubos de ensayo siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla:

Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
0
1
1
2

Vsacarosa
Vsucralosa VAlmidn
VCuSO4
VNaOH
VEE
0,02 M (mL) 0,5% (mL) 1% (mL) 0,5% (mL) 0,25%(mL) (mL)
2
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0,5
2
0
0
0
0
1
2
0
0
0
0
0
2
0
0
0,25
0
1
2
0
0
1
0
1
2
0
0
0
0,25
1
2
0
0
0
1
1
0
2
0
0
0
0
0
2
0
0
0
1
0
0
2
0
0
0
0
0
2
0
0
1

VEEH
(mL)
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0

Dejar reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

C- Deteccin de los productos de la catlisis
Agregar a cada tubo 1 ml del reactivo A de Fehling y 1 ml del reactivo B de Fehling.
Calentar los tubos directamente al mechero por aproximadamente 1 min, retirarlos y dejarlos
enfriar en la gradilla y observar los resultados.

D- Resultados
Los productos de la hidrlisis de la sacarosa -fructosa y glucosa- dan resultado
positivo para el test de Fehling, lo cual es indicado por la aparicin de un precipitado rojo
ladrillo.
Compare los resultados obtenidos en los distintos tubos -aparicin o no del
precipitado y cantidad del mismo- y trate de explicarlos en base a los reactivos agregados en
cada uno.
Inicio de la reaccin

si da positivo:

ejemplos (dos positivos y uno

negativo)

Actividades complementarias
1- Qu es el reactivo de Fehling y que es lo que reconoce?
2- Por qu la reaccin de Fehling es negativa con sacarosa y positiva con los productos
de la hidrolisis por invertasa?
3- En el protocolo experimental realizado, cul es el rol del NaOH agregado a algunos de
los tubos?
a. Es el sustrato sobre el que acta la enzima.
b. Acelera la reaccin entre la enzima y el sustrato.
c. Desnaturaliza la enzima por alterar su sitio activo.
d. Bloquea el sitio activo de la enzima.
4- Cul es el objeto de realizar el primer tubo de la serie -el cual contiene slo sacarosa?
5- Cul es la estructura de la sucralosa y que esperabas que ocurra con la invertasa?