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de Salmonella
en Huevos y
Pollo
Por
2012-36871
OBJETIVOS
FUNDAMENTO TEORICO
El gnero Salmonella est compuesto por bacilos Gram negativos aerobios facultativos.
Algunos de los cuales, son responsables de una enfermedad bacteriana denominada
salmonelosis. La salmonelosis humana es una de las principales zoonosis de transmisin
alimentaria tanto a nivel mundial como a nivel europeo y nacional y provoca graves
consecuencias econmicas, sociales y sanitarias.
Los huevos de gallina recin puestos no suelen estar contaminados, s bien algunos
microorganismos pueden ganar acceso a stos a travs del oviducto. Los microorganismos
presentes en el interior del huevo proceden principalmente del tracto intestinal de las aves,
el ponedero, el polvo, las cajas de embalaje y almacenamiento, etctera, y pueden penetrar
a travs de los poros del cascarn si ste se encuentra caliente y se contamina con materia
fecal fra, entonces los grmenes pasan al interior, conforme este territorio se va
enfriando.
Entre los microorganismos productores de infecciones alimentarias que pueden estar
presente en el huevo se encuentran Salmonella spp u otras Enterobacterias.(Viora S,
Barrios H, Ferraroti J, Anselmo RJ. Estudio de un brote familiar de origen alimentario
por Salmonella enteritidis. Memorias de la Conferencia Internacional sobre Ciencia y
Tecnologa de los Alimentos. La Habana, 1994).
En los ltimos aos en algunos pases se han incrementado los casos de infecciones
alimentarias por el consumo de huevo contaminado con Salmonella; en Espaa a partir de
1978 se han incrementado las infecciones debidas a Salmonella enteritidis asociada con
huevos o con productos elaborados a base de huevo como la mayonesa.En los Estados
Unidos huevos de gallinas infectados fueron responsables de varios informes de
infecciones en el humano por Salmonella enteritidis entre 1976 y 1986, y en Inglaterra
tambin ha sido implicada la Salmonella enteritidis PT4 y laSalmonella typhimurium en
brotes por medio del huevo.
Por todo lo antes expuesto y por ser la salmonelosis la segunda causa de infeccin
alimentaria en Cuba y la primera en el mundo,realizamos el presente trabajo para conocer
el grado de contaminacin del huevo por Salmonella y la calidad sanitaria de este
alimento.
huevo con
salmonella
MATERIAL Y METODO
3.1. Aparatos
y material
Agua desmineralizada
Agua de peptona tamponada APT Alcohol de 70
Galeras API 20E (Biomerieux) y reactivos
Kit Vidas Inmuno-Concentracin Salmonella II (ICS2) Medio de enriquecimiento
selectivo Selenito
Medios slidos selectivos en placa: Agar SM-ID, Agar Hecktoen (HE), Agar
xilosa lisina desoxicolato (XLD).
Parafina
Solucin salina estril
3.3. Muestras
PROCEDIMIENTO
Huevos:
El anlisis de los huevos puede realizarse con o sin esterilizacin de la cscara.
Para la deteccin de la flora total (cscara+yema+clara) no es necesario esterilizar los
huevos antes de abrirlos. Los huevos se abren utilizando tcnicas aspticas y se introduce
la cscara y su contenido en un recipiente estril.
Para la deteccin de la flora interna (yema+clara) es necesaria la esterilizacin. Para ello,
se quita cualquier suciedad de la cscara con un pao y agua. Utilizando una toallita
empapada en alcohol al 70% se limpia toda la superficie y se deja secar completamente
sin contaminacin. A continuacin, se rompe el huevo y se abre aspticamente
introduciendo el contenido en un recipiente estril.
Pesada de la muestra
Se pesan 25 gramos de cada muestra en bolsas estriles del masticador (previa tara) para
evitar contaminacin en su manipulacin.
La porcin de muestra a analizar se introduce en la bolsa del masticador utilizando
material de trabajo estril y flameado entre operacin y operacin.
Evitar manipular la muestra en el interior de la bolsa si la cantidad pesada no se ajusta
exactamente a la especificada (excepcionalmente hasta el 5%). Si la diferencia es mayor
manipular la muestra con el mayor cuidado posible.
Adicin del diluyente y preenriquecimiento
2. ENRIQUECIMIENTO
Inmunoconcentracin en MiniVidas
Sacar los reactivos necesarios de la nevera (Vidas Inmuno-Concentracin Salmonella
ICS) y dejar atemperar 30 minutos. Utilizar un cartucho cdigo ICS y un cono ICS
para cada muestra.
Homogenizar mediante agitacin las muestras y el estndar a analizar y transferir
aspticamente mediante pipeta con punta estril 0.8ml del caldo de preenrequecimiento
(sustituir por el estndar cuando se efecte la calibracin) al pocillo 4 para realizar la
inmunoconcentracin. Las puntas de pipeta estriles son de un nico uso, cambiar entre
cada muestra.
Colocar en el sistema los conos y los cartuchos y programar las muestras. Iniciar el
anlisis (ejecucin automtica). La etapa de inmunoconcentracin se completa en 40
minutos aproximadamente.
*Nota: Las muestras inmunoconcentradas deben ser utilizadas en la media hora que sigue
a la finalizacin del test.
Enriquecimiento selectivo en Selenito
Homogenizar mediante agitacin las muestras y transferir mediante pipeta estril 1ml del
caldo de preenrequecimiento en un tubo con 9ml de Selenito.
Incubar los tubos a 43 1C durante 20 4 horas.
Las colonias tpicas de Salmonella cultivadas en Agar Hektoen (HE) son verdes con el
centro negro; verdes sin centro negro (no productoras de sulfhdrico) amarillas con
centro negro (lactosa positivas).
Las colonias tpicas de Salmonella en Agar XLD son de color de rosa a rojo con o sin
centro negro.
Las colonias tpicas de Salmonella en SM son de color de rosa a veces con un contorno
incoloro.
4. PRUEBAS BIOQUIMICAS
Es necesaria siempre la confirmacin de las colonias sospechosas.
Para realizar la confirmacin bioqumica vamos a utilizar un test bioqumico para
Enterobacteriaceae de la galera API 20E. (ver Anexos)
Este tipo de tests incluyen una batera de pruebas bioqumicas que nos permiten reducir el
tiempo y el trabajo necesario para la realizacin de cada uno de los anlisis.
Seleccionar una colonia considerada tpica o sospechosa (preferentemente con aspecto
morfolgico diferente) en cada placa.
Resuspender cada colonia en agua salina y realizar un test bioqumico para
Enterobacteriaceae de la galera API 20E para cada muestra.
Incubar a 36 2C durante 18-24 horas.
2 horas.
1C durante
Id
Placa HE
API 20E
M1
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M2
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M3
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M4
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M5
Ausencia de colonias
Ausencia/25gr
10
M6
Ausencia de colonias
Ausencia/25gr
Tabla1. Resultados de las muestras individuales.
Los resultados de las muestras de huevos indican que no estn contaminados con
Salmonella ni con otros microorganismos ya que en las placas tampoco han crecido otras
colonias.
Verificacin del inculo
Para verificar el inculo se siembran 3 placas de medio Hecktoen con 0,1ml de la dilucin
-6
10 . Tras la incubacin se hace el recuento de las colonias de cada placa y se obtienen los
siguientes resultados.
Placa HE
Recuento de colonias
22ufc/0,1ml
2
23ufc/0,1ml
3
15ufc/0,1ml
Tabla2. Recuento de las colonias de Salmonella
11
El inculo que hemos utilizado para realizar la validacin del mtodo de anlisis de
-6
-6
-6
20ufc
0,1ml
20ufc
0,1ml
x
0,02ml
x
0,008ml
x = (20x0,02) / 0,1 = 4ufc
x = (20x0,008) / 0,1 = 1,6ufc
Segn los resultados obtenidos al ajustar la concentracin del inculo las muestras fueron
inoculadas con 4ufc y los duplicados con 1,6ufc.Las muestras y sus duplicados se
analizaron mediante una inmunoconcentracin y un mtodo tradicional de
enriquecimiento selectivo en Selenito.
Inmunoconcentracin
12
Id
Placa HE
Placa XLD
Placa SM
API E20
M1.1
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
13
M2.1
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M3.1
14
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M4.1
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
15
M5.1
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
16
M1.2
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M2.2
17
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M3.2
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
18
M4.2
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
19
M5.2
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
20
Id
Placa HE
API E20
M1.1
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
21
M5.1
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
M1.2
Colonias sospechosas
22
Presencia/25gr
M5.2
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
Como era de esperar tras la inoculacin el resultado de todas las muestras ha sido positivo
para Salmonella.
23
Muestras compuestas
Las muestras compuestas estn formadas por la combinacin de las muestras sin inocular
con las muestras y duplicados inoculados con Salmonella.
Se analizaron por inmunoconcentracion y por el mtodo tradicional con enriquecimiento
selectivo en selenito obteniendo los siguientes resultados:
Inmunoconcentracin
Id
Placa HE
Placa SM
API E20
24
T1
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
25
T2
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
T3
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
26
T4
Colonias sospechosas
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
27
Id
Placa HE
API E20
T1
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
28
T2
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
T3
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
29
T4
Colonias sospechosas
Presencia/25gr
Todas las muestras compuestas fueron positivas para Salmonella y adems, se obtuvieron
los mismos resultados por inmunoconcentracin y por el mtodo tradicional.
30
CONCLUSIONES
Hemos validado una estrategia de analisis de salmonella en el huevo y pollo que permita
garantizar la fiabilidad del producto con el fin de aplicarlo en granjas y mataderos de
pollos ya que los huevos y los productos derivados del huevo constituyen el principal
vehculo de las salmonelosis humanas aunque la venta de alimentos con presencia de de
Salmonella est prohibida es muy importante extremar las precauciones a la hora de
manipular los alimentos en casa porque, como se ha comprobado en este estudio, puede
haber productos de venta al pblico con Salmonella.
Se logra aislar la Salmonella incluso cuando se combinan 4 muestras negativas con una
muestra positiva inoculada con <2ufc/ml (5 veces por debajo del lmite de deteccin
utilizado en la validacin habitual de las tcnicas de deteccin).
31
BIBLIOGRAFIA
32
Cdigo de
33
identificacin
Descripcin
M1
Pechuga de pollo
M2
Contramuslo de pollo
M3
Zanco de pollo
M4
Ala de pollo
34
M5
Huevo (yema + clara)
M6
Huevo completo
35
36
37
38
Cdigo de
identificacin
Muestra
Inculo
39
M1.1
M1
<5ufc
M2.1
M2
<5ufc
M3.1
M3
<5ufc
40
M4.1
M4
<5ufc
M5.1
M5
<5ufc
M1.2
M1
<2ufc
M2.2
41
M2
<2ufc
M3.2
M3
<2ufc
M4.2
M4
<2ufc
M5.2
M5
42
<2ufc
43
Cdigo de
identificacin
44
Muestras combinadas
T1
M1 + M2 + M5 + M3 + M1.1
T2
M5 + M2 + M4 + M3 + M5.1
T3
45
M2 + M1 + M4 + M5 + M1.2
T4
M1 + M3 + M5 + M4 + M5.2
46
47