Efecto de la concentracin de enzima en la velocidad de reaccin de la catalasa

con H2O2 cuantificado indirectamente a travs de la presin del gas oxgeno (O2)
producido
.

INTRODUCCIN
Las enzimas son protenas globulares, responsables de la mayora de las acciones qumicas en los
seres vivos. Ellas actan como catalizadores, sustancias que aumentan la velocidad de las
reacciones qumicas sin ser destruidas o alteradas durante el proceso (Rodrguez, 2000). Las
enzimas son extremadamente eficientes y pueden ser usadas una y otra vez, por lo cual, una enzima
puede catalizar miles de reacciones cada segundo (cita). Factores como temperatura y pH son
extremadamente importantes pues afectan la actividad enzimtica. La mayora de los organismos
tienen un rango de temperatura especfica con la cual sobreviven, y sus enzimas funcionan mejor
con ese rango de temperatura (cita). Si el ambiente en el que se encuentra la enzima es demasiado
cido, o demasiado bsico, la enzima irreversiblemente puede desnaturalizarse, perdiendo as su
forma y por lo tanto su funcionamiento.
Si bien el H2O2 (perxido de hidrgeno) es txico para la mayora de los seres vivos, muchos de
ellos pueden transformarlo enzimticamente antes de que pueda causar daos (cita).
Segn (cita) el H2O2 puede ser convertido en oxigeno y agua, de la manera siguiente:
2 H2O2
2 H2O + O2
Segn Blackwell et al. (1990), al menos dos diferentes enzimas se conocen que catalizan esta
reaccin: catalasa, encontrada en animales y protistas, y peroxidasa, encontrada en las plantas. Por
otro lado Beyer y Fridovich (1987) mencionan que el ndice de una reaccin qumica puede ser
estudiado de muchas maneras, entre ellas:

midiendo la concentracin de un producto (en este caso, el gas O2)

midiendo la cantidad de sustrato presente (en este caso H2O2 )
midiendo la presin de un producto ( en este caso O2 )

Con base en lo anterior, el objetivo de esta investigacin fue evaluar la actividad enzimtica cuando
se aplican distintas concentraciones de catalasa a un volumen determinado de H 2O2. Esta se
determin cuantificando la presencia de O2 (un producto de la reaccin) utilizando un sensor de
presin de gas.

PREGUNTA DE INVESTIGACIN
Cmo se modifica la actividad enzimtica cuando se hace reaccionar un volumen fijo de
H2O2 (sustrato) con distintas concentraciones de enzima catalasa?
Para observar el patrn de actividad enzimtica, se utilizaron 3 concentraciones distintas de
catalasa (2, 10 y 20 gotas de solucin enzimtica) y un mismo volumen de H 2O2 (3 ml). Una forma
indirecta de medir la actividad enzimtica es cuantificando el producto generado. Entonces,
esperando que uno de los productos de la reaccin enzimtica fuera el gas O2 se utiliz un sensor de
presin de gas para registrar el O2 producido durante 3 minutos. En consecuencia a mayor volumen
de sustrato, mayor cantidad de producto producido y por ende tambin mayor presin de gas.

HIPTESIS
La hiptesis del presente estudio determina que en la reaccin enzimtica catalasa-H 2O2, si la
concentracin de enzima aumenta, entonces la presin de gas producida por la presencia del
oxgeno gaseoso generado, tambin lo har.

VARIABLES
En los siguientes cuadros se especifican y describen las variables independiente, dependiente y
controladas que se consideraron para la presente investigacin.
Variable
independiente

Concentracin de
catalasa ( 1 gota )

Variable
dependiente

Tratamientos
Se utilizaron 3 volmenes de suspensin enzimtica:
Tratamiento 1: 2 gotas
Tratamiento 2: 10 gotas
Tratamiento 3: 20 gotas
Cabe mencionar que se hicieron 5 repeticiones de cada
tratamiento.

Cmo se cuantific?

El O2 generado como producto de la reaccin enzimtica se

Presin de gas (O2) determin de forma indirecta midiendo la presin generada por
( 1PA )
este gas a medida que aumentaba su produccin. La medicin se
realiz durante 3 minutos.

Variable controlada
1

pH

Temperatura

Por qu fue necesario

Cmo se control?
controlarla?
El pH modifica la Se utiliz papel pH para
actividad enzimtica.
determinar el pH de la
solucin justo antes de cada
medicin para asegurarnos
que siempre se tuviera el
mismo pH ( 7).
La temperatura es un No se control la temperatura
factor que modifica la en sentido estricto pues el
actividad enzimtica.
experimento se realiz en el
laboratorio
escolar
a
temperatura ambiente, slo
se
procur
mantenerlo
cerrado para evitar corrientes
de aire durante el mismo.
Adems, las mediciones se
realizaron siempre a la
misma hora de la maana
con la finalidad de mantener

Cantidad de sustrato

Procedencia
enzima.

de

La cantidad de sustrato
disponible modifica la
actividad enzimtica.

la La cantidad de catalasa
presente en un tejido
vegetal o animal puede ser
distinta.

la
misma
temperatura
durante el experimento (20 23C).
En todos los tratamientos se
utiliz el mismo volumen (3
cm3) de H2O2 (perxido de
hidrgeno) con la misma
concentracin
(2.2
g/100cm3) y se adicionaron 3
cm3 de agua destilada.
La suspensin enzimtica se
obtuvo de un mismo tipo y
cantidad de tejido animal
(hgado crudo de res). Para
todos los tratamientos se
utiliz la misma solucin
enzimtica, solo que con
distinto volumen.

|5 Etc
MATERIALES Y MTODOS
Equipo y material

Sensor de presin de gas Vernier ( 1 Pa)

Interfase de recopilacin de datos Vernier
Software Logger Pro de Vernier
Cronmetro Vernier
Laptop
Bscula digital T-Scale ( 1 g)
Licuadora Oster con mini vaso de 250 cm3
Gradilla de plstico para tubos de ensayo
3 Pipetas volumtricas de 10 cm3 con bulbo
1 Pipeta volumtrica de 100 cm3 con bulbo
15 tubos de ensayo de vidrio con capacidad de 30 cm3
1 Soporte universal
1 Pinza para soporte universal
1 Tabla de plstico para picar
1 Cuchillo
1 Embudo de filtracin
1 Vaso de precipitados de vidrio de 600 cm3
Plstico egapack
Papel filtro

Reactivos

100 cm3 de Perxido de hidrgeno H2O2 (agua oxigenada)

con concentracin de 10 moles/ cm3
100 cm3 de Agua destilada

Material biolgico

200 g de hgado de res crudo

METODOS
I.

Procedimiento para preparar la suspensin enzimtica.

1. Se pesaron 30 g de hgado de res crudo con la bscula digital (1 g).

2. Una vez pesado, el hgado se cort en pequeas porciones y se coloc en la licuadora
aadiendo 60 cm3 de agua destilada y se licu hasta obtener una mezcla homognea.
3. La mezcla se filtr utilizando un vaso de precipitados de 600 cm3, embudo de vidrio y papel
filtro.
4. La solucin obtenida del filtrado (suspensin enzimtica) se mantuvo en el vaso de
precipitados y se tap con una cubierta plstica hasta que se requiri anexarla a los tubos de
ensayo con H2O2 para llevar a cabo la reaccin cataltica.
5. Para llevar a cabo este procedimiento invertimos aproximadamente 20 minutos.
II.

Procedimiento para la medicin de la actividad enzimtica.

1. Se encendi la interfase y se le conect el sensor de presin de gas para que estuviera listo
para la medicin.
2. Se rotularon con marcador indeleble tres tubos de ensayo con los nmeros 1, 2 y 3
respectivamente y se colocaron en la gradilla.
3. En cada tubo de ensayo previamente rotulado, se vertieron 3 cm3 de H 2O2 utilizando la
pipeta volumtrica.
4. Con otra pipeta volumtrica limpia se midieron y agregaron 3 cm3 de agua destilada a cada
uno de los tres tubos de ensayo.
5. Usando una pipeta limpia, se agregaron 2 gotas de suspensin enzimtica al tubo 1 e
inmediatamente despus se comenz a tomar el tiempo con un cronmetro.
6. Se tap la abertura del tubo de ensayo con un dedo y gentilmente se invirti dos veces para
mezclarlo.
7. Inmediatamente despus se coloc el sensor de presin de gas en la boquilla del tubo de
ensayo y se fij con un soporte universal y pinzas tal como se muestra en la Figura 1.
8. Despus de que el cronmetro registrara 30 segundos, se comenzaron a registrar los datos
con la interfase durante 3 minutos.
9. Una vez terminado el registro se guardaron los datos para su posterior anlisis y se
desacopl el sensor dejndolo listo para la siguiente medicin.
10. Se tom el tubo de ensayo rotulado con el nmero 2 y con una pipeta limpia se agregaron 10
gotas de suspensin enzimtica y nuevamente se comenz a registrar el tiempo con un
cronmetro.
11. Se repitieron los pasos 6, 7, 8 y 9 de este apartado.
12. Se tom el tubo de ensayo rotulado con el nmero 3 y con una pipeta limpia se agregaron 20
gotas de suspensin enzimtica y nuevamente se comenz a registrar el tiempo con un
cronmetro.
13. Se repitieron los pasos 6, 7, 8 y 9 de este apartado.
14. Todo este procedimiento del paso 1 al 13 se repiti 5 veces, pues se determin que se
realizaran 5 repeticiones de cada tratamiento.
15. Cabe mencionar que el presente procedimiento para el registro de datos nos tom alrededor
de 3.5 horas.

Figura 1. Representacin del montaje de materiales para el registro de datos con el sensor de
presin de gas Vernier .
III.

Procesamiento de datos

1. Se descargaron los datos registrados de la interfase Vernier a la computadora, para lo cual

se tuvo que instalar previamente el programa Logger Pro de Vernier en la computadora.
2. Con los datos obtenidos en cada repeticin se realiz una sola grfica para visualizar el
patrn de actividad enzimtica que se tuvo con cada tratamiento.
3. Una vez terminado cada registro de datos, se determin la velocidad inicial de reaccin de
la enzima realizando una regresin lineal. As, el valor de la pendiente de la lnea, m, se
consider la velocidad inicial de reaccin enzimtica.
4. Una vez obtenidos las velocidades iniciales de reaccin de cada una de las 5 repeticiones
por tratamiento, se aplic una prueba estadstica t de student con una P0.05 utilizando el
paquete estadstico Excel para corroborar si efectivamente hubo una diferencia significativa
entre los distintos tratamientos.

ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Respecto a los datos en bruto, en las Tablas 1, 2 y 3 se muestran los valores de presin de gas
registrados (en cinco repeticiones) debido a la presencia de oxgeno, el cual al ser un producto de la
reaccin enzimtica se utiliz para calcular indirectamente la velocidad inicial de la reaccin
enzimtica y de ese modo determinar el efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad
enzimtica.
Tratamiento 1: 2 gotas de solucin enzimtica (catalasa), 3cm3 de H2O2 y 3cm3 de H2O
Tiempo de
Presin de gas O2
( 1Pa)
la reaccin
enzimtica
en
Primera
Segunda
Tercera
Cuarta
Quinta
Promedio
segundos repeticin repeticin repeticin repeticin repeticin
X
( 1 seg.)
1
2
2
3
2
1
2
10
5
4
5
5
3
4
20
8
8
9
8
7
8
30
11
11
12
11
10
11
40
14
14
15
14
13
14

50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180

17
21
26
30
35
41
47
51
54
58
62
65
67
70

Tabla 1. Presin de gas oxgeno generado por la reaccin de la catalasa de origen animal y el
perxido de oxgeno con el tratamiento 1, durante cinco repeticiones.
Tabla 2. Tabla 3. .. etc
A simple vista en las Tablas 1, 2 y 3 se observa que a medida que trascurre el tiempo hay una
tendencia a aumentar la presin de gas, sin embargo para visualizar de forma ms clara y confiable
los datos se calcul la media y la desviacin estndar de los valores de presin de gas registrados
por unidad de tiempo para los tres tratamientos. Los datos obtenidos tal como se muestran en la
Tabla 4 hacen evidente la poca variabilidad que existe entre los datos registrados en cada uno de los
19 tiempos de registro por cada tratamiento.
Tiempo de la
reaccin
enzimtica en
segundos
( 1 seg.)
1
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180

Tratamento 1:
2 gotas de solucin
enzimtica)

Tratamento 2: 10gotas
de solucin
enzimtica.

Tratamento 3:
20 gotas de solucin
enzimtica.

Promedio ( DS)
21
41
81
111
141

Promedio ( DS)
51
101
131
181
241

Promedio ( DS)
101
151
191
251
301

Tabla 4. Valor promedio ( DE) de la presin del gas oxgeno generada a lo largo de tres minutos
durante la reaccin cataltica catalasa - H2O2 al utilizar tres concentraciones distintas de enzima.
La poca variabilidad de datos en torno a la media en cada uno de los tiempos de registro se ve
reflejada tambin en las Grficas 1, 2 y 3 de los tres tratamientos respectivamente.

Presin del
gas O2 (Pa)

10

20

30.

Tiempo (segundos (1seg)

Grfica 5. Variaciones en la presin de gas (1Pa), debido al O2 producido por la actividad
enzimtica de la catalasa durante el tratamiento 1 (1 gota de solucin enzimtica) a lo largo de
3minutos con registro de datos en intervalos de 10 segundos.
Este comportamiento de los datos registrados, es decir, que la concentracin de la enzima
incrementa la tasa de actividad enzimtica, coincide con lo reportado por Rodrguez (2000) quin
cuantific la concentracin de O2 como producto de la reaccin cataltica de la catalasa y H 2O2.
Cabe mencionar que este mismo patrn de actividad enzimtica no es exclusivo de la catalasa,
tambin ha sido descrito por Blackwell et al. (1990) para otras enzimas como .
Por otro lado, con los promedios obtenidos en cada repeticin se realiz una sola grfica para
contrastar el patrn de actividad enzimtica que se tuvo con cada tratamiento (Ver Grfica 4.) En
sta se observa claramente que a medida que se incrementa la concentracin de la enzima tambin
lo hace la presin de gas. Sin embargo, aqu se hizo evidente otro factor, la pendiente de cada curva
es distinta entonces se decidi calcular cada una de ellas pues de esa forma se estara determinando
la velocidad inicial de reaccin cuando se modifica la concentracin de enzima. As a mayor
concentracin, mayor tambin la velocidad inicial de reaccin.

Grfica 4..
Las pendientes de las curvas se calcularon segn el procedimiento sugerido en el manual de
prcticas deVernier deBiologaAvanzada,2014.Conbaseenloanterior,seobtuvieronlos
resultados de la
Tabla5.
Cantidad de
solucin
enzimtica
( 1 gota)

Pendiente , o velocidad inicial de reaccin

(%/s)

1.
Rep.

2.
Rep.

3.
Rep.

4.
Rep.

5.
Rep.

2 gotas
10 gotas
20 gotas

Tabla 5. Velocidades iniciales de reaccin de la catalasa obtenidas al modificar la

concentracin de la enzima para la catlisis con H2O2.
Con base en lo anterior, para determinar si exista diferencia significativa entre las velocidades
iniciales de reaccin de la catalasa al interactuar con el sustrato H 2O2, al modificarse la
concentracin de la misma, se realiz una prueba estadstica t de student con una P0.05 utilizando
el paquete estadstico Excel.
Asimismo y en concordancia con la hiptesis del presente estudio, las hiptesis estadsticas son las
siguientes:
Ha: Si hay diferencia significativa entre las velocidades iniciales de reaccin de la catalasa cuando
se modifica la concentracin de esta enzima al interactuar con el H2O2.
Ho: No hay diferencia significativa entre las velocidades iniciales de reaccin de la catalasa cuando
se modifica la concentracin de esta enzima al interactuar con el H2O2.
La frmula utilizada fue la siguiente:

donde:
xx1 : es la media del primer conjunto de datos
xx2: es la media del primer conjunto de datos
S12 :es la desviacin estndar del primer conjunto de datos
S22: es la desviacin estndar del primer conjunto de datos
N1: es el nmero de elementos en el primer conjunto de datos
N2 :es el nmero de elementos en el primer conjunto de datos

Dado que tenemos tres conjuntos de datos se harn dos pruebas de t, una incluyendo la dosis de
solucin enzimtica ms pequea (2 gotas) y la mayor (20 gotas) y otra inluyendo la dosis ms
pequea ( 2 gotas) y la intermedia (10 gotas).

Resultados de la t de student y comparar t calculada con la de tablas para

aceptar o rechazar hiptesis nula.
CONCLUSIONES:
Los resultados de esta investigacin aportan..
Enfatizar si se obtuvo lo que esperaba

EVALUACIN : Modificaciones que se pueden realizar para mejorar la investigacin.

REFERENCIAS:
Formato APA

En estadstica la regresin lineal o ajuste lineal es un mtodo matemtico que modela la relacin
entre una variable dependiente Y, las variables independientes Xi