MINISTERIO PBLICO DE LA NACIN

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FORENSES

LABORATORIO DE GENETICA FORENSE

PNT N 10

Aislamiento de ADN a partir de huesos por el mtodo

fenol-cloroformo Microcon 100

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Objetivos:
Extraccin y aislamiento de ADN a partir de huesos.
Muestras:
Huesos.
Tcnica:
Mtodo de extraccin de ADN con fenol-cloroformo.
Fundamento:
Este mtodo se fundamenta en la rotura de las membranas celulares por accin de la
proteinasa K y purificacin del ADN libre mediante una mezcla de fenol-cloroformo
(fase orgnica) que elimina los lpidos y gran parte de las protenas desnaturalizadas,
encontrndose el ADN soluble en la fase acuosa y su posterior concentracin en unos
filtros que permiten el paso de molculas de tamao menor al ADN.
Equipos:

Microcentrfuga
Freezer Mill.
Urna de metacrilato.
Minitaladro tipo DREMEL.
Campana de extraccin.
Bao Mara.
Vortex
Nanofuga.

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Aislamiento de ADN a partir de huesos por el

mtodo fenol-cloroformo

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Reactivos:

Buffer de extraccin.
Proteinasa K
Nitrgeno lquido.
Mezcla: Fenol-cloroformo-alcohol isoamlico.

Material de laboratorio:

Tubos de 1,5 ml de capacidad

Tubos Falcon de 15 ml de capacidad
Cepillo.
Micropipetas de 1000 ul, 200 ul y 20 ul.
Puntillas con filtro para 1000 ul, 200 ul y 20 ul.

Procedimiento:
1. Seleccionar la pieza sea a analizar.
2. Limpiar la superficie del hueso con un minitaladro tipo Dremel.
3. Pulverizar el diente o hueso con el equipo Freezer Mill, en presencia de
nitrgeno lquido.
4. Al pulverizado aadir 300 ul de Buffer y 20 ul de proteinasa K.
5. Llevar a incubacin por 18 a 24 horas a 56 C.
6. Aadir 600 ul de fenol-cloroformo-alcohol isoamlico.
7. Centrifugar a mxima velocidad por 3 minutos.
8. Trasvasar la fase superior (acuosa) a un nuevo tubo Microcon 100 de 1,5
ml. Previamente a este colocar 100 ul de agua estril.
9. Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 25 minutos.
10. Aadir 200 ul de agua estril y centrifugar a 2500 r.p.m. por 20 minutos.
11. Aadir 100 ul de agua estril para recuperar.

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12. Volcar el filtro sobre un nuevo tubo de 1,5 ml.

13. Centrifugar a 3500 r.p.m. por 5 minutos.
14. Quitar y desechar el filtro, dejando el lquido en el tubo donde se encuentra el
ADN.
15. Si no se va a procesar en ese momento guardar al refrigerador a 4 C a
20 C.
16. Cuantificar el ADN por electroforsis en gel de agarosa

Resultado:
P.N.T. N 11.

Bibliografa:
Protocolos de trabajo, Laboratorio de Identificacin Gentica, Departamento de
Medicina Legal y Toxicologa, Universidad de Granada Espaa.
Luque Cabrera Jos, Fernndez Snchez ngel. Biologa Molecular e Ingeniera
Gentica. Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. 1ed. 2001.
Harcourt. S.A.
Begoa Jarreta, Fabricio Gonzles, Tcnicas instrumentales en Gentica Forense. 1
ed; 2001. Fernando el Catlico.

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