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HPLC-LC/MS
http://dx.doi.org/10.4322/sc.2013.005
ISSN 1984-4433
Resumo
A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC ou CLAE) uma das principais tcnicas utilizadas na
anlise de compostos no volteis e/ou termicamente instveis. Apesar de ser uma excelente tcnica de
separao, a HPLC necessita de uma tcnica confirmatria quando a anlise qualitativa (confirmao
da identidade qumica) tambm necessria. Dentre as vrias opes existentes no momento, a
espectrometria de massas (ms) a tcnica que melhor fornece as informaes estruturais necessrias.
O acoplamento entre estas duas tcnicas d origem a uma ferramenta analtica verstil e de grande
potencial na anlise qualitativa e quantitativa: a LC/MS (cromatografia lquida acoplada espectrometria
de massas). O presente artigo, segundo de uma srie sobre o tema, apresenta de forma crtica e detalhada
a escolha do analisar de massas para LC-MS(MS).
Palavras-chave
Cromatografia lquida; HPLC; CLAE; Espectrometria de massas; LC-MS/MS.
Lanas FM
1 Introduo
Em um artigo anterior desta srie[1], o autor
descreveu os principais aspectos envolvidos
no acoplamento entre cromatografia lquida
moderna e a espectrometria de massas (LCMS), com nfase na instrumentao adequada
para contornar as dificuldades apresentadas
pela incompatibilidade entre os aspectos operacionais existentes entre essas tcnicas. Neste
segundo trabalho da srie sero discutidos os
vrios aspectos prticos envolvidos na escolha do
analisador de ons mais adequado para LC-MS e
LC-MS/MS, a partir das necessidades requeridas
pelo tipo de experimento a ser realizado e dos
resultados esperados.
A Figura1 ilustra, de forma esquemtica, os
principais componentes de um espectrmetro de
massas tpico.
A amostra a ser analisada introduzida no
espectrmetro de massas atravs de um inlet
(dispositivo para a introduo da amostra no
espectrmetro) e direcionada para a fonte de
ionizao. Nos estgios iniciais do desenvolvimento da tcnica, a amostra era introduzida pela
vaporizao direta dela; com o desenvolvimento
2 Analisadores de massas
28
Lanas FM
Lanas FM
Figura2 Esquema simplificado de um espectrmetro de massas de duplo foco ou duplo setor (eltrico, E; e
magntico, B).
Lanas FM
Figura3 Esquema de um espectrmetro de massas tpico evidenciando as quatro barras que constituem um
analisador do tipo quadrupolo.
jetrias instveis e, como consequncia, atingiro as barras e sero eliminados pela bomba de
vcuo.
Mantendo constante a razo VDC/VRF, um
grfico de a x q permite definir graficamente uma
linha de estabilidade dos ons. Frequentemente,
a razo VDC/VRF selecionada de maneira que
uma janela de 1 Da escolhida, resultando em
uma resoluo unitria em toda a faixa de massa
analisada.
2.3 Analisadores de massas do tipo ion
trap (aprisionadores de ons)
Os analisadores do tipo ion trap (aprisionadores de ons) so tambm denominados de
quadrupolos tridimensionais ou quadrupolos
ion trap, enquanto que os quadrupolos descritos
no item anterior so denominados simplesmente
quadrupolos ou, alternativamente, quadrupolos
lineares. Nos analisadores do tipo ion trap um
eletrodo hiperblico na forma de um anel (denominado ring electrode) colocado entre dois
eletrodos hiperblicos denominados eletrodos
end cap. Uma voltagem Rf (corrente alternada,
AC), de amplitude varivel V e com frequncia
ao redor de 1 MHz, aplicada ao ring electrode,
enquanto que os eletrodos end cap so aterrados
(Figura4). Os dois eletrodos end cap apresentam
um orifcio no centro; o eletrodo superior permite a passagem dos ons provenientes da fonte
Lanas FM
Lanas FM
Figura5 Esquema simplificado de um ToF com o reflectron fora de operao (a) e em operao (b), ilustrando
a curva na trajetria dos ons provocada pelo refletor.
O desempenho do oa-ToF (ToF com acelerao ortogonal) pode ser ainda melhorado
com a adio de um gs. Esse colide com os ons
em um guia de vrios polos (usualmente, um
quadrupolo ou hexapolo operando apenas com
radiofrequncia modo rf-only), diminuindo
a energia (resfriando) dos ons antes de eles
entrarem na regio de acelerao ortogonal, tambm denominada pulser, resultando na focalizao dos ons em um feixe de dimetro menor. Na
regio de alto vcuo situada antes do pulser, um
conjunto de lentes eletrostticas torna o feixe de
ons paralelo, minimizando problemas de divergncia na direo de acelerao. A combinao
desses sistemasacelerao ortogonal e resfria-
Lanas FM
Figura6 Analisador do tipo ToF com sistema de acelerao ortogonal (oa) e reflectron, podendo operar no
modo LC-MS/MS na configurao Q-ToF (quadrupolo -ToF) ou no modo LC-ToF utilizando o quadrupolo apenas
como filtro de massa, ao invs de analisador, ou seja, aplicando apenas radiofrequncia, Rf (Rf-only mode).
LC-MS. Enquanto os dois primeiros so compactos, apresentam grande simplicidade, baixo custo
e facilidade operacional, interpem como principal limitao a baixa resoluo. O ToF, por outro
lado, perde para os dois analisadores nesses quesitos, mas apresenta resoluo muito superior,
principalmente no modo ao-TOF, caracterstica
necessria em anlises que a requeiram.
Outro tipo de analisador de massas, disponibilizado para venda mais recentemente
e de custo ainda acentuadamente elevado
(porm com resoluo igualmente superior
aos trs analisadores j discutidos), o FTICR
(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance
ou Ressonncia Ciclotrnica de ons com
Transformada de Fourier).
O FTICR-MS, tambm conhecido apenas como FT-MS, por ter sido o primeiro
equipamento do tipo a ser comercializado, foi
desenvolvido por Mel Comisarow e Alan G.
Marshall, na Universidade de British Columbia,
34
(Figura7). Os ons no so expulsos da cela graas a uma pequena voltagem (corrente contnua)
aplicada aos eletrodos de aprisionamento (trapping electrodes), a qual gera um campo eltrico E
perpendicular ao campo magntico B.
A frequncia de rotao de um on no cclotron (c) depende de sua massa (m) e carga
(z). No incio do experimento, nenhum sinal
observado, pois o raio do movimento muito
pequeno. Varrendo-se a radiofrequncia RF pulsada pelas placas de excitao da cela, possvel
excitar-se cada on com razo m/z. Cada frequn
cia de excitao entra em ressonncia com determinado on e o excita para rbitas maiores, onde
induz uma corrente alternada entre as placas do
detector (Figura 8). A corrente induzida tem a
mesma frequncia de ciclotron dos on, e intensidade proporcional a seu nmero. Quando a
frequncia sai de ressonncia para uma dada
razo m/z, os ons retornam ao estado primitivo
e outro pacote de ons com a prxima razo m/z
ser excitado e dessa forma o processo continua.
Para efeito prtico, entretanto, consideram-se as
frequncias como simultneas, resultando em
Lanas FM
espectros complexos da variao da frequncia com o tempo. Esse sinal complexo gerado
sofrer deconvoluo por meio de mtodos,
empregando-se Transformada de Fourier[14],
resultando em espectros que apresentam a variao de intensidade em funo da frequncia c.
O FT-ICR-MS atualmente o tipo de analisador de massas para uso acoplado com LC que
apresenta a maior resoluo (superior a 106, ou
seja, quase ilimitada). Entretanto, seu custo ainda
elevado, possuindo uma tecnologia bastante
mais complexa que os demais analisadores descritos, especialmente em relao ao alto vcuo
necessrio. Sua principal aplicao, no momento,
em estudos onde uma resoluo extremamente
elevada necessria, ou para estudos fundamentais de fragmentao de molculas.
Outro tipo de analisador de massas que
tambm utiliza Transformada de Fourier (FT)
o orbitrap, cujas razes remontam a 1923,
quando Kingdon[15] props o princpio do aprisionamento orbital (orbital trapping). Os estudos subsequentes demonstraram que partculas
carregadas podiam ser aprisionadas em cam-
Lanas FM
Figura8 Esquema simplificado de um sistema FT-ICR-MS ilustrando a deteco e gerao de sinal via
aprisionamento de ons (ion trap) e o posterior tratamento do sinal atravs de Transformada de Fourier (FT) para
gerar o espectro de massas.
3 Resoluo em espectrometria de
massas
Em cromatografia, a resoluo (Rs) para um
par de espcies qumicas usualmente definida
como
Rs =
t R 2 t R1
(w
b2
+ wb1
) 2 (2)
Lanas FM
t
t
=
(3)
2wb2 2 wb2
Lanas FM
M
(4)
M
M 10.000
=
= 10.000 (5)
1
M
Alm dessas definies, mais comuns, existem algumas outras empregadas para a resoluo, como a proposta por Karpas[27] e tambm
por Sparkman[28], segundo os quais a resoluo
pode ser dada apenas pela diferena de massas
entre os ons empregados na medida. Nesse caso,
R=m=m2m1 (6)
M
(4)
M
38
Lanas FM
Poder de resoluo
(FWHM) tpico*
> 1.000.000
> 100.000
40.000-60.000
Quadrupolo/Ion Trap**
10.000
Quadrupolo/Ion Trap
1.000
de Resoluo (Rp) em espectrometria de massas definido nesse documento como a habilidade de um instrumento ou procedimento de
medida distinguir entre dois picos com valores
m/z diferindo por uma pequena quantidade e
expresso como a largura do pico em unidades de
massa. A IUPAC ainda define, no mesmo documento[31], poder de resoluo de massas como
sendo m/m, de forma similar sua definio
para resoluo de massas. Embora no signifiquem a mesma coisa, e nem tenham o mesmo
valor numrico, muito comum empregar-se
Resoluo (R) e Poder de Resoluo (Rp) como
sinnimos em espectrometria de massas[32].
A resoluo em instrumentos do tipo setor
magntico usualmente definida com base em
um vale de 10%, que define m como a diferena
de massas entre dois picos resolvidos com um
vale de 10% entre eles[32]. As demais definies
de resoluo, usualmente, so medidas em um
nico pico ao invs de entre dois picos.
No caso de analisadores do tipo quadrupolo, ToF, Orbitrap e FTICR, a definio empregando m medido na metade da altura do pico
(FWHM) , usualmente, preferida. Entretanto, o
valor mnimo de resoluo quando se emprega
FWHM maior do que o valor obtido usando
largura a 5% da altura ou ento um vale de 10%
(usualmente o dobro ou mais). Uma resoluo
de 30.000 obtida empregando-se FWHM aproximadamente equivalente resoluo de 15.000
obtida empregando-se no clculo a definio de
um vale de 10%.
Outro fator a ser considerado que a resoluo instrumental pode variar de acordo com a
massa do on. Em geral, nos casos dos quadrupolos, o valor aumenta linearmente com o aumento
da massa e, no caso de ToF e instrumentos de
duplo foco, o poder de resoluo mantido constante; no caso de FTICR e Orbitrap, ela diminui
Lanas FM
4 Exatido de massas
Os elementos qumicos so formados por
istopos, ou seja, entidades qumicas que possuem o mesmo nmero de prtons (mesmo
nmero atmico, representado por Z), porm
diferentes nmeros de nutrons (e, portanto,
diferentes massas atmicas, representadas
porA). O elemento qumico carbono, por exemplo, geralmente representado por126C formado por trs istopos, todos com o mesmo
nmero atmico ou seja, com 6 prtons em
seu ncleo porm com diferentes nmeros
de nutrons, resultando em diferentes nmeros
de massas: 12, 13, 14. O istopo mais estvel e
mais abundante, com A = 12, apresenta 6 prtons e 6 nutrons; o de massa intermediria,
A=13, apresenta 6 prtons e 7 nutrons; e o mais
pesado, com A = 14, instvel e pouco abundante (devido ao nmero maior de nutrons, o
ncleo desse istopo instvel, sendo radioativo). A Figura12 ilustra a representao tpica
desses istopos.
40
Lanas FM
mica23) ser 23 vezes mais pesado do que a unidade de massa atmica, ou seja, do que 1/12 do
istopo 12 do carbono.
massa molecular mdia (MW). Seja uma molcula constituda por 60 tomos de carbono, 122 de
hidrognio, 20 de nitrognio, 16 de oxignio e 2
de enxofre (C60H122N20O16S2). A massa molecular
(massa nominal) ser obtida multiplicando-se o
nmero de tomos de cada elemento pela massa
integral do istopo mais abundante e somando-se as contribuies de cada um (Tabela3).
Tabela2 Composio isotpica dos principais elementos qumicos de interesse em espectrometria de massas
(apenas os istopos estveis esto listados)[34].
Elemento
Istopo A
Istopo A+1**
Istopo A+2**
Massa
%*
Massa
Massa
100
0,015
**
**
12
100
13
1,1
**
**
14
100
15
0,37
**
**
16
100
17
0,04
18
0,20
19
100
**
**
**
**
Si
28
100
29
5,1
30
3,4
31
100
**
**
**
**
32
100
33
0,80
34
4,4
Cl
35
100
**
**
37
32,5
Br
79
100
**
**
81
98.0
127
100
**
**
**
**
*Por conveno, os espectros de massas so normalizados de forma que o pico mais intenso tenha uma abundncia de 100%
e as abundncias dos demais sejam calculadas em relao abundncia dele; **Alguns elementos qumicos no possuem
istopos mais pesados (A+1 ou A+2).
Lanas FM
Tabela3
Clculo
da
massa
molecular
(massa nominal) de uma molcula de frmula
C60H122N20O16S2*.
Elemento
Nmero de
tomos na
molcula
Massa do
istopo mais
estvel
Total
60
12
720
122
122
20
14
280
16
16
256
32
Massa nominal:
64
1.442
*Adaptado de Wangetal.[11].
42
Lanas FM
mi ma )
ma
106
Tabela4 Exemplo dos valores de acurcia envolvidos na determinao experimental de um on de massa exata
400 empregando as unidades ppm, mDa e Da.
Medida
Valor exato
(terico)
Valor medido
(experimental)
m(Da)
m(mDa)
m(ppm)
400,0000
400,0013
0,0013
1,3
3,3
400,0000
399,9987
0,0013
1,3
3,3
400,0000
400,0072
0,0072
7,2
18
Lanas FM
6 Concluses
Neste artigo, segundo de uma srie a respeito do acoplamento entre cromatografia
lquida e espectrometria de massas (LC-MS), o
foco foi o analisador de massas, que responsvel pela resoluo de massas do sistema. Quando
o objetivo da anlise por LC-MS a identificao
da espcie eluida do sistema HPLC pelo MS, esse
ltimo deve apresentar a maior acurcia (menor
erro) possvel na medida das massas. Idealmente,
erros ao redor de 2 ppm ou menos so desejveis na atualidade com os equipamentos comercialmente disponveis. Considerando-se a complexidade das amostras usualmente analisadas
por LC-MS(/MS), inclusive resduos de drogas
veterinrias em tecidos, leite, ovos, mel e outras
matrizes; resduos de pesticidas em verduras,
legumes e frutas; petrolmica, protemica; metabolmica; lipodmica; glicoprotemica; e outras
reas[39-48], a acurcia desejada requer o uso de
espectrmetros de massas de alta resoluo,
ou seja, daqueles que possuem analisadores de
massas de alta resoluo (como o ToF) ou altssima resoluo, nos parmetros atuais, como o
FT-Orbitrap e o FT-ICR. Debates em andamento
na rea de segurana alimentar (por exemplo, na
anlise de resduos e contaminantes em alimentos de origem animal e vegetal), especialmente
na Comunidade Europia (CE), sugerem para
o futuro prximo a adoo da espectrometria
de massas de alta resoluo como padro para
a gerao de dados por laboratrios acreditados/credenciados/recomendados por ela nessa
rea. A discusso apenas comeou, mas promete
muito.
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Agradecimentos
O autor agradece ao CNPq, FAPESP
e FINEP/MAPA/MCT pelo apoio s pesquisas desenvolvidas no laboratrio sob sua
coordenao.
Referncias
1
Thomson JJ.
20(6):75267.
Philosophical
Magazine
1911;
Lanas FM
Physics1958;3:1396.
17 Knight RD. Storage of ions from laserproduced
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20 Makarov A, Denisov E, Kholomeev A, Balschun W,
http://dx.doi.
http://fiehnlab.ucdavis.edu/Seven_Golden_Rules/
Mass_Resolution.
30 School of Chemistry and Biochemistry. [cited 2013
Lanas FM
http://dx.doi.org/10.1002/
1496. PMid:17394128.
rcm.2996
45 Chowdhury
Recebido: 15/02/2013
Aceito: 06/03/2013
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