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DIRECTORIO INSTITUCIONAL
SECRETARA DE AGRICULTURA, GANADERA DESARROLLO RURAL PESCA Y
ALIMENTACIN
Lic. Enrique Martnez Martnez
Secretario
Lic. Jess Alberto Aguilar Padilla
Subsecretario de Agricultura
Prof. Arturo Osorio Snchez
Subsecretario de Desarrollo Rural
Lic. Ricardo Aguilar Castillo
Subsecretario de Alimentacin y Competitividad
Lic. Marcos Augusto Bucio Mjica
Oficial Mayor
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRCOLAS Y
PECUARIAS
Dr. Pedro Brajcich Gallegos
Director General
Dr. Salvador Fernndez Rivera
Coordinador de Investigacin, Innovacin y Vinculacin
M. Sc. Arturo Cruz Vzquez
Coordinador de Planeacin y Desarrollo
Lic. Marcial A. Garca Morteo
Coordinador de Administracin y Sistemas
CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIN DISCIPLINARIA EN CONSERVACIN Y
MEJORAMIENTO DE ECOSISTEMAS FORESTALES
Dr. Fabin Islas Gutirrez
Director
CRDITOS EDITORIALES
Edicin Tcnica:
Dr. Alejandro Ponce Mendoza
M.C. Claudia Mndez Espinoza
Edicin:
Dra. Mara Cecilia del Carmen Nieto de Pascual Pola
Cuidado de la Edicin:
M. C. Marisela C. Zamora-Martnez
Diseo
Silvia Onodera Hamano
Fotografa:
Pas. Bil. Luis Barba-Escoto
MVZ. Jess Prez Santacruz
Dra. Ana Wegier Briuolo
La cita correcta es:
Wegier, A., L. Barba-Escoto, F. Garca-Campusano, J. Prez S. y A. Flores G.
2013. Mtodo para el establecimiento in vitro de caoba (Swietenia macrophylla
King) a partir de explantes vegetativos. Manual Tcnico Nm. 10 . CENID-COMEF,
INIFAP. Mxico, D.F. Mxico. 84 p.
No se permitir la reproduccin total o parcial de esta obra, ni la transmisin de
ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico, fotocopia,
por registro u otros medios, sin el permiso previo y por escrito a la Institucin.
Derechos Reservados 2013
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias
Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, delegacin Coyoacn. 04010. Mxico
D.F. Telfono (55) 3626 8700 ext. 608
Primera edicin 2013
1 000 ejemplares
Impreso en: Graphx, S.A. de C.V. Tacuba 40, Desp. 205. colonia Centro,
Mxico, D.F. 06010
La edicin se termin de imprimir en julio de 2013
ISBN 978-607-37-0052-8
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AGRADECIMIENTOS
Los autores desean hacer patente su agradecimiento al Fondo
CONAFOR-CONACYT por el financiamiento otorgado mediante el
Proyecto Generacin de lneas celulares de Swietenia macrophylla King
resistentes al barrenador de las meliceas (Hypsipyla grandella Zeller)
mediante la integracin del gen Bt (Nm. 148409) para llevar a cabo
este manual, as como a la comunidad del CENID COMEF por las
facilidades otorgadas.
Igualmente, a diversas personas que con su importantes aportaciones,
contribuyeron a lograr este objetivo.
Al M. en C. Xavier Garca Cuevas, Investigador Titular del Programa
de Plantaciones Forestales y Sistemas Agroforestales del Campo
Experimental Chetumal. CIR-Sureste y al personal del Vivero Forestal
La Unidad (Localidad Tolom, Km 1 Col. Los Amigos, Municipio Paso de
Ovejas, Veracruz) por haber proporcionado el material vegetal para la
realizacin del proyecto.
Al personal del rea de Adquisiciones del CENID-COMEF y en particular a
Nancy Corona y a Abigail Coln lvarez por su ayuda en diversas gestiones.
Al Sr. Joel Reyna Flores, Tcnico adscrito al Laboratorio de Biotecnologa
Forestal del CENID COMEF, por su apoyo en la operacin de varios
procedimientos y a la Pas. de Bil. Alejandra Cervantes por haber
desempeado distintas actividades para efectos de su Servicio Social.
Al Dr. Alejandro Ponce Mendoza y a la M. en C. Claudia Mndez Espinoza,
investigadores del CENID-COMEF, por sus comentarios para enriquecer
el contenido del manual.
Este manual fue validado por personas con diferente experiencia en el
cultivo de tejidos, desde los que trabajan en laboratorio con la tcnica en
otras especies, los que trabajan en laboratorio en otras reas y los que
an no haban trabajado en un laboratorio. A todos ellos queremos expresar
nuestro agradecimiento para que esta obra resulte beneficiosa para el usuario.
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CONTENIDO
INTRODUCCIN
1. CARACTERSTICAS DE LA ESPECIE
Clasificacin taxonmica
Nombre comn
Descripcin botnica
Aspectos fenolgicos, fisiolgicos y genticos
Distribucin natural y datos ecolgicos
Usos
Datos de vivero, cultivo y produccin
2. EL CULTIVO in vitro COMO UNA ALTERNATIVA PARA
LA SILVICULTURA
Generalidades del cultivo in vitro
Cultivo in vitro de la caoba
3. MATERIAL Y MTODOS
rea de cultivo
Desinfeccin del rea de siembra
Desinfeccin del material para sembrar
Tres vas para el establecimiento in vitro de caoba
- Germinacin in vitro
- Proliferacin de yemas axilares
- Formacin de callo
CONSIDERACIONES FINALES
BIBLIOGRAFA
ANEXOS
Pgina
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INTRODUCCIN
La caoba (Swietenia macrophylla King) es una de las especies maderables
de las zonas tropicales con mayor importancia econmica. Sin embargo,
el aumento de la tasa de deforestacin, el sobre aprovechamiento de
sus poblaciones naturales y la tala de los mejores individuos para uso
comercial han afectado la diversidad gentica de las poblaciones
(Gillies, 1999; Novick et al., 2003; Lemes, 2000; Lemes et al., 2003; Basil,
2007). Con el propsito de regular el comercio ilegal de la especie, fue incluida
en el listado del Apndice II del CITES (Convencin sobre el Comercio
Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres, por
sus siglas en Ingls) en 2002; esta medida contribuye a mantener un
comercio legal y sostenible de sus existencias (CITES, 2003). Para restaurar
las poblaciones silvestres es necesario disear estrategias para promover
su conservacin y regeneracin en toda la distribucin de la especie in situ
(Patio, 1998), aunado a sistemas de propagacin y manejo ex situ, como lo
son las plantaciones artificiales y los bancos de germoplasma.
Una alternativa para la regeneracin de la caoba es el cultivo in vitro,
ya sea para fines de conservacin, o como parte de los planes de
aprovechamiento. El cultivo in vitro es una herramienta biotecnolgica
orientada a la propagacin clonal de plantas (Bonga y von Aderkas,
1992; George, 1993) y que se ha explorado ampliamente durante las dos
ltimas dcadas. Es un recurso socorrido en los bancos de germoplasma
que requieren resguardar especies con semillas recalcitrantes; asimismo,
es indispensable para realizar mejoramiento gentico, ya que permite
probar el potencial de un mismo individuo en diferentes condiciones y con
validez estadstica porque se pueden producir muchos clones de un rbol
seleccionado (Thorpe et al., 1991).Con base en todo lo anterior, el objetivo
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1. CARACTERSTICAS DE LA ESPECIE
Clasificacin taxonmica
La especie Swietenia macrophylla fue descrita por George King en 1886
(King, 1886). Con base en los registros del Missouri Botanical Garden
(tropicos.org; theplantlist.org), la clasificacin taxonmica aceptada ms
reciente es:
clase: Equisetopsida
subclase: Magnoliidae
superorden:Rosanae
orden: Sapindales
familia: Meliaceae
gnero: Swietenia
especie: Swietenia macrophylla King
Nombre comn
Conocida comnmente como caoba en pases de habla hispana, tanto en
Amrica como en Europa (Pennington y Sarukhn, 2005).
Descripcin botnica
La caoba es una especie caducifolia, que mide de 35 a 50 m de altura (en
ocasiones hasta 70 m), con floracin anual y con dimetro a la altura
de pecho que vara entre 1 y 1.8 m (pero puede incluso llegar hasta 3.5 m).
Los rboles tienen un fuste recto de hasta 25 m, aunque es ligeramente
acanalado, con contrafuertes en la parte basal de hasta 2 a 3 m de altura.
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Desventajas
Tcnica
sensible
a
contaminacin por hongos y
bacterias.
Necesidad de acceso a
instrumental e infraestructura
especializada
Propagacin de
especies
exticas o en peligro de extincin,
en tiempos relativamente cortos
Obtencin y propagacin de
individuos libres de patgenos.
Reduce
el
tiempo
de
generacin lo que es posible
aplicar a especies forestales.
Existencia de prdidas
oxidacin y crecimiento
anmalo.
durante los trasplantes.
evaluacin
del
costo
beneficio de las tcnicas
que se van a utilizar.
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rea de cultivo
Para el cultivo in vitro es necesario habilitar varias reas para controlar las
condiciones de asepsia, as como el ambiente donde se desarrollarn
las plantas: (a) rea de lavado, (b) rea de preparacin de medios, (c) cuarto
de siembra y (d) cuarto de incubacin (o cultivo).
a)
b)
c)
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Figura 1. rea de lavado. (a)Tarja y rea de secado. (b) El rea puede ser
utilizada para los tratamientos de desinfeccin ya que muchas
veces se puede derramar las soluciones.
a)
con las partes ms internas y terminar con las orillas exteriores. Esta
operacin debe hacerse al menos 2 veces (la mesa no debe de tener
ningn instrumento en su superficie al momento de la desinfeccin).
2. Encender el motor de la campana de flujo laminar al menos 15
minutos antes de empezar a trabajar.
3. Encender una lmpara de luz ultravioleta durante 15 minutos
para eliminar microorganismos.
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Germinacin in vitro
Es una alternativa para la propagacin cuando se tienen lotes de semillas
viables. Permite reducir y eliminar la presencia de la mayora de los
organismos contaminantes (bacterias y hongos), para la produccin de
plntulas de alta calidad que incluso pueden ser transportadas a otras
zonas del pas. Por lo mismo, pueden tambin ser utilizadas como fuente
de explantes para el cultivo.
A) Preparacin de medio de cultivo
1) Se requiere medio de cultivo PDA (papa-dextrosa-agar) 6 g/l, que ya
se vende comercialmente.
2) Verter 30 ml por frasco, tapar y esterilizar durante 15 minutos, a 15
lb y 121C.
3) Si el medio no se va a usar inmediatamente, se puede guardar en
refrigeracin a 4C, hasta por 1 mes.
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b)
a)
c)
Figura 10. Semilla de caoba. (a) Smaras. (b) Aspecto de la semilla y
la cubierta blanca que presenta. (c) Remocin de cubierta
blanca con escobilln y agua.
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a)
b)
Figura 11. (a) Colocacin de semilla en medio PDA. (b) germinacin de
semilla (15 das de incubacin).
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C) Condiciones de cultivo
1. En condiciones de esterilidad, se colocan las semillas sobre el medio.
2. El frasco se tapa y se sella con pelcula plstica autoadherible
(EgaPac) o Parafilm.
3. Los cultivos se mantienen en oscuridad a una temperatura de 30C
durante al menos 7 das. Sin embargo, esto depender de la edad de
las semillas y de las condiciones en las que fueron almacenadas,
pues entre ms tiempo permanezcan as, requerirn mayor tiempo en
oscuridad. Se debe monitorear a los 7 das y posteriormente cada dos
das. En el momento en que se observe el crecimiento de hojas se inicia
la incubacin con luz (Figura 11).
Proliferacin de yemas axilares
Es una alternativa para la propagacin clonal de especies forestales, ya
que permite la regeneracin de individuos de caractersticas ya probadas
o de genotipos selectos. Consiste en cultivar lo pices de los tallos y
promover el desarrollo y alargamiento de las yemas axilares, mismas que
posteriormente son separadas del tallo y enraizadas, para dar lugar a
plntulas individuales. Es la va ms deseable cuando no se tiene acceso
a semillas, o cuando se cuenta con muy pocos individuos (Figura 12).
En general, la regeneracin in vitro de especies forestales a partir de
tejidos maduros ha resultado ms complicada que a partir de tejidos
jvenes debido a que su capacidad de respuesta disminuye con la edad.
Se recomienda utilizar los tejidos ms jvenes que se puedan encontrar en
la planta adulta: yemas apicales y axilares, hojas muy jvenes, etc. (Figura 12).
Para usar explantes a partir de plantas maduras es conveniente que:
(1) provengan de rboles vigorosos y con buena hidratacin aparente
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B) Preparacin de medios
El medio ideal para la proliferacin de yemas axilares en la caoba es el
de Murashigue-Skoog (MS), as como el medio WPM (Lloyd & McCown,
Woody Plant Medium). Consultar el Anexo 1 para detalles acerca de su
composicin y preparacin.
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RECUADRO 1
Ajuste de pH
El pH es una medida del nmero de iones de hidrgeno que existen libres
en una solucin. Esta medida es una escala que va del 0 al 14, siendo 0,
lo ms cido, 7 lo neutro y 14 lo bsico. El mediode cultivo necesita un pH
de 5.7, en el cual se asegura una asimilacin ptima de los nutrientes por
el tejido vegetal.
El ajuste de pH se hace una vez que se han agregado todos los reactivos
al medio excepto el agar.
Con ayuda de un agitador magntico se mantiene en circulacin todo
el lquido en el vaso de precipitado y al mismo tiempo se sumerge el
electrodo del potencimetro a una altura suficiente que cubra por completo
al electrodo. Se debe esperar a que la lectura del pH se estabilice en
la pantalla de aparato y se ajusta al valor deseado de una solucin de
hidrxido de sodio 1N (para subir), o de cido clorhdrico 1N (para bajar).
Por ejemplo, si en pantalla se observa un pH de 6, se agrega cido, si al
contrario se observa un pH de 4, se adiciona hidrxido de sodio.
La cantidad de cido o hidrxido que se ha de agregar depende mucho de
que tan alejado este el pH inicial del pH de 5.7 que se busca. Se sugiere
agregar por goteo, de una en una a la solucin, siempre en agitacin,
y esperando el tiempo suficiente para que se estabilice la lectura en la
pantalla del potencimetro.
NOTAS:
Asegrese que el potencimetro est calibrado, existen sustancias buffer
que son soluciones con un PH conocido y con el cual se ajusta el aparato.
Tome en cuenta que el magneto del agitador debe estar a una distancia
suficiente para no entrar en contacto con el electrodo del potencimetro ya
que por el movimiento puede averiarlo. El electrodo debe ser manejado con
sumo cuidado y permanecer en todo momento hidratado.
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C) Esterilizacin
Una vez terminada la preparacin del medio, se debe esterilizar para
destruir cualquier organismo (hongos y bacterias) contaminante.
Los tubos con el medio de cultivo se colocan en una gradilla o bien se
pueden hacer paquetes de peridico y cinta adhesiva de tal manera que no
se volteen y as evitar escurrimientos (Figura 19).
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RECUADRO 2
Disolucin del Agar.
El agar es una sustancia que permite que el medio de cultivo se solidifique con
una consistencia gelatinosa, generando as un soporte para el tejido, adems
de mantener una presin de agua favorable para la asimilacin de nutrientes.
Para que el agar solidifique de forma homognea, debe calentarse hasta la
ebullicin.
La manera ms eficiente de disolver el agar es calentar la solucin a la que y se
ha ajustado el pH, y agregar el agar, despus se contina con la agitacin y
el calentamiento hasta alcanzar su completa disolucin que se obtiene con la
ebullicin.
NOTA: la formacin de burbujas por la ebullicin al interior del contenedor
donde se prepare el medio de cultivo puede ser repentina e incotrolable al
momento de calentarla, lo que puede provocar accidentes por el derrame
del lquido. Por esto se recomienda manipular los recipientes siempre con
guantes de tela y, de ser posible, utilizar un vaso de mayor capacidad, es
decir, de un litro si se preparan 500 ml.
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Figura 26. Obtencin de explantes. Los fragmentos de tallo se sacan del Captn
y se colocan en una caja Petri estril para su procesamiento.
yema
Figura 28. Se ajusta la altura del tallo, por encima y por debajo de la
yema debe de mantenerse al menos un centmetro de tallo
principal para conservar las propiedades de proliferacin de
la yema.
Formacin de callo
El callo se refiere a la proliferacin desorganizada de clulas de
parnquima. Se origina en zonas en las que han ocurrido lesiones, y
evita la entrada de agentes patgenos. Sin embargo, tambin se genera
como consecuencia del cultivo in vitro y su desarrollo tiene importantes
aplicaciones biotecnolgicas (George, 1993).
Los callos varan considerablemente en su apariencia y textura, desde
masas de clulas nodulares compactas o muy suaves. Suelen ser
blancos o de color crema, anaranjados o verdes, dependiendo si contienen
o no cloroplastos, e incluso algunos callos tienen clulas con distintas
coloraciones como distinta forma y diferente estado de diferenciacin
(Robledo-Paz et al., 2006).
La formacin de callo in vitro a partir de un explante se divide en tres
etapas: (1) la induccin de divisiones celulares, por lo general inicia
en los sitios donde ocurri la lesin al producir el explante; (2) perodo
de divisin muy activa, en el que las clulas del explante pierden las
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A) Preparacin de medios
1. El medio ideal para la proliferacin de callo de caoba es el MS. (Consultar el
Anexo 1 para detalles acerca de su composicin).
2. Para 1 litro de medio, se agregan 500 ml de agua destilada a un vaso
de precipitado. En agitacin, se adicionan los macronutrimentos,
micronutrimentos, vitaminas, aminocidos y sacarosa en las
cantidades correspondientes (Anexo 1). Si se usa medio nutritivo
comercial, agregar el peso en gramos indicado por el proveedor
(stos ya contienen todos los nutrimentos necesarios). Agitar hasta
disolverlo todo.
3. Adicionar10mg/ldelaauxinasinttica2,4-D(cido2,4-Diclorofenoxiactico).
4. Ajustar el pH a 5.7
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E) Monitoreo
Durante la primera semana despus de iniciado el cultivo es conveniente
realizar revisiones diarias para detectar a tiempo la presencia
de agentes contaminantes. Despus se pueden realizar monitoreos
quincenales o mensuales para evaluar supervivencia, y contaminacin,
para eventualmente evaluar que individuos nos han dado los mejores
resultados. Se anexa una tabla sugerida para llevar las anotaciones
(Anexo 2).
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CONSIDERACIONES FINALES.
Los mtodos presentados en este manual constituyen la base para el
desarrollo de ulteriores investigaciones en la fisiologa y gentica de
la caoba. An existen profundas lagunas en el conocimiento de esta
especie, desde la misma manutencin a largo plazo de cultivos in vitro,
la regeneracin de plantas adultas a partir de estas tcnicas, hasta el
desarrollo de investigacin sobre sus rutas bioqumicas y la produccin
de metabolitos naturales con potencial de defensa en contra de plagas.
Las tcnicas que se han utilizado para el establecimiento de la caoba
in vitro en el Laboratorio de Biotecnologa del INIFAP CENID-COMEF
pueden ser transmitidos de manera personal y prctica a cualquier
persona interesada ya sean silvicultores, estudiantes o investigadores de
otras instituciones.
Toda correspondencia relacionada con esta publicacin o las tcnicas
aqu descritas, favor de dirigirla a:
Dra. Ana Laura Wegier Briuolo
Laboratorio de Biotecnologa Forestal,
CENID COMEF, INIFAP.
Av. Progreso No. 5
Barrio de Santa Catarina
C.P. 04010 Mxico D.F.
Correo-e: wegier.ana@inifap.gob.mx
Telfono (01 55) 3626 8700 ext. 608
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BIBLIOGRAFA
Aguilar C., J. M y M. A. Aguilar C. 1992. rboles de la Biosfera Maya Petn. Gua para las especies del
Parque Nacional Tikal. Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias
Qumicas y Farmacia. Escuela de Biologa. Centro de Estudios Conservacionistas(CECON).
Guatemala. 272 p.
Barrance, A., J. Beer, D. H. Boshier, J. Chamberlain, J. Cordero, G. Detlefsen, B. Finegan, G.
Galloway, M. Gmez, J. Gordon, M. Hands, J. Hellin, C. Hughes, M. Ibrahim, D. Kass,
R. Leakey, F. Mesn, M. Montero, C. Rivas, E. Somarriba, J. Stewart y T. Pennington.
2003. rboles de Centroamrica. Oxford Forestry Institute-Centro Agronmico Tropical de
Investigacin y Enseanza. Turrialba, Costa Rica. pp. 901-906.
Basil, J. G. A. 2007. Diversidad gentica en poblaciones de Swietenia macrophylla King (Meliaceae)
en Costa Rica y Bolivia. http://orton.catie.ac.cr/repdoc/A1313e/A1313e.pdf. (01 de octubre
de 2012).
Bauer, G. P. y J. K. Francis. 1998. Swietenia macrophylla King. Honduras mahogany, caoba. SO-ITF-SM-81.
US. Department of Agriculture, Forest Service, Southern Forest Experimental Station. New
Orleans, LA USA. 7 p.
Bayman, P, P. Angulo-Sandoval, Z. Bez-Ortiz, D.J. Lodge 1998. Distribution and dispersal of Xylaria
endophytes in two tree species in Puerto Rico. Mycol. Res. 102: 944 948.
Bonga, J. M. and P. von Aderkas. 1992. In vitro culture of trees. Kluwer Academic Publishers.
Dordrecht, The Netherlands. pp 72-125
Briceo-Vergara, A. J.. 1997. Aproximacin hacia un manejo integrado del Barrenador de las
Meliceas, Hypsipyla grandella (Zeller). Revista Forestal Venezolana 41: 23-28.
Collado R., R. Barbn, D. Agramonte, F. Jimnez-Terry, M. Prez and O. Gutirrez. 2010. Indirect
somatic embryogenesis of Swietenia macrophylla King in semisolid culture medium.
Biotecnologa Vegetal. julio-septiembre Vol. 10 (3): 177 184.
Collado R., R. Barbn, D. Agramonte, F- Jimnez-Terry, M. Prez y O. Gutirrez. 2006. Embriognesis
somtica directa en Swietenia macrophylla King. Biotecnologa Vegetal, abril-junio, Vol. 6 (2): 67-71.
Collado R., R. Barbn, D. Agramonte, F. Jimnez, M. Prez, O. Gutirrez y D. Ramrez. 2004.
Establecimiento in vitro de pices y segmento nodales de Swietenia macrophylla King.
Biotecnologa Vegetal, julio-septiembre Vol. 4 (3): 143-146.
Comisin Nacional Forestal (CONAFOR). 2012. Swietenia macrophylla King http://www.conafor.gob.
mx:8080/documentos/docs/13/1005Swietenia%20macrophylla.pdf. (01 de octubre de 2012).
Comisin Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO). 2012. Swietenia
macrophylla.http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/info_especies/arboles/doctos/37melia5m.pdf. (19 de junio de 2012).
Convencin sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestre
(CITES). 2003. Segunda reunin del grupo de trabajo sobre caoba (Swietenia macrophylla).
http://www.cites.org/common/prog/mwg/MWG2/S-MWG2-09-02-MX.pdf. (01 de octubre de 2012).
67
68
Magnitskiy, S.V. G.A. Plaza. 2007 Fisiologa de semillas recalcitrantes de rboles tropicales.
Agronoma Colombiana, Vol. 25. (1): 96-103.
Maruyama, E. 2006. Tissue culture of Swietenia macrophylla King (Big-Leaf Mahogany). In: Suzuki,
K. K. Ishii, K. Sakurai and S. Sasa- ki (Eds). Plantation Technology in Tropical Forest
Science. Springer-Verlag. Tokyo, Japan. p.p. 131-136.
Maruyama, E.; K. Ishii, A. Saito, and K. Migita. 1989. Screening of suitable sterilization of explants
and proper media for tissue culture of eleven tree species of Per Amazon Forest. Journal
of Agricultural Science 33: 252-260.
Medina, L.M. y S.R. Sotolongo. 2004. Avances en el cultivo de tejidos de Swietenia macrophylla King
X Swietenia mahogani Jacq. (Hbrido de Caoba). Revista Forestal Baracoa. Diciembre,
Vol. 23 (2): 19-26.
Navarro, C., J. Cornelius y A. Gillies. 1996. El muestreo de poblaciones y los estudios de diversidad
como base para la conservacin y el mejoramiento gentico forestal. In: Salazar, R.
(Ed.). Memorias del Simposio sobre Avances en la Produccin de Semillas Forestales en
Amrica Latina (1995). CATIE. Turrialba, Costa Rica. pp. 51-55.
Newton, A. C., R. R. B Leakey, K. Powell, R. Chalmers, Z. Waugh, P. Tchoundjeu, J. Mathias, P. G.
Alderson, J. F. Mesen, P. Baker and S. Ramnarine. 1994. Domestication of mahoganies.
In: Leakey, R. R. B. and A. C. Newton (Eds.) Tropical trees: the potential for domestication
and the rebuilding of forest resources. (ITE Symposium, 29). London, UK. pp. 256-266.
Novick, R. R., C.W. Dick, M.R. Lemes, C. Navarro, A. Caccone y E. Bermingham 2003. Genetic
structure of Mesoamerican populations of big-leaf mahogany (Swietenia macrophylla)
inferred from microsatellite analysis. Molecular Ecology 12: 2885-2893.
Patio V., F. 1998. Los recursos genticos de Swietenia macrophylla y Cedrela odorata en los
Neotrpicos: Prioridades para una accin coordinada. http://www.greenstone.org/
greenstone3/nzdl?a=d&book=off&c=fi1998&d=HASH2e05c8a14550905767b0ff&dt=sim
ple&sib=1&p.a=b&p.sa=&p.s=ClassifierBrowse. (01 de octubre de 2012).
Pennington, T. D. y J. Saraukn. 2005. rboles tropicales de Mxico. Manual de identificacin de las
principales especies. 3 edicin. Fondo de Cultura Econmica. Mxico, D. F. Mxico. 523 p.
Prez Flores, J., M. E., guilas Vega y R. Roca Tripepi. 2012. Assays for the in vitro establishment
of Swietenia macrophylla and Cedrela odorata. Rev. Colomb. Biotecnol [online], vol.14,
n.1 ISSN 0123-3475. http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S012334752012000100003&lng=en&nrm=iso (05 de junio de 2013)
Robledo-Paz, A., M. N. Vzquez-Snchez, R. M. Adame-lvarez y A. E. Jofre-Garfias. 2006. Callus
and suspension culture induction, maintenance and characterization. In: Loyola-Vargas
V.M. and N. Ochoa Alejo (Eds). Plant Cell Culture Protocols, Methods in Molecular
Biology, Vol 318. Human Press, Heidelberg, Germany. pp 59-70.
Snchez-Soto, S., M. Domnguez-Domnguez y H. Corts-Madrigal. 2009. Efecto de la sombra en
plantas de caoba sobre la incidencia de Hypsipyla grandella Zeller y otros insectos, en
Tabasco, Mxico Universidad y Ciencia, Vol. 25(3): pp. 225-232.
69
Santiago T., O., V. Snchez M., C. R. Monroy R. y J. G. Salazar G. 2007. Manual de produccin de
especies forestales tropicales en contenedor. INIFAP. CIRGOC. Campo Experimental El
Palmar. Folleto Tcnico Nm. 44. Veracruz, Mxico. 73 p.
Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT). 2010. Anuario estadstico
de la produccin forestal 2010. http://www.semarnat.gob.mx/temas/gestionambiental/
forestalsuelos/Anuarios/ANUARIO_2010.pdf. (05 de octubre de 2012).
Slater, A., N. Scott and M. Fowler. 2008. Plant biotechnology, the genetic manipulation of plants (2nd ed.).
Oxford University Press. Oxford, UK. pp. 37-53.
Snook, L. K., V. S. Jimenez, M. C. Mundo, C. C. Rivas, F. M. Ek, P.M. Kantn and C. E. Ruz. 2003.
Managing natural forests for sustainable harvests of mahogany (Swietenia macrophylla):
experiences in Mexicos community forests. Unasylva 214/215, Vol. 54:68-73.
Snook, L. K., L. Cmara-Cabrales, and M. J. Kelty. 2005. Six years of fruit production by mahogany
trees (Swietenia macrophylla King): patterns of variation and implications for sustainability.
Forest Ecol Manag 206(1): 221-235.
Sotolongo, R. y L. M. Medina. 1998. Callognesis in vitro del hbrido de caoba (S. macrophylla x
S. mahogani), Resmenes del III Congreso Latinoamericano de Biotecnologa Vegetal
REDBIO 98, La Habana, Cuba. s/p.
Tacoronte, M., M. Vielma, A. Mora & C. Valecillos. 2004. Propagacin in vitro de caoba (Swietenia
macrophylla King) a partir de yemas axilares. Acta Cientfica Venezolana 55: 7-12.
Thorpe, T.A. e I.S. Harry. 1991. Clonal propagation of conifers. Plant tissue culture manual. C3.
Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. pp.1-16.
Thorpe, T. A., I.S. Harry and P. P. Kumar. 1991. Application of micropropagation to forestry. In:
Debergh, P. C. and R. H. Zimmerman Eds. Micropropagation. Kluwer Academic Publishers.
Dordrecht, The Netherlands. pp. 311-336.
Thorpe, T.A., and K. Patel. 1984. Clonal propagation: adventitious buds. In: Vasil, K. Ed. Cell culture
and somatic cell genetics in plants, Vol. 1. Academic Press, Inc. New York, NY USA. pp. 49-60.
Tropicos.org. Missouri Botanical Garden. http://www.tropicos.org 1(6 Jan 2013)
Wightman, K., B. Rodrguez Santiago, S. Ward, and J. Cornelius. 2005. Domestication of Spanish
cedar and mahogany in the Yucatan Peninsula of Mexico: experiences in forest tree
germplasm improvement. Recursos Naturales y Ambiente 44: 119-128.
70
ANEXOS
71
72
2.
Se agregan 30 g de D-sacarosa y los componentes del medio MS(4.33 g), se agita hasta que
se disuelva.
3.
Se ajusta el pH a 5.7.
4.
Se afora a 1 litro.
5.
Se agrega el agar y se calienta con agitacin hasta disolver, permitir la ebullicin al menos
dos veces.
6.
Se vierten 7 ml de medio cultivo por cada tubo, o 30 ml por cada frasco tipo Gerber.
7.
Obtencin de Explantes.
1.
Con tijeras estriles se corta una rama desde la base, la rama debe de contar con un tallo
principal no lignificado y dos yemas auxiliares y un pice.
2.
Se separan las hojas sin eliminar la base del peciolo para no maltratar las yemas.
3.
Se recortan los tallos de forma que no se afecten las yemas pero que se puedan sumergir en
frascos con antioxidante.
4.
Lavado.
1.
Se elimina el antioxidante.
2.
Lavar con jabn lquido y con un cepillo o escobilln. Con movimientos suaves se talla toda la
superficie del tallo. Repetir 3 veces.
3.
Desinfeccin.
1.
Sumergir el tejido en alcohol al 70% durante 1 minuto con agitacin contnua. Eliminar el
alcohol.
2.
3.
Siembra.
Se desinfecta la mesa o campana de cultivo tallando con algodn y alcohol al 70%. Se desinfecta
el cuarto de siembra con luz UV durante 15 minutos.
El tejido se extrae del captan y se coloca en cajas de Petri estriles.
Se cortan secciones del tallo, de tal forma que cada una contenga un nudo con las yemas auxiliares
en la parte media del explante.
73
1.-Material y equipo
Cristalera
Matraces Erlenmeyer de 1000 ml
Probetas de 1000 ml
Vasos de precipitado de 1000 ml
Matraz aforado 100 ml
Frascos tipo Gerber o ISO para cultivo in vitro
Tubos para cultivo in vitro
Tapas de plstico esterilizables para frascos o tubos
Equipo
Material
Guantes de cocina de tela o para sujetar objetos calientes.
Papel de Aluminio
Plstico Egapac o Parafilm
Servitoallas o sanitas
Tijeras estriles
Reloj o cronmetro
Cepillo pequeo o escobilln de preferencia estril.
Guantes de plstico
Otros
Detergente lquido
74
Stock
ml/l
(g/100 ml)
Macronutimentos
(100X)
NH4NO3
1650
165
K NO3
1900
190
CaCl22H2O
440
44
MgSO47H2O
370
37
KH2PO4
170
10 ml
17
Micronutrimentos
(1000X)
H3BO3
6.2
6.2
ZnSO4H2O
8.6
8.6
CuSO45H2O
0.025
0.025
KI
0.83
0.83
CoCl26H2O
0.025
0.025
MnSO44H2O
22.3
22.3
NaMoO42H2O
0.25
0.25
Fe/EDTA
1 ml
(100X)
FeSO47H2O
27.8
2.78
Na2EDTA2H2O
37.3
3.73
10 ml
Compuestos orgnicos
Myo-inositol
100
Niacina
0.5
0.05
PiridoxinaHCl
0.5
0.05
TiaminaHCl
0.1
0.01
Glicina
Sacarosa
Agar
2
30000 (30g/l)
10 ml
0.2
Se pesa y adiciona al momento
8000 (8g/l)
75
Stock (g/100ml)
Macronutimentos
NH4NO3
400
40
Ca(NO3)2
386
38.6
CaCl22H2O
72.5
7.25
MgSO4, Anhidro
180.7
18.7
KH2PO4
170
10 ml
17
Micronutrimentos
H3BO3
ml/l
(100X)
(1000X)
6.2
6.2
ZnSO4H2O
8.6
8.6
CuSO45H2O
0.25
0.25
KI
0.83
0.83
CoCl26H2O
0.025
0.025
MnSO44H2O
22.3
22.3
NaMoO42H2O
0.25
0.25
Fe/EDTA
1 ml
(100X)
FeSO47H2O
27.8
2.78
Na2EDTA2H2O
37.3
3.73
10 ml
Compuestos orgnicos
Myo-inositol
100
Niacina
0.5
0.05
PiridoxinaHCl
0.5
0.05
TiaminaHCl
0.1
Glicina
0.2
Sacarosa
Agar
30000
(30g/l)
8000 (8g/l)
76
78
79
80
ABREVIATURAS
gramos
miligramos
metro
centmetro
milmetro
litro
mililitro
hectrea
libras
Medio Papa Dextrosa Agar
Medio Murashigue y Skoog
Medio Woody Plant Medium
cido 2,4-Diclorofenoxiactico
g
mg
m
cm
mm
l
ml
ha
lb
PDA
MS
WPM
2,4-D
81
82
generacin de callo
83
84
85
86