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CROMATOGRAFA
I.
II.
Definicin
MTODO FISICOQUMICO DE SEPARACIN, EN
EL CUAL LOS COMPONENTES QUE SE VAN A
SEPARAR SE DISTRIBUYEN ENTRE DOS FASES;
UNA DE ESTAS FASES CONSTITUYE UNA CAPA
ESTACIONARIA DE GRAN REA SUPERFICIAL,
LA OTRA ES UN FLUIDO QUE ELUYE A TRAVS O
A LO LARGO DE LA FASE ESTACIONARIA.
CROMATOGRAFA
FASE MOVIL
FASE ESTACIONARIA
ELUCIN: Proceso de transporte de
una especie a travs de la fase
estacionaria por la adicin continua
de nueva fase mvil
PROCESO DE ELUCIN
Fase mvil
(eluyente)
Mezcla de protenas
a separar
Fase
Estacionaria
Soporte
poroso
Eludo o
eluato
Protenas
CLASIFICACIN
I.
CLASIFICACIN
F. mvil F. estacionaria
lquido lquido
Distribucin (reparto)
lquido slido
Adsorcin
Intercambio inico
Exclusin molecular
Afinidad
C. DE LQUIDOS
gas lquido
Distribucin (reparto)
Afinidad
gas slido
Adsorcin
C. DE GASES
Fase mvil
(eluyente)
Mezcla de protenas
a separar
Fase
Estacionaria
Soporte
poroso
eludo
Protenas
Fase mvil
bomba
peristltica
Fase mvil
reservorio de
la fase mvil
pistn ajustable
Columna de vidrio
Empaque de
la columna
Disco de Nylon
pistn ajustable
lana de vidrio
Equipo bsico
para
cromatografa en
columna
CROMATOGRAMA
Seal de detector
Adicin de la
muestra
Lnea
base
T i e m p o o volumen
Teora de la cromatografa
El xito de la separacin cromatogrfica de los componentes de una
mezcla, depende de la apropiada seleccin del tipo de cromatografa y de
la OPTIMIZACIN de las condiciones experimentales asociadas a la
separacin.
La efectividad de una columna cromatogrfica para separar dos analitos,
depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos
especies. Las velocidades estn determinadas por la magnitud de las
constantes de los equilibrios de distribucin de las especies entre las fases
estacionaria y mvil.
CROMATOGRAMA
Que informacin se obtiene del
cromatograma?
Adicin de la
muestra
Seal de detector
Lnea base
Pico
Anchura del pico
Tiempo de retencin (tR), (volumen
de elucin (Ve) )
Tiempo muerto (tM), (volumen
vaco (Vo) )
Lnea base
T i e m p o o volumen
FACTOR DE CAPACIDAD
Uno de los parmetros importantes en cromatografa es el FACTOR DE
CAPACIDAD O FACTOR DE RETENCIN, k , que es el tiempo adicional que
el analito toma para eluir de la columna, en relacin a un analito no
retenido o excluido, que no interacciona con la fase estacionaria y por
definicin, tiene un valor k de cero. Se utiliza para describir las
velocidades de migracin de los solutos en las columnas (a mayor valor de
k menor ser la velocidad de migracin del soluto).
FACTOR DE CAPACIDAD
El factor de capacidad para un analito, se incrementar cuando:
coeficiente de distribucin entre las dos fases se incremente
Volumen del analito en la fase estacionaria se incremente
FACTOR DE SELECTIVIDAD
Otro parmetro importante es el factor de selectividad o factor de
separacin, que calcula las velocidades de migracin relativas para dos
analitos.
El factor de selectividad de una columna para 2 analitos se define como:
Donde:
KdA es el coeficiente de distribucin para el analito ms fuertemente retenido.
KdB es el coeficiente de distribucin para el analito menos retenido o que eluye
con ms rapidez.
EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Se utilizan dos trminos para describir cuantitativamente la
eficiencia de una columna cromatogrfica:
2. El nmero de platos, N
N = L/ H
EFICACIA DE LA COLUMNA
Plato terico: zona de la columna donde hay espacio suficiente para
que un analito se equilibre completamente entre las dos fases.
Altura del plato terico: Longitud de la columna que contiene un
plato terico.
En general, se asume que las bandas cromatogrficas tienen una
forma gaussiana y la altura del plato se relaciona con el ancho del
pico del analito y la distancia que recorre el analito en la columna, L:
donde: 2 es la varianza
L
Introduccin de la
muestra
Donde: L es la longitud de la
columna
Introduccin de la
muestra
Si L y W se miden en unidades de
tiempo, en lugar de unidades de
longitud, entonces:
Seal de detector
Adicin de la
muestra
Lnea base
T i e m p o o volumen
RELACIN ENTRE EL NMERO DE PLATOS TERICOS Y LA FORMA DEL PICO DEL ANALITO
Resulta de la transferencia
de masa hacia y desde la FE
Se origina de la limitacin en
la velocidad de transferencia
de masa en la FM
RESOLUCIN CROMATOGRFICA
Es una medida cuantitativa de la capacidad de la columna
para separar dos analitos.
RESOLUCIN CROMATOGRFICA
RESOLUCIN CROMATOGRFICA
VARIACIN DE LA CONSTANTE DE
CAPACIDAD POR VARIACIN EN LA
COMPOSICIN DE LA FASE MVIL
DURANTE LA ELUCIN:
A) Elucin con gradiente
B) Programacin del disolvente
Tiempo
Se puede mejorar la
resolucin:
aumentando el factor de
selectividad
a) Cambiar la composicin
de
la
fase
mvil,
incluyendo cambios de pH
b) Cambiar la temperatura
de la columna
c) Cambiar la naturaleza de
la fase estacionaria
d) Utilizar efectos qumicos
especiales