Alcantar 2005 PDF

CENTRO DE INVESTIGACIN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD DE BIOTECNOLOGA E INGENIERA GENTICA DE PLANTAS
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGA Y BIOQUMICA
Identificacin y cuantificacin de metabolitos secundarios

en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) transformadas con sistemina
y prosistemina de jitomate en respuesta a dao mecnico, herbivora con
Manduca sexta e infestacin con mosquita blanca (Bemisia tabaci).
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN:
BIOTECNOLOGA DE PLANTAS
PRESENTA:
I.B. Flor Citlally Alcntar Aguirre
DIRECTOR DE TESIS:
DR. JOHN PAUL DLANO FRIER
IRAPUATO, GUANAJUATO
DICIEMBRE DE 2005
DEDICATORIAS
A mi nana Lolita: por recordarme su gran fortaleza de lucha y amor a la vida, por tus
cuidados, atencin, amor tierno y sonrisa que me regalabas en cada regreso.
A ti madre: por darme lo mejor de ti, por otorgarme tu apoyo y confianza, por estar
siempre conmigo.
A mis hermanos, David, Amrica Anah y Daryl Ivan: por sus grandes cualidades y
enseanzas.
A mis pequeos sobrinos, Sebastin y Carlos: por mantener con gran alegra la
casa de la abuela.
A Humberto Valenzuela Soto, por su apoyo incondicional en todo momento.
A mis queridas tas y primas, que me han alentado en este camino.
A mis amigas de la infancia: por encontrarnos siempre con gusto y cario a pesar
de la distancia.
AGRADECIMIENTOS
A Dios: por permitirme alcanzar este anhelo, por ser el nico y verdadero camino de
vida.
A mi asesor, Dr. John Pal Dlano Frier: por su aceptacin en su laboratorio,
paciencia, constante dedicacin y consejos otorgados durante mi estancia; gracias.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT): por el apoyo econmico
otorgado a travs de la beca con nmero de registro 174677.
A los doctores Jorge Molina Torres y Neftal Ochoa Alejo: por formar parte del
comit evaluador, como por su crtica constructiva y sugerencias que aportaron al
presente trabajo de tesis.
A la Q.F.B. Norma Martnez Gallardo: por su experiencia e invaluable apoyo para
concluir este trabajo; mil gracias.
Al Q.F.B. Enrique Ramrez Chvez: por sus consejos y aporte metodolgico en la
identificacin de metabolitos secundarios.
A la Dra. Ma. Del Carmen Rocha Granados: por su buena disponibilidad en el
trayecto de este trabajo.
A la Q. Yolanda Rodrguez Aza y Mara Isabel Cristina Elizarraraz Anaya: por su
atencin y tiempo recibido.
Al I.A. Javier Luevano Borroel: por su buena disponibilidad y consejos en el manejo
de M. sexta.
A mis amigos y compaeros de laboratorio: Carla, Humberto, Gloria, Hamlet y
Miriam, por su gran solidaridad, apoyo y palabras alentadoras en tiempos difciles;
por esos momentos de alegra que pasamos.
A todos mis compaeros de generacin: Victor, Pedro, Frank, Marco, Alfredo,
Javier, Gloria, Amparo y Cecilia.
A Nancy Barojas Prez: por la amistad que se form entre nosotras, por
escucharme y aconsejarme despus de un mal momento.
A mi amigo Carlos Montoya: por compartirme su experiencia y apoyo en momentos
difciles.
El presente trabajo de tesis fue realizado en el

Laboratorio de Fisiologa de la Defensa, del
Departamento de Biotecnologa y Bioqumica
de Plantas del CINVESTAV- IPN, Unidad de
Biotecnologa e Ingeniera Gentica de Plantas,
bajo la asesora del Doctor John Pal Dlano Frier.
NDICE GENERAL
Pg.
ABREVIATURAS
NDICE DE FIGURAS
iii
RESUMEN
1. INTRODUCCIN
2. ANTECEDENTES
2.1. Mecanismos de defensa
2.1.1. Tipos de respuestas de defensa en planta
2.1.1.1. Respuesta innata y respuesta especfica, gen por gen.
2.1.1.2. Respuesta local
2.1.1.3. Respuesta sistmica
2.2. Mecanismos de defensa en tabaco
10
2.3. Respuestas de resistencia en plantas contra el ataque de plagas
13
2.3.1. Inhibidores de proteasas
13
2.3.2. Polifenol oxidasas
14
2.3.3. Oligosacridos
15
2.4. Sistemina
16
2.4.1. Actividad y translocacin de sistemina
17
2.4.2. Modelo de la ruta de sealizacin activada por sistemina
20
2.4.3.Glicopptidos ricos en hidroxiprolina (sisteminas) de tabaco
22
(TobHypSys)
2.5. Prosistemina
25
2.5.1. Expresin y supresin de la actividad de la prosistemina
26
2.5.2. Homologa de la prosistemina de jitomate en plantas solanceas
28
2.6. Metabolitos secundarios en tabaco
30
2.6.1. Alcaloides (nicotina, nornicotina)
31
2.6.2. Compuestos fenlicos
33
2.6.3. Terpenos
34
2.7. Modelo de estudio

2.7.1. Plantas de tabaco transformadas con prosistemina y sistemina
37
37
de jitomate Nt -LePS 08, Nt -LeSYS 03 y la cruza WT X Nt -LeSYS 03

2.7.2. Alteraciones morfolgicas y fisiolgicas en la lnea Nt -LeSYS
39
2.7.3. Resistencia a herbivora por larvas de Manduca sexta en plantas
43
03
Nt-LePS y Nt -LeSYS
3. HIPTESIS
46
4. OBJETIVOS
47
4.1. Objetivo general
47
4.2. Objetivos especficos
47
5. MATERIALES Y MTODOS
48
5.1. Cultivo de plantas
48
5.2. Cultivo in vitro de la lnea Nt -LeSYS 03
48
5.3. Preparacin de X-Gluc
49
5.4. Ensayos de dao mecnico
50
5.5. Bioensayos
51
5.5.1. Condiciones del experimento de herbivora con Manduca sexta
51
5.5.2. Infestacin con mosquita blanca (Bemisia tabaci)
52
5.6. Preparacin de extractos
52
5.7. Anlisis de fenoles totales
53
5.8. Condiciones para cuantificar e identificar metabolitos secundarios por
53
GC/MS
5.8.1. Derivatizacin
53
5.8.2 Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas
54
(GC/MS)
5.9. Curvas de calibracin
54
5.10. Anlisis estadstico
55
6. RESULTADOS
56
6.1. Identificacin de metabolitos secundarios de inters por GC/MS, en
56
plantas jvenes y adultas.

6.2. Cuantificacin de nicotina en plantas jvenes y/o adultas
67
6.2.1. Tratamiento: dao mecnico
67
6.2.2. Tratamiento: herbivora por larvas de M. sexta (plantas adultas)
68
6.2.3. Tratamiento: infestacin por mosquita blanca (plantas adultas)
70
6.3. Cuantificacin de cido clorognico en plantas jvenes y/o adultas
72
72
78
78
6.4. Cuantificacin de dihidrocapsenona en plantas jvenes y/o adultas
80
80
83
87
6.5. Cuantificacin de cido nornicotina en plantas jvenes y/o adultas

6.6. Cuantificacin de fenoles totales en plantas jvenes y/o adultas
88
88
92
92
93
96
7. DISCUSIN DE RESULTADOS
98
8. CONCLUSIONES
113
9. PERSPECTIVAS
114
10. BIBLIOGRAFA
116
11. APNDICE
132
ABREVIATURAS
aa
Aminocidos
ABA
cido abscsico
ACG
cido clorognico
AJ
cido jasmnico
AMPC
Adenosina Monofosfato Cclica
AOC
Ciclasa de xido de aleno
AS
cido saliclico
Avr
Gen de Avirulencia
C-F
Consumidor - Fuente
cm
Centmetro
FAL
Fenilalanina amonio liasa
EAS
5-epi-aristoloqueno sintasa
Et
Etileno
Gramo
GC/MS
Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de

masas
GRHP
Glicoprotenas ricas en hidroxiprolina
GTP
Guanidina trifosfato
FPP
Farnesil bifosfato
HDJ
Hoja distal joven (apical)
HDV
Hoja distal vieja (basal)
HL
Hoja local (daada)
Hora
HS
Hoja sistmica
IP
Inhibidor de proteasa
JA
Jasmonato
Litro
LOX
Lipooxigenasa
i
MB
Mosquita blanca
MeJA
ster metlico del cido jasmnico
mg
Miligramo
ml
Mililitro
ng
Nanogramo
NN
Nornicotina
OGA
Oligosacridos
PF
Peso fresco
PFO
Polifenol oxidasa
PG
Poligalacturonasa
Pin II
Inhibidor de proteasa II
Gen de Resistencia
RH
Respuesta hipersensible
RP
Relacionadas a patognesis
rpm
Revoluciones por minuto
RSA
Resistencia sistmica adquirida
RSI
Resistencia sistmica inducida
Microgramo
Microlitro
ii
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1. Reconocimiento del ataque de M. sexta por N. attenuata;
12
incremento de los niveles de AJ y etileno (Et), e induccin de defensas

directas e indirectas (modificado de Baldwin et al., 2003).
Figura 2. Estructura primaria de la sistemina de jitomate.
17
Figura 3. Efecto de la sustitucin de cada uno de los 18 aminocidos de
18
la sistemina de jitomate, por alanina, sobre la induccin de la sntesis de

inhibidores de proteasa tipo I en hojas de jitomate.
Figura 4. Modelo hipottico de la ruta de transduccin de seales en
21
clulas de jitomate activada por sistemina.

Figura 5. Estructura primaria de la sistemina de jitomate y de los
23
glicopptidos ricos en hidroxiprolina presentes en jitomate (TomSys y

TomHypSys I, II y III) y tabaco (TobHypSys I y II), respectivamente.
Figura 6. Actividad de TobHypSys I y TobHypSys II sintticas, carentes
25
de modificaciones con cadenas de oligosacridos y con sustituciones de

alanina en cada uno de sus aminocidos.
Figura 7. Niveles de inhibidores de proteasas I y II en plantas de jitomate
27
sin transformar (1) y transformadas (2) con el transgen de la prosistemina

en orientacin sentido.
Figura 8. A) Acumulacin de inhibidores de proteasas en hojas de

jitomate tratadas con distintas concentraciones de
29
prosisteminas
recombinantes. B) supresin de inhibidores de proteasas en hojas de

iii
jitomate
tratadas
con
distintas
concentraciones
de
prosisteminas
recombinantes (Dombrowski et al., 1999).
Figura 9. Estructura de la nicotina y nornicotina.
32
Figura 10. Estructuras de compuestos fenlicos involucrados en defensa.
34
Figura 11. Estuctura del capsidiol y su producto de degradacin,
36
dihidrocapsenona, y otros terpenos involucrados en defensa.
Figura
12.
Niveles
de
inhibidores
de
tripsina
(IT),
PFO
38
poligalacturonasas (PG), inducibles por dao en hoja local (HL) y hoja

sistemica (HS) en hojas de tabaco silvestres (Wt), y en plantas
transformadas con LePS y LeSYS.
Figura 13. I. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con
40
sistemina de jitomate (Nt-LeSYS).
Figura 14. II. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con
41
sistemina de jitomate (Nt-LeSYS).
Figura 15. III. I. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas
42
con sistemina de jitomate (Nt-LeSYS).
Figura 16. Larvas de Manduca sexta antes y 6 das despus de haber
44
sido alimentadas con plantas de tabaco sin transformar y con plantas NtLePS y Nt-LeSYS.
Figura 17. Anlisis del crecimiento de larvas de M. sexta alimentadas con
44
plantas sin transformar y plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS.

iv
Figura 18. Vista general de la magnitud del dao causado por larvas de
45
M. sexta en plantas de tabaco sin transformar (control) y transformadas

(Nt-LePS y Nt-LeSYS).
Figura
19.
Cromatograma
tpico
obtenido
al
separar
extractos
57
metanlicos derivatizados de hoja de Nicotiana tabacum por GC/MS. La

nicotina emergi despus de 15.83 min (*); timol despus de 15.71 min
(*);
nornicotina despus de 20.05 min (*); el posible producto de
degradacin del capsidiol (capsenona) despus de 32.78 min (*), y el

cido clorognico despus de 48.83 min (*).
Figura 20. a) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de nicotina,
58
con un tiempo de retencin de 15.80 min (*), y b) su correspondiente

espectro de masas.
Figura 21. a) Cromatograma tpico de GC/MS de un extracto de hojas de
59
Nicotiana tabacum, identificando a nicotina con un tiempo de retencin de

15.83 min (*), y b) su correspondiente espectro de masas.
Figura 22.
a) Cromatograma de GC/MS del estndar puro del cido
clorognico, con un tiempo de retencin de 48.90 min (*), y b)
60
su
espectro de masas.
61
Nicotiana tabacum, identificando al cido clorognico con un tiempo de

retencin de 48.83 min (*), y b) su correspondiente espectro de masas.
Figura 24. a) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de capsidiol
62
[32.35 min (*)] derivatizado y un producto de degradacin estable

posiblemente dihidrocapsenona, con un tiempo de retencin de 32.18
min (*), y b) el espectro de masas correspondiente al pico surgido a los
32.18 min.
Figura 25. a) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de capsidiol
63
[32.35 min (*)] derivatizado y un producto de degradacin estable

posiblemente dihidrocapsenona, con un tiempo de retencin de de 32.18
min (*), y b) el espectro de masas correspondiente al pico surgido a los
32.35 min.
64
Nicotiana tabacum, identificando a un posible producto de degradacin

del capsidiol con un tiempo de retencin de 32.78 (*), y b) su
correspondiente espectro de masas.
Figura 27. a) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de nornicotina
65
derivatizado, con un tiempo de retencin de 20.54 min (*), y b) su

Figura 28. a) Cromatograma tpico de GC/MS de un extracto metanlico
66
derivatizado de hojas de Nicotiana tabacum, identificando a la nornicotina

con un tiempo de retencin de 20.57 min (*), y b) su correspondiente
espectro de masas.
Figura 29. Niveles de nicotina en plantas (jvenes y adultas) WT y
69
transgnicas intactas (0 h) y cinco das despus de haber sido sometidas

a dao mecnico (5 da). Los asteriscos indican la diferencia
estadsticamente significativa (P 0.05*; P 0.01 **).
Figura 30. Comparacin entre los niveles de nicotina en plantas WT y
71
transgnicas adultas, 5 das despus de haber sido expuestas a

herbivora por larvas de M. sexta durante 24 h. Los asteriscos indican la
diferencia estadsticamente significativa (P 0.05*; P 0.01 **).
vi
73
transgnicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia

tabaci (28 das despus de la oviposicin). Los asteriscos indican la
Figura 32. Niveles de cido clorognico en plantas (jvenes y adultas)
77
WT y transgnicas intactas (0 h) y cinco das despus de haber sido

sometidas a dao mecnico (5 da). Los asteriscos indican la diferencia
Figura 33. Comparacin entre los niveles de cido clorognico en plantas
79
WT y transgnicas adultas, 5 das despus de haber sido expuestas a

herbivora por larvas de M. sexta durante 24 h. Los asteriscos indican la
Figura 34. Comparacin entre los niveles de cido clorognico en plantas
81
WT y transgnicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de

Bemisia tabaci (28 das despus de la oviposicin). Los asteriscos indican
la diferencia estadsticamente significativa (P 0.05*; P 0.01 **).
Figura 35. Niveles de capsidiol (cuantificado indirectamente en forma de
84
un posible producto de degradacin) en plantas (jvenes y adultas) WT y

transgnicas intactas (0 da) y cinco das despus de haber sido
sometidas a dao mecnico (5 da). Los asteriscos indican la diferencia
Figura 36. Comparacin entre los niveles de capsidiol (cuantificado
86
indirectamente en forma de un posible producto de degradacin), en

plantas WT y transgnicas adultas, 5 das despus de haber sido
expuestas a herbivora por larvas de M. sexta durante 24 h. Los
vii
asteriscos indican la diferencia estadsticamente significativa (P 0.05*; P

0.01 **).
Figura 37. Comparacin entre los niveles de capsidiol (cuantificado
89
indirectamente en forma de un posible producto de degradacin) en

plantas WT y transgnicas adultas, medidos al cumplirse el ciclo de vida
de Bemisia tabaci (28 das despus de la oviposicin). Los asteriscos
indican la diferencia estadsticamente significativa (P 0.05*; P 0.01 **).
Figura 38. Niveles de nornicotina en plantas (jvenes y adultas) WT y
91

Figura 39. Fenoles solubles totales en plantas (jvenes y adultas) WT y
94

Figura 40. Comparacin entre los niveles de fenoles totales solubles en
95
plantas WT y transgnicas adultas, 5 das despus de haber sido

expuestas a herbivora por larvas de M. sexta durante 24 h. Los
asteriscos indican la diferencia estadsticamente significativa (P 0.05*; P
0.01 **).
Figura 41. Comparacin entre los niveles de fenoles solubles totales en
97
plantas WT y transgnicas adultas, medidos al cumplirse el ciclo de vida

de Bemisia tabaci (28 das despus de la oviposicin). Los asteriscos
Figura 42. Curva de calibracin de nicotina.
132
viii
Figura 43. Curva de calibracin de c. clorognico.
133
Figura 44. Curva de calibracin de capsidiol.
134
Figura 45. Curva de calibracin de nornicotina.
135
ix
RESUMEN
Las plantas de tabaco del gnero Nicotiana (Solanaceae) contienen diversos

metabolitos secundarios. Los grupos ms importantes son los alcaloides, terpenos y
componentes fenlicos. Se sabe que la sntesis de novo de muchos de estos
compuestos se incrementa dramticamente como respuesta al dao mecnico o
ataque por herbvoros y/o patgenos y que este cambio es inducido en muchos
casos por cido jasmnico, el cual funciona como una seal mediadora de cambios
en el metabolismo secundario en respuesta a muchos tipos de agobio bitico y
abitico (Gundlach et al., 1992; Hildman et al., 1992; Reinbothe et al., 1994).
Investigaciones previas demostraron que la transformacin de plantas de tabaco (N.
tabacum) con prosistemina (LePS) y sistemina (LeSYS) de jitomate, resultaron ser
altamente resistentes a herbivora por larvas de Manduca sexta. Se sugiri que la
sobreexpresin LePS y LeSYS induce cambios en las respuestas de defensa contra
estos insectos en tabaco, entre los cuales podra incluirse la acumulacin de
metabolitos secundarios considerados como fitoalexinas o fitoanticipinas en esta
especie. As mismo, una de las lneas analizadas, la Nt-LeSYS 03, present un
fenotipo anormal caracterizado por enanismo, floracin temprana, presencia de
regiones necrticas similares a una reaccin hipersensible en la superficie de la
hoja y una germinacin muy lenta, lo cual tambin podra estar relacionado con
alteraciones en la sntesis de estos metabolitos, en particular compuestos
fenilpropanoides. Para explorar esta posibilidad, se analizaron los niveles
constitutivos e inducibles de metabolitos relacionados con defensa contra
herbvoros y/o patgenos (nicotina, nornicotina, cido clorognico, capsidiol y
fenoles solubles totales) en follaje y raz. Al analizar y cuantificar los niveles de
estos metabolitos por distintos tratamientos (dao mecnico, herbivora con
Manduca sexta e infestacin con mosquita blanca), se detectaron variaciones de
acuerdo a la etapa de desarrollo de la planta, tipo de tratamiento y genotipo.
En el tratamiento con dao mecnico en plantas adultas, los niveles de nicotina y
capsidiol, medido como uno de sus productos de degradacin ms estables
(posiblemente capsenona), fueron ms altos en las plantas transformadas que las

plantas WT (con algunas excepciones en la lnea Nt-LeSYS 03). Tambin se
detect un aumento significativo de cido clorognico (ACG) en todos los tejidos
analizados de las plantas WT. A su vez, la herbivora por larvas de M. sexta redujo
significativamente, en ocasiones a niveles no detectables, los niveles de nicotina,
nornicotina y ACG. El efecto fue particularmente marcado en las plantas
transformadas con LePS y LeSYS. La nornicotina no se detect en los diferentes
genotipos de plantas sometidos a herbivora o infestacin por B. tabaci, mientras
que el capsidiol aument considerablemente en plantas infestadas con mosquita
blanca principalmente en la lnea transgnica Nt-LePS.
Estos resultados sugieren que, de algn modo no identificado an, la expresin de
LePS o LeSYS modifica las rutas biosintticas del metabolismo secundario en
plantas de N. tabacum.
xi
I.
INTRODUCCIN
Las plantas estn continuamente expuestas a diversos cambios

ambientales, incluyendo el ataque por numerosos insectos herbvoros. El dao
mecnico o por herbvoros y la invasin por patgenos activan sistemas de
defensa de la planta. Para que stos se activen, las seales provocadas por
tales ataques son transmitidas desde el tejido daado hacia el resto de la planta
(respuesta sistmica) o son diseminadas slo localmente, induciendo cambios
en la vecindad del sitio daado (respuesta local).
Estas seales pueden
provocar reacciones de defensa y cambios especficos en la planta que

conduzcan hacia una mayor resistencia contra organismos invasores (Baldwin et
al., 1994, 1997; Walling, 2000).
Las solanceas constituyen una familia de plantas en las cuales los
diversos mecanismos de defensa empleados contra insectos dainos y
patgenos han sido estudiados con ms detalle. Un ejemplo de ello son los
diversos metabolitos secundarios que se acumulan en diferentes especies de
esta familia, ya sea constitutivamente o en respuesta a un ataque. Entre los tipos
de metabolitos ms importantes presentes se encuentran los alcaloides,
terpenos y compuestos fenlicos. Al parecer, la acumulacin de estos
metabolitos se encuentra bajo control gentico y es dependiente de las
condiciones ambientales (Tso, 1972). Los metabolitos secundarios con funcin
defensiva actan de modos tan diversos como sus estructuras. Por ejemplo, la
nicotina y los alcaloides relacionados a esta pueden funcionar como toxinas
defensivas ya que interfieren con el funcionamiento de receptores de acetil colina
en el sistema nervioso de los herbvoros (Shoji et al., 2000; Liu et al., 2005),
mientras que el cido clorognico tiene un impacto sobre la calidad nutricia de
las protenas vegetales ingeridas por insectos herbivoros debido a su capacidad
de reaccionar con aminocidos alquilatables, como la cistena, metionina,
histidina y lisina, una vez que ha sido oxidado a su forma quinoide por polifenol
oxidasas (PFO) (Felton et al., 1992; Duffey y Scout, 1996).
Se conoce que diferentes genotipos de tabaco (Nicotiana tabacum) y
especies silvestres de Nicotiana
varan en su habilidad para acumular y
almacenar nicotina (Saunders y Bush, 1979; Sinclair et al., 2004). Adems, se ha

demostrado que el ataque por insectos herbvoros en N. sylvestris y N. attenuata
incrementa dramticamente la sntesis y acumulacin de nicotina (Baldwin et al.,
1998,1999). Ahora se sabe que la acumulacin de nicotina inducida por herida
es regulada por el cido jasmnico (AJ), este ltimo se produce inicialmente en
la hoja y posteriormente transportado hacia la raz, que es el rgano dnde se
sintetiza la nicotina y de donde se distribuye al resto de la planta (Baldwin et al.,
1997; Zhang y Baldwin, 1997). En N. attenuata, el tratamiento con jasmonato
indujo la acumulacin de nicotina en la planta, la cual se relacion positivamente
con una resistencia durable hacia el herbvoro (Baldwin et al., 1998). Estos
resultados estn de acuerdo con la multiplicidad de funciones que se le han
asignado al AJ, considerado como una hormona vegetal capaz de modular, entre
otras respuestas, el metabolismo secundario en respuesta a estrs bitico y
abitico (Creelman et al., 1997). Esta capacidad fue ampliamente confirmada en
estudios en los cuales se report que la aplicacin exgena de AJ indujo la
acumulacin de una gran variedad de metabolitos secundarios en cultivos
celulares y en plantas de diversas especies, incluyendo alcaloides (Gundlanch
et al., 1992; Aerts et al., 1994) y compuestos fenlicos. (Lee et al., 1997).
Adems de la nicotina y ACG, otros reportes han mostrado una estrecha
relacin entre la sntesis y acumulacin de los diterpenos glicosilados en tabaco,
como los 16-hidroxigeranil linalool A y B, y la resistencia contra Heliothis
virescens. En concordancia con su funcin defensiva, este metabolito solo ha
sido detectado en genotipos resistentes a este herbvoro (Snook et al., 1997).
En jitomate (Lycopersicon esculentum) se descubri que la sistemina,
liberada a partir de la prosistemina, su protena precursora, es un polipptido
involucrado en la induccin sistmica de protenas en respuesta al dao, las
cuales se sugiere que confirieren resistencia contra agresores biticos. Al igual
que la respuesta al dao mecnico y a otros evocadores activos como
oligogalacturnidos derivados de la fragmentacin de la pared celular, la actividad
biolgica de la sistemina es dependiente de AJ. En un trabajo previo, del cual se
deriv la presente investigacin, se generaron plantas transgnicas de tabaco
capaces de sobreexpresar constitutivamente tanto la prosistemina (LePS) como la
sistemina (LeSYS) de jitomate. Estas plantas mostraron diferentes grados de
resistencia a herbivora por larvas de Manduca sexta, la cual curiosamente no se
2
correlacion muy claramente con la acumulacin de altos niveles de protenas

defensivas, como polifenoloxidasas (PFO), inhibidores de tripsina (IT) y
quimotripsina (IQT), solo se detectaron niveles altos en una de las lneas
sobreexpresantes de LeSYS. stas ltimas presentaron, adems, un fenotipo
severamente anmalo, caracterizado por enanismo, morfologa alterada de las
hojas y flores, floracin precoz y esterilidad (Rocha-Granados, 2004). De manera
que en este trabajo se analiz la posibilidad, previamente demostrada en otras
especies de plantas, de que la resistencia diferencial contra larvas de insectos
herbvoros as como las alteraciones morfolgicas y fisiolgicas observadas en
una de las lneas de N. tabacum sobreexpresantes de LeSYS, pudieran haberse
debido a una modificacin en la sntesis y acumulacin de metabolitos
secundarios causada por la expresin de LePS y LeSYS. Para ello, se
compararon los patrones de acumulacin de nicotina, ACG, nornicotina (NN),
dihidrocapsenona y compuestos fenlicos totales entre plantas no modificadas
(WT) y plantas transformadas en diferentes estadios de desarrollo y en respuesta
a dao mecnico o infestacin por insectos. Los resultados obtenidos indican que
la expresin de LePS y LeSYS en N. tabacum modifica el patrn de acumulacin
de metabolitos secundarios, lo que podra estar relacionado con la resistencia
diferencial observada contra larvas de insectos herbvoros, e inclusive, con el
fenotipo severo que caracteriza a una de las lneas sobreexpresantes de
sistemina (Nt-LeSYS 03).
2. ANTECEDENTES
2.1. Mecanismos de defensa
Las plantas, en su medio natural han desarrollado un gran nmero de

estrategias defensivas contra una gran variedad de organismos invasores y de
agentes abiticos causantes de una diversidad de agobios ambientales. Las
estrategias defensivas estn basadas tanto en la ereccin de barreras fsicas y
qumicas preformadas, as como en la sntesis de metabolitos defensivos en
respuesta a estmulos asociados con el organismo invasor (Ebel y Cosio, 1994).
El primer grupo lo constituyen las defensas constitutivas, las cuales se
encuentran presentes durante todo el desarrollo de la planta. stas comprenden
barreras tanto de tipo fsico como qumico incluyendo espinas, tricomas, la
cutcula superficial de la hoja y ceras protectoras de diversos rganos, as como
metabolitos secundarios existentes en plantas sanas, conocidos como
fitoanticipinas. Entre stos estn las saponinas, los glicsidos cianognicos,
cumarinas y los glucosinolatos, los cuales son txicos a atacantes no
especializados (Osbourn, 1996).
Se ha sugerido que los metabolitos secundarios, ms que subproductos
metablicos, tienen una funcin en la interaccin de las plantas con su ambiente
y otros organismos para proveer una defensa contra la infeccin, depredacin o
agobio ambiental (Rhodes, 1994). Cabe mencionar que las defensas qumicas
se dividen en dos categoras: los metabolitos secundarios y protenas (Roberts y
de Bruxelles, 2001).
Un segundo grupo lo comprenden las llamadas defensas inducibles; esto
significa que slo se producirn como respuesta al reconocimiento del organismo
agresor. Este reconocimiento requiere la interaccin entre evocadores o
inductores (compuestos liberados a partir de los organismos agresores o de las
propias plantas a causa del dao que stos les provocan) y sus receptores
especficos en las plantas (Agrawal et al., 1999). Numerosas protenas
relacionadas con defensa, cuya acumulacin es regulada por AJ y que incluyen
4
enzimas involucradas en la sntesis de alcaloides, inhibidores de proteasas,

enzimas de carcter defensivo como la polifenol oxidasa (PFO) y pptidos
antimicrobianos como las defensinas y tioninas, pertenecen al grupo de defensas
inducibles.
Las respuestas defensivas inducibles pueden activarse de manera
localizada, en el rea de dao, o bien tener efecto sistmico al activarse en la
planta completa. La eficiencia de los mecanismos defensivos depende
estrictamente de la velocidad de proliferacin del agresor y del tiempo necesario
para el reconocimiento del mismo por el husped y de la subsiguiente activacin
de las defensas (Dong, 1998). Como ejemplo de las defensas inducibles se
encuentra la sntesis y acumulacin de especies reactivas de oxgeno,
metabolitos secundarios como compuestos fenlicos, alcaloides, terpenos, etc.
(agrupados bajo el trmino fitoalexinas), enzimas hidrolticas como quitinasas y
glucanasas, y la acumulacin de protenas relacionadas con patognesis,
conocidas como protenas RP (Osbourn., 1996; Agrawal et al., 1999; Richael y
Gilchrist., 1999).
Estos tipos de mecanismos de defensa se mencionarn ms
ampliamente en los siguientes subndices.
2.1.1. Tipos de respuestas de defensa en planta
Se han identificado diversas respuestas de defensa en varias especies de

plantas empleadas como modelo de estudio. stas pueden clasificarse en tres
clases: (1) innata, la cual est involucrada en el reconocimiento y/o generacin
de seales internas de la planta, (2) local inducida, que tiene lugar en el sitio de
dao as como en la periferia de ste, teniendo efectos adversos directos sobre
el organismo agresor y (3) sistmica inducida, la cual abarca el tejido distante
y/o un rgano no afectado de la planta (Halbrock et al., 1995).
2.1.1.1. Respuesta innata y respuesta especfica, gen por gen
La respuesta innata, tambin conocida como respuesta independiente del

husped, confiere una proteccin robusta, principalmente contra patgenos. Esta
se puede expresar durante diferentes etapas del proceso invasivo del patgeno.
La primera lnea de defensa la constituyen las barreras fsicas preformadas (e.
g., tricomas y espinas) junto con caractersticas topograficas y qumicas (e. g.,
ceras) de la superficie de los tejidos vegetales, particularmente de hojas. Si estas
barreras son superadas, las plantas activan una serie de cambios de ndole
defensivo en respuesta a evocadores ampliamente reconocidos por ellas, los
cuales son liberados durante el proceso invasivo, como fragmentos de la pared
celular de plantas y hongos, y enzimas hidrolticas (e. g., celulasas, proteasas,
pectinasas). stas tambin son capaces de identificar ciertos patrones
moleculares
asociados
exclusivamente
con
patgenos
(PMAP),
como
glicoprotenas y polipptidos derivados de stas (e. g., el pptido PEP-13 que se

genera a partir de una transglutaminasa de Phytophthora sojae), componentes
del flagelo y lipopolisacridos de bacterias Gram negativas, peptidoglicanos y
cido lipoteico de bacterias Gram positivas, fragmentos de ADN no metilados,
protenas bacterianas (e. g., harpinas) y de oomicetos (e. g., elicitinas). Si todo
esto es superado por el invasor y como ltima opcin, la planta activa un
mecanismo de resistencia mediado por la interaccin entre los productos de los
genes de avirulencia (Avr) y de resistencia (R) de patgenos y plantas,
respectivamente. En insectos, plantas y vertebrados, la identificacin de algunos
PMAP, como por ejemplo la flagelina, est mediada por cinasas similares a
receptores (Toll-like), caracterizadas por una estructura en la que abundan
secuencias repetidas ricas en leucina.
La resistencia innata involucra a todo un gnero o especie de plantas; es
compleja, ancestral, estable y heredable. Por el contrario, la resistencia
especfica o del tipo gen por gen, est limitada a ciertos genotipos en una
especie normalmente susceptible, es parsito especfica y conferida por un solo
gen R que reconoce a un nico gen Avr y, por lo mismo, es menos duradera
(Gmez-Gmez y Boller, 2002; Thordal-Christensen, 2003; Parker, 2003).
Una vez que se establece la unin del evocador o PMAP al receptor, los
cambios ms importantes a travs de la membrana plasmtica son la activacin
6
del flujo de iones H+, K+, Cl- y Ca2+ desde y hacia la clula y la formacin de
H2O2 (estallido oxidativo) (Apostol et al., 1989; Nrberger et al., 1994; Roberts y
de Bruxelles, 2001). Despus de 5 a 30 minutos, se inicia la fosforilacin
dependiente de calcio de algunas protenas, que inducen una sntesis rpida de
etileno y la activacin transcripcional de muchos genes relacionados con la
defensa (Dietrich et al., 1990). De manera temporal, el estallido oxidativo y la
fosforilacin/desfosforilacin de protenas, parecen estar controlados por la
activacin de canales inicos, pero su posible relacin causal con otros
componentes de la cadena de transduccin de seales que conducen a la
activacin de respuestas, como por ejemplo protenas que enlazan GTP, inositol,
AMPc, etc., an se desconoce. Las clulas vegetales tienen la capacidad de
reconocer un patgeno potencial y de transmitir esta informacin dentro de la
clula y clulas vecinas, para mantener y optimizar las respuestas de defensa
(Basse et al., 1993; Nrberger et al., 1994). La interaccin entre evocadorreceptor es el punto de partida para la traduccin de seales que activa la
expresin de genes involucrados en la resistencia, ya sea del tipo no especifico
que como se indic anteriormente se induce por diversos evocadores no
especficos reconocidos por numerosas especies, e inclusive gneros, de
plantas resistentes a toda una raza de patgenos, o los de tipo especifico,
donde el evocador es el producto de un gen de avirulencia (Avr) del patgeno, y
el receptor, el correspondiente producto del gen de resistencia R, en la planta
(Grant y Loake, 2000).
En la mayora de los casos, la interaccin entre los productos de los
genes R y Avr inicia cascadas de sealizacin que dan lugar a la reaccin
hipersensible (RH) y resistencia sistmica adquirida (RSA). La RH consiste en
una necrosis rpida y localizada en el sitio de dao, acta directamente contra el
patgeno, mediante la citotoxidad de las especies reactivas de oxgeno, como el
anin superxido (O2-) y el perxido de hidrgeno (H2O2), que participan en el
estallido oxidativo (Apostol et al., 1989). Adems, se caracteriza por la
acumulacin de compuestos fenlicos alrededor de las clulas atacadas,
fragmentacin del
ADN,
condensacin
citoplasmtica y muerte celular
programada, procesos similares a la apoptosis que se observa en clulas

animales (Birch et al., 1999).
Junto con la RH, en la planta se pueden presentar diferentes cambios

estructurales, moleculares, bioqumicos y/o fisiolgicos que ocurren poco tiempo
despus del ataque patognico y tienen lugar tanto en el sitio de dao como en
la periferia (respuestas locales) o, ms tardamente, en zonas distantes a ste
(respuestas sistmicas).
2.1.1.2. Respuesta local
La respuesta local consiste en una rpida acumulacin de enzimas,

protenas estructurales y/o metabolitos, como consecuencia de una activacin
transcripcional que es mediada por el reconocimiento del patgeno. Esta
activacin local de genes es restringida a una pequea rea definida alrededor
del sitio de ingreso del patgeno (Bowles, 1990; Geoffroy et al., 1990; Ryan y
Jagendorf, 1995).
Una respuesta tpica en este sitio localizado es la sntesis de novo de
enzimas biosintticas de compuestos txicos para el patgeno, tales como las
enzimas del metabolismo de los fenilpropanoides, como la fenilalanina amonio
liasa (FAL), la 4-cumarato: CoA ligasa (4CL) y otras enzimas involucradas en la
sntesis
de
fitoalexinas
otros
metabolitos
secundarios
(Nicholson
Hammerschmidt, 1992; Freytag, 1994).

Tambien mediante este mecanismo son sintetizadas otras protenas,
como las glicoprotenas ricas en hidroxiprolina (GPRH), protenas ricas en glicina
(PRG), protenas relacionadas con la patognesis (RP), intra y extracelulares,
as como quitinasas, -1,3-glucanasas, peroxidasas, lipoxigenasas, proteasas,
inhibidores de proteasas y amilasas, poligalacturonasas y otras protenas
antimicrobianas y/o txicas a insectos (Geoffroy et al., 1990; Linthorst, 1991;
Stintzi et al., 1993).
Como ya se mencion, el reconocimiento del evocador ocasiona la
activacin de una o ms rutas de transduccin de seales, y por ltimo la
sntesis de compuestos relacionados con defensa. De manera rpida y local
surgen eventos comunes a distintas rutas de transduccin de seales, donde se
incluyen: apertura de canales inicos y entrada de calcio, alteracin del potencial
de membrana (despolarizacin o hiperpolarizacin). Estos eventos tempranos
8
son acompaados posteriormente por la sntesis de AS, AJ y/o otros compuestos

que son seales necesarias para la activacin gnica (Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
Los diferentes cambios estructurales, moleculares, bioqumicos y/o
fisiolgicos que ocurren poco tiempo despus del ataque patognico, tienen
lugar tanto en el sitio de dao como en su periferia (respuestas locales) o, ms
tardamente, en zonas distantes a ste (respuestas sistmicas).
2.1.1.3. Respuesta sistmica
Uno de los aspectos ms elusivos y fascinantes en respuesta a dao es la

habilidad de generar seales en el sitio de herida y que se transmitan a partes
distantes de la planta. La respuesta a patgenos mejor caracterizada es la
resistencia sistmica adquirida (RSA), la cual le confiere resistencia a la planta
contra un amplio rango de patgenos e involucra la induccin de distintas
protenas RP (Ryals et al., 1996).
El cido saliclico (AS), un producto de la ruta de los fenilpropanoides, ha
mostrado ser esencial en la induccin de la RSA (Gaffney et al., 1993; Vernooij
et al., 1994; Pallas et al., 1996). Se ha demostrado que un incremento en los
niveles de AS precede a la RSA, y que dicho incremento es necesario y
suficiente para el establecimiento de la misma. Recientes evidencias han
sugerido que tambin existen rutas independientes de AS (Heo et al., 1999).
Tanto en tabaco como en Arabidopsis, el AS es suficiente y necesario
para la induccin de RSA. Esto ha sido aprovechado en la agricultura, en la cual
se emplean inductores sintticos como el BTH y el INA, que presentan gran
similitud estructural con AS, para inducir un estado de resistencia contra
patgenos en numerosos cultivos de inters comercial (Lawton et al., 1996;
Friedrich et al., 1996; Gorlach et al., 1996). El papel del AS en la induccin del
RSA se comprob en plantas de tabaco capaces de expresar el gen nahG, que
codifica una salicilato hidrolasa bacteriana; estas plantas presentaron bajos
niveles de AS, fueron incapaces de expresar RSA y presentaron ms
susceptibilidad a una gran variedad de patgenos (Delaney et al., 1997; Gaffney
et al., 1993).
9
Adems de la RSA, existe otro tipo de respuesta denominada Resistencia

Sistmica Inducida (RSI) que tambin provee proteccin contra una amplia gama
de patgenos. Esta respuesta, que es inducida por rizobacterias promotoras del
crecimiento, no depende de AS, no est asociada a la RH ni a la sntesis de
protenas RP, est regulada por el cido jasmnico, el etileno y la protena
reguladora NPR-1 (Pieterse et al., 1996, 1998; Van Loon et al., 1998; Knoester et
al., 1998).
Se cree que el etileno funciona como inductor en la sntesis de
compuestos, genes o estructuras defensivas como lignina, protenas RP y
fenilalanina amonio liasa (FAL).
Por otra parte, existe una ruta defensiva
comnmente conocida como la ruta octadecanoica que involucra AJ o su ster

metlico (MeJA) para inducir, principalmente, la sntesis de inhibidores de
proteasas (IP) en respuesta a herbivora (Pea-Corts et al., 1989; Farmer y
Ryan, 1992).
Existen varios ejemplos de la inhibicin de una va por la otra. Por
ejemplo, en plantas
heridas tratadas simultneamente con AS, se inhibe la
acumulacin de IP y PFO, que son respuestas tpicas producidas por herbivora,

y reguladas por AJ (Stout et al., 1999). A su vez, tambin se ha observado la
interferencia del AJ en la resistencia mediada por AS contra ciertos patgenos,
manifestndose como la disminucin de la sntesis de algunas protenas RP
(Sano y Ohashi, 1995; Niki et al., 1998).
2.2. Mecanismos de defensa en tabaco
El tabaco es atacado en cualquier etapa de su desarrollo y en todas los

rganos de la planta por diversos agresores incluyendo hongos, bacterias, virus,
nemtodos, afidos (Myzus nicotianiae; M. persicae) y otros insectos chupadores
e insectos masticadores, entre los que se encuentra Manduca sexta, que es una
especie tolerante a la nicotina y Heliothis virescens (Johnson et al., 1992; Snook
et al., 1997).
Como ya se ha descrito, la resistencia o tolerancia de las plantas haca los
insectos herbvoros y patgenos est mediada por mecanismos de defensa
inducidos o constitutivos (Mauricio et al., 1997; Buell, 1998). En tabaco, como en
10
otras plantas, las defensas inducibles pueden clasificarse como directas e

indirectas. Dentro del primer tipo se incluyen los inhibidores de proteasas, (van
Dam et al., 2001; Glawe et al., 2003) diterpenos glicosilados (Keinnen et al.,
2001) y metabolitos secundarios como la nicotina (Winz y Baldwin, 2001;
Steppuhn et al., 2004) capsidiol (Guedes et al., 1982; Bohlmann et al., 2002) y
cido clorognico (Tanguy y Martin, 1972; Lou y Baldwin, 2003).
A su vez, la defensa indirecta se considera como aquella que depende de
un tercer nivel trfico, representado por insectos depredadores o parsitos de los
insectos herbvoros, los cuales son atrados hacia la planta atacada mediante la
emisin inducida de compuestos voltiles (Halitschke et al., 2000). En N.
attenuata, el dao mecnico y el ataque por M. sexta ocasiona un incremento de
los niveles de AJ, el cual est relacionado con la acumulacin de metabolitos
secundarios, inhibidores de proteasas y la sntesis de novo de voltiles. En esta
especie, la induccin de defensas se presenta tanto a nivel local como sistmico,
particularmente en las hojas conectadas filotcticamente, mientras que los
voltiles se inducen en toda la planta. Sin embargo, el ataque a N. attenuata por
M. sexta no origina un aumento de nicotina ya que el incremento simultneo de
etileno inhibe la expresin de putrescina N-metiltransferasa, que es una de las
enzimas clave en la biosntesis de nicotina. Este patrn de expresin de
respuestas defensivas ha sido estudiado con particular detalle en especies
silvestres de Nicotiana (e.g., N. sylvestris y N. attenuata) (McCloud y Baldwin,
1997; Lou y Baldwin, 2003; Qu et al., 2004), (Ver Figura 1).
11
DEFENSAS EN TABACO
ATAQUE CON
Manduca sexta
dao
MeJA
Volatiles
AJ
Diterpenos
glicosilados,etc.
Defensas
indirectas
Defensas
directas
IPs
regurgitante
Et
Putrescina
PMT
nicotina
Metabolitos
secundarios
Baldwin y col., 2003

Figura 1. Reconocimiento del ataque de M. sexta por N. attenuata, incremento
de los niveles de AJ y etileno e induccin de defensas directas e indirectas
(modificado de Baldwin et al., 2003).
12
2.3. Respuestas de resistencia en plantas contra el ataque de plagas
El dao implicado por herbvoros requiere de mltiples estrategias de

defensa en la planta. El sitio de dao debe protegerse y la respuesta de defensa
aumentar contra el herbvoro y patgenos oportunistas (Roberts y de Bruxelles,
2001). En el caso especfico de los insectos herbvoros, se ha observado que
stos inducen una serie de defensas en las plantas tanto a nivel local como a
nivel sistmico (Gatehouse, 2000). Por ejemplo, se ha demostrado que el dao
causado por el ataque de insectos masticadores activa respuestas de defensa
tpicas en ciertas especies de plantas. Entre estas respuestas, se encuentran la
activacin de genes que codifican para inhibidores de proteasas y
polifenol
oxidasas, as como de protenas asociadas a protelisis controlada, como son

las protenas tipo ubiquitina (Bowles, 1990; Ryan, 1990).
2.3.1. Inhibidores de proteasas
Los IP son protenas con gran afinidad por enzimas proteolticas, capaces
de inhibir fuerte y especficamente su actividad enzimtica (Richardson, 1991).
Los inhibidores de proteasas se acumulan de manera constitutiva, pueden ser
inducibles por dao causado mecnicamente, por insectos o por patgenos. Las
evidencias experimentales indican que su efecto protector radica en la inhibicin
de enzimas que son esenciales para la digestin de protenas (Ryan, 1981; de
Bruxelles y Roberts, 2001). stos fueron primeramente descritos con detalle en
plantas solanceas. Sin embargo, hoy en da se ha encontrado que los IP son
expresados en semillas, tubrculos y tejidos vegetativos de ms de 100 especies
diferentes de plantas, muchos de los cuales se acumulan despus de sufrir algn
tipo de dao (Kessler et al., 2002).
La clasificacin de los IP se basa en el tipo de proteasa (o proteasas) que
son capaces de inhibir: serina, cistena, asprtico y las metalo proteasas. Los
inhibidores de estas enzimas producidas por plantas afectan el crecimiento y
desarrollo de plagas al interferir en la degradacin de protenas de origen foliar.
El argumento ms aceptado es que el efecto defensivo se produce como
consecuencia de los efectos antinutricios que se presentaran en los insectos
13
alimentados con plantas que sintetizan altas concentraciones de IP, los cuales
estn relacionados con la prdida de la asimilacin de algunos aminocidos
esenciales, especialmente los sulfurados, debido a una secrecin excesiva de
tripsina (Ryan, 1990).
La sntesis de estas enzimas se inicia con la liberacin de evocadores,
inducidos por algn tipo de dao; la respuesta se lleva a cabo de manera local y
al mismo tiempo se inicia la activacin de mecanismos de transduccin de
seales para iniciar la respuesta sistmica (Schaller y Ryan, 1995).
Se considera que la amplia distribucin de los IP en tejidos de
almacenamiento y en distintas familias de plantas, su inducibilidad por dao
mecnico y herbivora, as como su efecto protector en plantas transgnicas, son
criterio suficiente para atribuirles una funcin como protenas de defensa contra
herbvoros.
2.3.2. Polifenol oxidasas
Las polifenol oxidasas son un grupo de enzimas inducibles que oxidan un

amplio rango de compuestos fenlicos en plantas (Vaughn et al., 1988). La
enzima polifenol oxidasa (PFO) se clasifica como protena antinutricional dentro
de las llamadas SWRPs (de sus siglas en ingls, Systemic Wound Response
Proteins) o protenas en respuesta a dao que son protenas que se expresan
como respuesta al ataque por herbvoros (Ryan, 2000).
La enzima PFO, al ser ingerida por los herbvoros, junto con compuestos
fenlicos y la combinacin de inhibidores de proteasas, forman una barrera muy
efectiva para la digestin de protenas por insectos (Graham et al., 1986; Felton
et al., 1992; Bergey et al., 1996). El efecto antinutritivo se basa en la capacidad
que poseen para destruir nutrientes esenciales en las dietas de los insectos. La
eficiencia
de
las
enzimas
oxidativas,
fenol
oxidasas,
peroxidasas
lipooxigenasas (LOX), depende del ambiente qumico existente en el intestino

del insecto, del potencial Redox y de los niveles de antioxidantes. Adems, la
calidad y cantidad de protena presente en la dieta ejercen influencia sobre los
efectos oxidativos en las enzimas de los herbvoros (Stout y Duffey, 1996).
14
Durante el proceso de alimentacin del insecto, las PFO tienen acceso a

sus sustratos y generan orto-quinonas a partir de compuestos fenlicos
presentes en la dieta. Estas tienen un efecto nocivo en el husped ya que
pueden formar enlaces covalentes con grupos sulfhdrilo de aminocidos
sulfurados y con aminocidos bsicos, como la lisina. La modificacin qumica
de estos aminocidos provoca eventualmente precipitacin de las protenas, lo
cual altera de manera significativa la digestin y la asimilacin de nitrgeno en el
insecto (Felton et al., 1992).
2.3.3. Oligosacridos
La mayor parte de los patgenos y herbvoros que atacan plantas,

secretan numerosas enzimas degradativas, cuya accin provoca la generacin
de fragmentos de componentes celulares (como de la pared celular), que actan
como evocadores biticos (Stout y Bostock, 1999). Se ha observado que tanto
los oligogalacturnidos (OGA), provenientes de los fragmentos de la pared
celular, como los fragmentos de quitina y quitosanas, derivados de las paredes
celulares de patgenos, pueden activar a los genes IP. En algunos bioensayos
realizados con diferentes OGA, se observ que molculas con un grado de
polimerizacin de 2 unidades de cido galacturnico fueron capaces de inducir a
los genes IP. Se ha sugerido que los OGA actan como inductores en la
expresin de los genes IP solamente a nivel local. Esto se atribuye a su poca
movilidad, relacionada con su alta afinidad por la pared celular, y al hecho de
que slo pueden ser liberados en el sitio donde el dao ha sido inflingido en las
plantas por insectos o por patgenos y donde se generan las enzimas
necesarias para hidrolizar fragmentos activos de la pared celular (Bowles, 1998).
La aplicacin de OGA da como resultado una rpida despolarizacin de la
membrana plasmtica, flujo de iones de calcio dentro del citoplasma (Thain et
al., 1990; Mathieu et al., 1991; Messiaen y van Cutsem, 1994), la generacin de
especies reactivas de oxigeno (Orozco-Crdenas y Ryan, 1999) y la induccin
de AJ (Doares et al., 1995a) y etileno (ODonnell et al., 1996).
15
2.4. Sistemina
La sistemina es un polipptido de sealizacin que fue descubierto

durante investigaciones enfocadas a detectar la seal sistmica que regula la
expresin de genes de defensa en respuesta al ataque de insectos y dao
mecnico en hojas de jitomate (Lycopersicon esculentum). Este polipptido
consta de 18 aminocidos y no est modificado por cadenas laterales de
oligosacridos. Se encontr que induce la actividad de inhibidores de proteasas
al ser aplicado en concentraciones muy bajas, del rango picomolar a fentomolar,
a plantas jvenes de jitomate (Figura 2). El polipptido fue purificado por medio
de una laboriosa secuencia de separacin, la ltima de las cuales se hizo por
cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC, por sus
siglas en ingls). La actividad del polipptido fue ensayada aplicando fracciones
eludas directamente de las columnas a plantas jvenes a travs de soluciones
acuosas absorbidas directamente por la corriente de transpiracin de las
plntulas cuyos tallos haban sido cortados previamente por debajo del
hipcotilo. Una vez purificado, se detect que el polipptido sinttico, de
secuencia idntica al aislado y marcado radiactivamente con
14
C, era
transportado de las hojas heridas a tejidos distales (Pearce et al., 1991).

Adems, su movimiento a travs del floema correlacion con la velocidad de la
seal sistmica que se produce en respuesta a dao, que se estim como de
aproximadamente de 3 cm/h (Nelson et al., 1983; Pearce et al., 1991; NarvezVasquez et al., 1995). Debido precisamente a la movilidad sistmica de este
polipptido a travs del floema se le llam sistemina. La sistemina no solo
induce la expresin de inhibidores de proteasa sino que tambin incrementa la
actividad de PFO, que tambin puede ser inducida por MeJA, adems de un
amplio espectro de protenas relacionadas a defensa, como lo son las SWRP.
Este polipptido es muy polar y posee numerosos aminocidos cargados
en su estructura primaria; posee, adems, un enlace dibsico entre los
aminocidos 9 y 10 que podra ser reconocido por proteasas tipo subtilisina para
su degradacin y/o procesamiento (Schaller et al., 1999) y dos pares de prolinas
en las posicines 6 y 7, y 12 y 13. Por medio de estudios de dicroismo circular se
detect una leve estructura secundaria en la regin central del polipptido
(Toumadje y Jonhson, 1995). Se estima que la conformacin enrollada (coil16
coiled) es debido a estos dos pares de residuos de prolina presentes en su

secuencia. Se sabe, tambin, que las poliprolinas son motivos estructurales
empleados para la unin con otras protenas (Ferris et al., 2001); se especula
que esta caracterstica podra ser importante para el reconocimiento de
sistemina por su receptor.
+H3N-AVQSKPPSKRDPPKMQTD-COO1
10
15
18
Figura 2. Estructura primaria de la sistemina de jitomate.
2.4.1. Actividad y translocacin de sistemina
Mediante la sustitucin con alanina y deleciones en la secuencia de

sistemina, Pearce y colaboradores (1993), demostraron que se requera la
secuencia completa de sistemina para permitir la induccin mxima de los genes
de inhibidores de proteasas. Deleciones en el extremo carboxilo terminal de la
secuencia de sistemina causaron una disminucin o prdida total de la actividad
del polipptido, principalmente al eliminar el cido asprtico presente en la ltima
posicin desde el extremo carboxilo terminal. Se demostr trambin que son
necesarios por lo menos los cuatro ltimos aminocidos (Met-Gln-Thr-Asp) para
que se manifieste una mnima actividad de sistemina. Al ser deletados estos
cuatro aminocidos en orden progresivo se inactiv por completo la actividad
inductora de inhibidores de proteasas. Asimismo, la delecin de la alanina del
extremo amino-terminal redujo hasta 300 veces su actividad, y deleciones
progresivas de esta regin causaron incrementos en la prdida de actividad. Sin
embargo, se observ que podan ser eliminados hasta 14 aminocidos de la
regin NH2-terminal sin que se perdiera por completo la actividad del polipptido.
Para determinar si las modificaciones en los aminocidos de la sistemina
17
afectaban su actividad inductora, se utiliz una sistemina sinttica anloga que

contena una sustitucin con Ala en cada aminocido del polipptido. Se observ
que las sustituciones por Ala en los residuos 2-6, 8, 9 ,10, 14 y 15 producan
pequeos cambios en la actividad, indicando que estos aa eran relativamente
poco importantes en la actividad de la sistemina, mientras que las sustituciones
en los residuos 12 y 13
correspondientes a uno de los dos pares de prolinas
caus una reduccin drstica de la actividad biolgica, mientras que la

sustitucin en la posicin 17 (Thr) aboli completamente la actividad inductora de
la sistemina (Figura 3). De este resultado surgi la hiptesis de que la treonina
es fosforilada como parte del proceso de sealizacin, la cual no ha podido hasta
el momento ser validada o desechada.
Figura 3. Efecto de la sustitucin de cada uno de los 18 aminocidos de la

sistemina de jitomate por alanina, sobre la induccin de la sntesis de inhibidores
de proteasa tipo I en hojas de jitomate.
18
En experimentos en los que se utilizaron slo los 14 aa del extremo amino

terminal de una sistemina anloga, se detect la unin a la membrana celular de
Lycopersicon peruvianum, la cual compiti con la sistemina natural por el sitio de
unin, mientras que la secuencia (Met-Gln-Thr-Asp) del extremo carboxilo no
present este comportamiento (Meindl et al., 1998). De este comportamiento
surgi un modelo para explicar el mecanismo de unin ligando-receptor, en el
cual se sugiere que el extremo amino terminal es el que se une inicialmente al
receptor para permitir la generacin de los cambios conformacionales que
permitirn la posterior unin del extremo carboxilo terminal y el inicio de las
cascada de sealizacin (Meindl et al., 1998).
Anlisis autorradiogrficos y el uso del microscopio de luz, revelaron que
al aplicar sistemina marcada con
14
C o 3H en hojas heridas de plantas de
jitomate, sta se difunda a travs de toda la hoja despus de 30 min, mientras

que a los 90 min la radioactividad era detectada en las hojas apicales de las
plantas. A su vez, se observ que la aplicacin de sistemina marcada con 3H se
concentr en el xilema y el floema
de las nervaduras de la hoja herida 15
minutos despus de su aplicacin. Despus de 30 min, la radioactividad se

encontr principalmente en los tejidos vasculares del peciolo, y a los 90 min, la
marca fue encontrada en el floema del tallo principal de las plantas. Los anlisis
autorradiogrficos, bioqumicos e histolgicos, sugeran fuertemente que la
sistemina marcada radioactivamente y aplicada a hojas de jitomate heridas, era
translocada inicialmente al apoplasto o espacio intercelular, posteriormente al
tejido vascular de las nervaduras menores y al simplasto de las clulas
acompaantes del complejo de tubos cribosos, y finalmente a los tejidos distales
a travs del floema. Con estos resultados se obtuvieron fuertes evidencias a
favor del transporte de la sistemina desde el sitio de la herida hacia los tejidos
distales de la planta (Narvez-Vzquez et al., 1995).
19
2.4.2. Modelo de la ruta de sealizacin activada por sistemina
El sistema modelo para el estudio de la ruta de sealizacin activado por

sistemina es el jitomate. En esta especie, el modelo propone la percepcin de la
sistemina por un receptor tipo cinasa de repetidos ricos en leucina, de 160-kDa,
localizado en la membrana
plasmtica de las clulas de jitomate (Scheer y
Ryan, 2002). La percepcin rpida y reversible da como resultado un incremento

en la concentracin del Ca2+ libre en el citosol debido a la apertura de canales de
la membrana plasmtica y de almacenes internos. El Ca2+ estimula la actividad
de una proten cinasa (PK) aun no identificada, resultando en la inhibicin de la
H+-ATPasa de la membrana plasmtica y, por lo tanto, en la despolarizacin del
potencial de la membrana plasmtica y en la alcalinizacin del medio. El Ca2+
liberado tambin puede activar una fosfolipasa A2 (PLA2) y mediar la fosforilacin
de una MAPK, resultando en la hidrlisis de lpidos y la liberacin del cido
linolnico de la membrana, con la consecuente produccin de cido jasmnico y
la activacin de genes defensivos (Schaller, 1999) (Figura 4).
20
MP
K+, Cl
Ca2++
H-ATP
R S -1 6 0
SISTEMINA
PLA2
Ca2+
Ca+
H+
c. linol
linolnico
MAPK
Ca2+
PK
Reducci
Reduccin
vacuola
--Oxidaci
Oxidacin (3)
o
Activaci
Activacin
gnica
COOH
c. jasmnico
Figura 4. Modelo hipottico de la ruta de transduccin de seales en clulas de

jitomate activada por sistemina. MP: membrana plasmtica; PLA2: Fosfolipasa
A2: MAPK: cinasas activadas por mitgenos; RS: receptor de la sistemina de 160
kDa (Schaller, 1999).
21
2.4.3. Glicopptidos ricos en hidroxiprolina (sisteminas) de tabaco

(TobHypSys)
Mediante el empleo de cromatografa en columna se facilit el aislamiento

de dos polipptidos de 18 aa de las hojas de tabaco llamados TobHypSys I y
TobHypSys II. El anlisis de su estructura revel que ambos tienen residuos de
prolinas hidroxiladas, los cuales se encuentran glicosilados por cadenas laterales
de oligosacridos, ricas en pentosas, con un grado de polimerizacin de 6 a 9
unidades (Pearce et al., 2001). Al igual que la sistemina en jitomate, ambos
mostraron la capacidad de inducir la sntesis de inhibidores de tripsina en plantas
de tabaco y de activar a MAP cinasas asociadas con el dao en cultivos
celulares en suspensin de tabaco (Pearce et al., 2001). Se detect un tercer
polipptido en tabaco, pero a muy bajas concentraciones. Este result casi
idntico a TobHypSys II, excepto por la presencia adicional de leucina en la
regin C-terminal. La aplicacin de sistemina de jitomate a suspensiones
celulares de tabaco no caus la tpica alcalinizacin en el medio del cultivo
celular. Asimismo, cuando se aplic sistemina exgena a travs del tallo de
plantas jvenes de tabaco, tampoco se activ la sntesis de inhibidores de
tripsina en las hojas de tabaco, confirmndose que la sistemina de jitomate no es
percibida por las clulas de tabaco. Esto se debe, quizs, a sus marcadas
diferencias estructurales (Figura 5). Sin embargo, experimentos posteriores
indicaron que la sistemina de jitomate result capaz de inducir la alcalinizacin
del medio extracelular de suspensiones celulares de tabaco preparadas a partir
de plantas de tabaco transformadas con el ADNc del receptor de sistemina de
jitomate (SR160) bajo el promotor constitutivo 35S. De manera que posiblemente
existen uno o varios componentes implicados en la sealizacin intracelular
capaces de interactuar con el receptor SR160 para facilitar la sealizacin
mediada por sistemina en las clulas de tabaco (Scheer et al., 2003). Otra
posibilidad es que el motivo de poliprolina conservado en todas las sisteminas, el
cual produce una estructura conocida como PP II, podra ser importante para el
reconocimiento por el receptor SR 160, en forma similar a lo que se propone que
ocurre durante la interaccin entre las glicoprotenas ricas en hidroxiprolina y
otras protenas de la pared celular de plantas (Ferris et al., 2001). Sin embargo,
TobHypSys I y TobHypSys II inducen la
alcalinizacin del medio en

22
suspensiones celulares de jitomate y la sntesis de inhibidores de proteasas en

plantas de jitomate, indicando que los receptores de jitomate puedan reconocer a
las llamadas sisteminas de tabaco (Glicopptidos ricos en hidroxiprolina),
activando la misma sealizacin activada por la sistemina de jitomate (LeSYS).
Debido a que el precursor de las sisteminas de tabaco, proTobHypSys, se
encuentra hidroxilado y glicosilado, puede asociarse con la pared celular, como
se demostr para el precursor proTomHypSys en jitomate (Narvez-Vzquez et
al., 2005), y posiblemente puede ser procesado en el sitio de dao para inducir
seales de amplificacin en la sntesis de oxilipinas (Ryan y Pearce, 2003).
Recientemente se aislaron de hojas de jitomate tres polipptidos glicosilados e
hidroxilados de 15, 18 y 20 aa (TomHypSys), similares en la estructura bsica a
TobHypSys I y II, los cuales inducen fuertemente la alcalinizacin cuando se
adicionan a cultivos celulares de jitomate y tabaco. En tabaco, la respuesta a
dao activa sistemicamente la sntesis de inhibidores de tripsina los cuales son
homlogos a los inhibidores II de jitomate (Pearce et al., 1993b).
TomSys
TomHypSys I
TomHypSys II
TomHypSys III
TobHypSys I
TobHypSys II
H2N-
A V Q S K P P S K R D P P K M Q T D-COO-
R T O Y K T O O O O T S S S O T H H -COOH2N- G R H D Y V A S O O O O K P Q D E Q R Q-COO+
H2N- G R H D S V L P O O S O K T D -COO+
H2N-
+
+
H2N-
R G A N L P O O S O A S S P O O S K E -COOH2N- N R K P L S O O S O K P A D G O R P-COO-
Figura 5. Estructura primaria de la sistemina de jitomate y de los glicopptidos

ricos en hidroxiprolina presentes en jitomate (TomSys y TomHypSys I, II y III) y
tabaco (TobHypSys I y II), respectivamente.
23
La utilizacin de dos TobHypSys sintticas, carentes de carbohidratos,

indujo una dbil alcalinizacin en cultivos celulares de tabaco en suspensin y
una dbil induccin de inhibidores de tripsina en hojas de tabaco, indicando que
la modificacin con cadenas laterales de carbohidratos favorece la actividad
biolgica de los glicopptidos ricos en hidroxiprolina. Al sustituir con alanina la
arginina (R) en la regin amino terminal, cido glutamico (E) en el extremo Cterminal y en la hidroxiprolina en posicin 15 de TobHypSys I, se elimin por
completo la induccin de actividad de este polipptido. Adems, sustituciones en
las hidroxiprolinas en posicin 10 y 14 redujeron drsticamente la actividad del
glicopptido. A su vez, las sustituciones con alanina en arginina (R) y asparagina
(N) en la regin amino terminal redujeron severamente la actividad de
TobHypSys II sintticas (medida como la capacidad de causar la alcalinizacin
del medio extracelular al ser aplicados a cultivos celulares de N. tabacum), as
como tambin la sustitucin en el extremo carboxilo terminal de la arginina en la
posicin 17, hidroxiprolina en la posicin 10 y prolina
posicin 18,
respectivamente (Pearce et al., 2001) (Figura 6).
24
Figura 6. Actividad de TobHypSys I y TobHypSys II sintticas, carentes de

modificaciones con cadena de oligosacridos y con sustituciones de alanina en
cada uno de sus aminocidos.
2.5. Prosistemina
La prosistemina, considerada el precursor de la sistemina, es una

protena hidroflica de aproximadamente 23 kDa que contiene un alto porcentaje
de aa cargados y pocos aa hidrofbicos (McGurl et al., 1992). Este polipptido
de 200 aa, no posee una secuencia seal tpica de las protenas que son
exportadas al exterior de la clula o a diferentes organelos a travs del retculo
endoplsmico, ya que no hay evidencia de que esta protena est glicosilada
(Delno-Frier et al., 1999). Se ha determinado que el sitio de sntesis de la
prosistemina se localiza en las clulas del parnquima del haz vascular de hojas,
pecolos y tallos; se ha especulado que la localizacin tan estricta de la sntesis
de prosistemina en el tejido vascular puede representar una ventaja para la
25
planta, al facilitar el procesamiento de la prosistemina en respuesta a heridas y

promover una rpida carga de la sistemina en el floema, donde puede ser
rpidamente transportada a travs de la planta (Jacinto et al, 1997; Li et al.,
2002a; Ryan y Moura, 2002; Narvez-Vzquez y Ryan, 2004; Scilmiller y Howe,
2005).
2.5.1. Expresin y supresin de la actividad de la prosistemina
La funcin de la prosistemina fue demostrada al transformar plantas de

jitomate con el ADNc de la prosistemina en orientacin antisentido, la cual caus
una reduccin severa de la induccin de inhibidores de proteasas y, por
consiguiente, una mayor susceptibilidad a herbivora por larvas de Manduca
sexta (McGurl et al., 1992).
A su vez, la expresin del gen de la prosistemina en orientacin sentido,
condujo a una sobre-expresin constitutiva de los genes de inhibidores de
proteasas, ya que aun sin ser heridas, las plantas transgnicas presentaron
niveles de alrededor de 87 g/ml del inhibidor I y 75 g/ml del inhibidor II,
mientras que las plantas control no mostraron acumulacin alguna de los
inhibidores. Adems, los niveles de los inhibidores I y II se incrementaron hasta
2.5 veces ms en las plantas transgnicas en respuesta a dao mecnico
(Figura 7). La sobre-expresin de la prosistemina en plantas de jitomate no slo
di como resultado la acumulacin constitutiva de inhibidores de proteasas, sino
tambin la acumulacin de otras protenas involucradas en mecanismos
defensivos, entre las cuales se identificaron una polifenol oxidasa, inhibidores de
cistein proteasas y de catepsina D, exopeptidasas (serin-carboxipeptidasa y
leucina aminopeptidasa), una asprtico proteasa, e isoformas especficas de
lipoxigenasa, calmodulina y cistatina (Bergey et al., 1996). Como consecuencia
de esta sobre-expresin mltiple de genes relacionados con defensa, estas
plantas resultaron altamente resistentes al dao causado por Manduca sexta y
otros insectos (Li et al., 2002b).
26
Conc. del inhibidor (ug/ml)
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1
In h I
2
In h II
Figura 7. Niveles de inhibidores de proteasas I y II en plantas de jitomate sin

transformar (1) y transformadas (2) con el transgen de la prosistemina en
orientacin sentido (segn McGurl et al., 1994).
Dombrowski et al., (1999), estudiaron la induccin de inhibidores de

proteasas
en
plantas
de
jitomate
tratadas
con
varias
prosisteminas
recombinantes truncadas a lo largo de su secuencia aminocidica. stas tenan

deleciones en los primeros 15 (PS 185) y 87 (PS 113) aa y otra sin la regin
codificante para sistemina l78 (PS SYS). Utilizaron como controles a la
sistemina (LeSYS) y prosistemina (LePS) con su secuencia aminocidica
completa, y a la sistemina (A17) y prosistemina (PS A195) mutadas en la
treonina 17 y prolina 195, respectivamente, que como se ha mencionado es
esencial para su actividad biolgica (ver Figuras 8 A y B). Al medir los niveles de
actividad del inhibidor I en hojas de plantas de jitomate tratadas con las
diferentes sisteminas y prosisteminas, observaron que la induccin de la
actividad del Inh I fue similar en las plantas tratadas con sistemina y
prosistemina. Esta actividad se mantuvo cuando se us la PS 185 y disminuy
ligeramente en las plantas que fueron tratadas con PS 113. Sin embargo, la
induccin de actividad inhibitoria se abati por completo al usar PS SYS, SYS
A17 y PS A195. Estos resultados coincidieron con los reportados previamente
por Pearce et al., (1993) y sugeran fuertemente que la actividad biolgica de la
27
prosistemina radica bsicamente en la regin carboxilo terminal, donde est

ubicada la sistemina. Sin embargo, no descartaban la posibilidad de que la
regin amino terminal podra estar involucrada en otros procesos de sealizacin
o bioqumicos, as como en el reconocimiento y anclaje de la prosistemina al
receptor SR 160, localizado en la membrana plasmtica de las clulas de
jitomate.
2.5.2. Homologa de la prosistemina de jitomate en plantas

solanceas
La acumulacin de inhibidores de proteasas en respuesta a dao se ha

observado en muchas especies de plantas incluyendo la papa, tabaco, alfalfa,
maz, lamo y sauce, pero en ninguna de stas se conoca la naturaleza de la
seal sistmica. Usando la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa
en combinacin con transcripcin reversa (RT-PCR) se aislaron y caracterizaron
secuencias de ADNc que codifican a homlogos de prosistemina en
papa
(Solanum tuberosum), papa silvestre (S. nigrum) y chile (Capsicum annuum). El

anlisis de la secuencia deducida de las prosisteminas de estas plantas mostr
un alto grado de similitud (de 85 a 94%) e identidad (de 73 a 88%) entre estas
especies, siendo la prosistemina de chile la que present la ms baja identidad y
similitud en comparacin con las otras especies. Las secuencias predichas de la
prosistemina de papa, papa silvestre y chile no mostraron diferencias
significativas con la secuencia de la prosistemina de jitomate. Por tal motivo, se
investig si las prosisteminas sintticas homlogas posean actividad inductora
de inhibidores de proteasas en plantas de jitomate. Los resultados obtenidos
indicaron que la prosistemina de papa silvestre fue 10 veces menos activa que la
de jitomate, mientras que las prosisteminas de papa y chile fueron similares a la
de jitomate. Al utilizar estas prosisteminas en su respectiva especie fue posible
detectar la produccin de ARNm de inhibidores I y II en papa y papa silvestre,
mientras que en chile slo fue detectado el ARNm del inhibidor II (Constabel et
al., 1998).
El tabaco carece de un gen homlogo a la prosistemina de jitomate
(Pearce et al., 2001). Sin embargo, produce una vigorosa respuesta localizada al
28
dao y tiene, adems, un sistema bien definido de sealizacin entre las hojas y
la raz mediado por cido jasmnico, el cual es responsable de la acumulacin
de nicotina en raz (Zhang y Baldwin, 1997).
200
160
140
120
100
80
60
40
20
2O
H
2.
5
25
p
2. M
5
p
25 M
0
fM
25
PSSYS
pM
p
25 M
0
fM
25
fM
PS 113
2.
5
2.
5
PS 185
pM
p
25 M
0
fM
25
fM
Inhibidor I (ug/ml extracto)
180
PS A195
B 180
140
120
100
80
60
40
20
SYS A17
Bu
f fe
r
PSA17
25
0
2.
5
0.
25
0.
02
5
SYS
2.
5
0.
2
0. 5
02
5
PS
2.
5
0.
2
0. 5
02
5
0
2.
5
0.
25
0.
02
5
Inhibidor I (ug/ml extracto)
160
A17
Figura 8. A y B) Acumulacin de inhibidores de proteasas en hojas de jitomate

tratadas con distintas concentraciones de prosisteminas recombinantes.
(Dombrowski et al., 1999).
29
Como se indic anteriormente, el anlisis de varias genotecas de ADNc

de hojas de tabaco revel la presencia de dos prosisteminas, denominadas proTobSys-A (165 aa) y pro-TobSys-B (164 aa), a partir de las cuales son liberadas
dos sisteminas mayoritarias (TobSys I y TobSys II) y una minoritaria (TobSys Ia)
(Pearce et al., 2001). En tabaco, el precursor ppTobHS-A se indujo en respuesta
a mltiples estmulos, incluyendo dao mecnico, AJ, cido abscsico, herbivora
por M. sexta e infestacin con B. tabaci. Su expresin generalmente precedi a
la acumulacin de transcritos de inhibidores de proteasa del tipo I y II y otros
genes de indole defensiva en tabaco, como una dioxigenasa inducida por
patgenos, por lo que se sugiere que al igual que LeSYS, TobSys juega un papel
importante en la regulacin de respuestas defensivas en N. tabacum, tanto a
nivel local como sistmico (Rocha-Granados et al., 2005).
2.6 Metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios proveen defensas contra la infeccin,

depredacin o agobio ambiental. La produccin de metabolitos secundarios
ocurre frecuentemente a concentraciones relativamente bajas en la mayora de
las familias de plantas. Por eso, parece razonable asumir que stos pudieran
estar implicados en relaciones de evolucin en aquellas especies que los
acumulan. Una caracterstica fundamental del metabolismo secundario, es que
los productos no estn uniformemente distribuidos a travs de la planta, sino que
frecuentemente estn limitados a rganos particulares, clulas y tejidos
particulares dentro del rgano (Rhodes, 1994).
El rgano en el cual los productos secundarios se acumulan es con
frecuencia diferente de aquel en donde ocurre la biosntesis. Por ejemplo, la
capacidad de biosntesis de nicotina est limitada a las races de la planta de
tabaco, aunque la nicotina se acumula tanto en hojas como en races (Baldwin et
al., 1997).
Las solanceas contienen diversos metabolitos secundarios, sindo los
grupos ms importantes los alcaloides, terpenos y componentes fenlicos. La
sntesis de estos metabolitos est bajo control gentico y depende crticamente
30
de las condiciones ambientales (Saitoh et al., 1985; Snook et al., 1986; Sisson y
Severson, 1990). Como se mencion lneas arriba, el AJ juega un papel
fundamental en la regulacin de la sntesis de novo de numerosos metabolitos
secundarios en cultivos celulares y en plantas de varias especies incluyendo los
alcaloides, terpenos, y compuestos fenlicos (Rickauer et al., 1997; Memelink et
al., 2001).
En N. tabacum y otras especies de Nicotiana, se ha comprobado el papel
fundamental de ciertos metabolitos secundarios en la defensa contra patgenos
e insectos plaga. Un ejemplo muy evidente de esta funcin se obtuvo de plantas
transgnicas de tabaco capaces de expresar constitutivamente la fitoalexina
resveratol, las cuales exhibieron una marcada resistencia contra el hongo
Botrytis cinerea (Hain et al., 1993).
2.6.1. Alcaloides (nicotina, nornicotina)
Ms de 12,000 alcaloides han sido aislados desde el descubrimiento de la

morfina. Alrededor del 20% de las especies de las plantas que florecen producen
alcaloides. Varios alcaloides son txicos para insectos o parsitos, aunque
algunas especies de insectos se han adaptado a los alcaloides pirrolizidinos que
se acumulan en las plantas. Para ello han desarrollado mecanismos para
utilizarlos para su propio beneficio, modificandolos como monoesteres por medio
de procesos enzimaticos o acumulndolos en tejidos especializados, llegando
inclusive a utilizarlos como precursores de feromonas para atraer a la hembra,
como es el caso del lepidptero Creatonotos transiens, o como sustancias de
defensa contra sus depredadores, tal como se ha observado en las larvas de
Tyria jacobaea (Buchanan et al., 2000; Wittstock y Gershenzon, 2002). El ataque
por herbvoros en tabaco silvestre estimula la biosntesis de nicotina. Se sabe
que diferentes genotipos de tabaco (N. tabacum) varan en su habilidad de
acumular y almacenar nicotina. Adems, en las especies nativas N. sylvestris, N.
attenuata, N. quadrivalvis y N. clevelandii se ha encontrado que el ataque por
insectos herbvoros incrementa dramticamente la sntesis y acumulacin de
nicotina. (Baldwin et al., 1998, 1999; Lou y Baldwin, 2003; Qu et al., 2004).
Cuando N. attenuata es atacada por diferentes herbvoros en su habitat natural,
31
la respuesta al ataque es el incremento sistmico en la produccin de dos

defensas directas: inhibidores de proteinasa (Glawe et al., 2003; van Dam et al.,
2001; Zavala et al., 2004a, 2004b) y nicotina (Baldwin, 2001). Los inhibidores de
tripsina interfieren en el aprovechamiento de proteinas esenciales durante la
digestin, afectando de igual modo el crecimiento y desarrollo del herbvoro
(Glawe et al., 2003; Zavala et al. 2004b). La nicotina puede actuar como toxina
defensiva, ya que se une a receptores de acetilcolina, interfiriendo as con el
sistema nervioso central (Wink, 1998). Ambas defensas se producen en distintas
partes de la planta: raz y tallo, respectivamente (Figura 9).
La nicotina es
seguida por la nornicotina en cuanto a abundancia, ya que este alcaloide

constituye el 3% y el 6% del total de alcaloides en hojas y raices de N. tabacum,
respectivamente (Saitoh et al., 1985). Se sintetiza a partir de la desmetilacin de
nicotina mediante un proceso oxidativo que involucra intermediarios cargados
positivamente (Botte et al., 1997).
N
H
CH3
N
Figura 9. Estructrua de la nicotina y nornicotina (izquierda y derecha,

respectivamente.
32
2.6.2. Compuestos fenlicos
Los
compuestos
fenlicos
derivados
de
la
ruta
fenilpropanoide,
sintetizados a partir de fenilalanina y tirosina, que a su vez se derivan de la ruta

del cido shiqumico, son metabolitos romaticos que tienen uno o ms grupos
hidroxilo unidos a un anillo romatico. El aumento en el contenido de fenoles
inhibe el crecimiento y regeneracin de plntulas; adems, stos actuan como
antioxidantes y como sustancias estructurales en los tejidos suberosos,
protegiendo de la desecacin y ataque de patgenos.
La formacin de suberina en tubrculos de papa daada, est dada por
un aumento de componentes fenlicos como ACG (Buchanan et al., 2000). Este
compuesto fenlico se encuentra parcialmente en los tricomas glandulares, los
cuales presentan actividad de PFO. Asimismo, el ACG aumenta despus de un
tratamiento con MeJA en N. attenuata y N. sylvestris (Keinnen et al., 2001).
La cafeoilputrescina, que es otro metabolito fenlico que se acumula en
hojas apicales, ovarios y flores de plantas de tabaco. Est implicado en
respuestas de resistencia a diversos tipos de estrs. Por ejemplo, los niveles de
este metabolito aumentan despus de exponer hojas de tabaco a ozono
(Langebartels et al., 1991); tambin se ha observado su aumento en cultivos
celulares de papa tratados con evocadores e infecciones fungosas (Keller et al.,
1996).
Sin embargo, otros fenoles, como el AS y su ster acetlico, inhiben la
expresin de los genes IP en L. esculentum debido al antagonismo con la ruta de
transduccin de seales dependiente de cido jasmnico y sistemina (Donnell
et al., 1996).
33
O
HO
O
NH2
N
H
CO2H
HO
cido saliclico
Cafeoilputrescina
O
COOH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
cido clorognico
Figura 10. Estructuras de compuestos fenlicos involucrados en defensa.
2.6.3 Terpenos
Los isoprenoides o terpenos es el grupo de metabolitos secundarios en

plantas con mayor nmero de estructruras reportadas hasta la fecha, que es de
aproximadamente 24,000 (Gershenzon y Kreis, 1999). Los isoprenoides
clasificados
como
metabolitos
secundarios
incluyen
monoterpenos,
sesquiterpenos y diterpenos. Son considerados como secundarios porque

aparentemente no son necesarios para las funciones vitales de la clula; sin
embargo, participan en importantes interacciones entre plantas y su medio
ambiente. Ejemplos de esto son la interaccin planta-planta (Rocha-Granados et
al., 2005), planta-insecto (Dicke, 1994; Par y Tumlinson, 1997) y plantapatgeno (Croft et al., 1993).
34
Los terpenos poseen un nmero importante de funciones en las plantas

(Kleining, 1989; Rodrguez-Concepcin y Gruissem, 1999). Con respecto a
funciones defensivas en tabaco, varios reportes indican que los diterpenos
glicosilados 16-hidroxigeranilinalool A y B en tabaco implican antibiosis contra
Heliothis virescens F. ya que slo se encuentran presentes en variedades
resistentes de N. tabacum (Snook et al., 1986).
Un sesquiterpeno de gran importancia en chile (Capsicum annuum),
tabaco y otras plantas solanceas es el capsidiol. Su acumulacin en estas
plantas, la cual es inducida por factores biticos y abiticos, limita la dispersin
de patgenos en los tejidos infectados. Sin embargo, es un metabolito inestable
ya que sus niveles en plantas decaen rpidamente despus de su sntesis
(Lozoya-Gloria, 2004). Numerosos reportes indican que la acumulacin de
capsidiol en las hojas de plantas de N. tabacum se debe casi exclusivamente en
respuesta a patgenos (sin embargo consultar Bohlmann et al., 2002).
A su vez, algunos diterpenos (duvanos y labdanos) son componentes de
la capa de cutcula en hojas de tabaco cuya presencia se ha asociado con
resistencia a insectos masticadores (H. virescens) y chupadores (el fido M.
persicae) (Johnson y Severson, 1982). Recientemente, se descubri tambin
que un diterpeno tipo labdano llamado WAF-1, acta como una seal endgena
durante la activacin de respuestas defensivas contra dao mecnico y la
infeccin por el virus del mosaico del tabaco (Ohashi et al., 2003).
35
OH
HO
HO
Capsidiol
CH3
O
OH
OH
Dihidrocapsenona
CH2OH
O
CH2
OH
OH
OH
OH
O
CH3
OH
OH
O
OH
OH
OH
16-hidroxigeranilinalool
OH
WAF-1
Figura 11. Estuctura del capsidiol y su producto de degradacin

dihidrocapsenona, y otros terpenos involucrados en defensa
36
2.7. Modelo de estudio
2.7.1. Plantas de tabaco transformadas con prosistemina y sistemina

de jitomate (Nt-LePS 08, Nt-LeSYS 03 y WT Nt-LeSYS 03)
El genero Nicotiana es dividido en tres subgneros, 14 secciones y 66
especies; pertenece a la sub-tribu Nicotianae de la familia de las solanceas
(Goodspeed, 1954). Se sabe que a diferencia de varias especies de la sub-tribu
Solaneae, el tabaco no posee homlogos de la prosistemina de L. esculentum
(LePS) (Pearce et al., 2001).
En un trabajo previo (Rocha-Granados, 2004) se generaron varias lneas
de plantas de tabaco sobre-expresantes de prosistemina (LePS) y sistemina
(LeSYS) de jitomate. De stas, se selecciono una lnea sobreexpresantes de
LeSYS: Nt-LeSYS 03 pues el anlisis bioqumico mostro los mayores niveles de
actividad de inhibidores de proteasas, PFO y poligalacturonasas basales e
inducidos por dao (Fig. 12). Ademas se selecciono una sola sobreexpresante
de LePS: Nt-LePS, 08,
pues presento una acumulacin mayor de IT y PG
basales. A su vez, la lnea Nt-LeSYS 03 mostr un fenotipo alterado,

caracterizado por anomalas tanto morfolgicas como fisiolgicas (ver ms
adelante), las cuales desaparecieron en la cruza WT Nt-LeSYS 03. Esta ltima
cruza tambin se incluy en este estudio para ser comparada con la lnea NtLeSYS 03.
37
ACTIVIDAD ESPECIFICA.
2100
1800
IT
1500
1200
HL
900
HS
600
300
0
0
16 24
Wt
16 24
16 24
S1
S3
16 24
CS3
16 24
Ps1
16 24
Ps8
16 24
Ps10
16
D.O./min/mg protena
14
PFO
12
10
8
HL
HS
4
2
0
0
16
24
Wt
16 24
S1
16
24
S3
16 24
CS3
16 24
Ps1
16
24
Ps8
16 24
Ps10
200
nmol/min/mg protena
180
PG
160
140
120
100
HL
80
HS
60
40
20
0
0
16 24
Wt
Figura
12.
16 24
S1
Niveles
16 24
S3
de
16 24
CS3
inhibidores
16 24
Ps1
de
16 24
Ps8
tripsina
16 24
Ps10
(IT),
PFO
poligalacturonasas (PG) inducibles por dao en hoja local (HL) y hoja sistemica
(HS) en hojas de tabaco silvestres (Wt), y en plantas transformadas con LePS y
LeSYS (Rocha-Granados, resultados no publicados).
38
2.7.2. Alteraciones morfolgicas y fisiolgicas en la lnea Nt -LeSYS

03.
La lnea Nt-LeSYS 03 mostr una acumulacin altamente significativa de
actividad inhibitoria contra tripsina (IT), quimotripsina (IQT) y PFO. Adems, esta
lnea se caracteriz por desarrollar un fenotipo con numerosas alteraciones
morfolgicas y fisiolgicas, las cuales de describen a continuacin: hojas ms
pequeas y lanceoladas (Figura 13, B y D), con numerosas regiones necrticas
sobre la superficie de sus hojas, semejantes a las generadas durante la reaccin
hipersensible en una interaccin planta-patgeno incompatible; senescencia ms
acelerada de sus hojas; desarrollo y crecimiento ms rpido de los brotes
laterales, aunque de mucho menor tamao que la planta sin transformar (Figura
13 A y 14 B); ausencia de un pecolo bien definido, el cual ms bien semeja una
prolongacin de la hoja (Figura 15 B) y alteraciones morfolgicas en flores, que
fueron ms pequeas y con estambres de talla menor al pistilo, lo cual contrast
con las flores de plantas de tabaco WT, que normalmente desarrollan estambres
largos que sobresalen del pistilo para permitir la cada del polen maduro sobre
ste y as asegurar la autofecundacin (Figura 14 A, Figura 15 D y G a la
derecha, a la izquierda en 15 F y 15 G). Adems, los sacos polnicos de las
plantas Nt-LeSYS 03 produjeron muy poco polen. Es muy probable que estas
dos anomalas se combinaron para impedir su autofecundacin natural. La
fecundacin fue altamente ineficiente, ya que la mayora de las cpsulas
producidas estaban vacas y solamente en algunas se encontr semilla.
Adems, las pocas semillas producidas por las plantas Nt-LeSYS 03 germinaron
mucho ms lentamente que las semillas de las plantas no transformadas. De
modo que no se observ emergencia despus de un mes de haber sembrado las
semillas de las plantas transformadas, mientras que la germinacin de las
semillas de plantas control no tard ms de 3 semanas (Figura 15 A) (RochaGranados, 2004). Por estas caractersticas se opt por cultivar esta lnea in vitro
para agilizar la generacin de las plantas necesarias para los experimentos.
39
CRECIMIENTO
WT
Nt-LeSYS 03
WT
Nt-LeSYS 03
WT
Nt-LeSYS 03
Nt-LeSYS 03
Figura 13. I. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con

sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). En los paneles A, B, C se pueden observar las
diferencias entre plantas Nt-LeSYS 03 y WT. En el panel (A), se muestran
plantas de la misma estatura pero de diferente edad. Mientras que en los
siguientes pneles se observa clararmente la diferencia en tamao entre plantas
de la misma edad (B) y en la morfologa de las hojas (C y D).
40
Figura 14. II. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con
sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). Observese en el panel (A) hacia la izquierda
que el pstilo sobresale de los estambres. En el panel B se muestra la
generacin espontnea en la superficie de las hojas de regiones necrticas
localizadas semejantes a las que se forman durante la reaccin hipersensible.
41
GERMINACIN
DESARROLLO DEL PECIOLO

B
FLORACIN ANORMAL
Figura 15. III. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con
sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). En el panel (A), la semilla de las plantas NtLeSYS 03 present un claro retardo en la tasa de germinacin, y el desarrollo
subsiguiente de las plntulas fue muy lento con respecto al control, mientras que
en los paneles (B) y (C) las flechas sealan las diferencias en el desarrollo de los
pecolos de las hojas entre plantas control (B) y las plantas Nt-LeSYS 03 (C). En
los paneles D, E y F, se muestran diferencias morfolgicas observadas en las
flores de plantas Nt-LeSYS 03 con respecto al testigo. La fotografa del panel (G)
muestra que las flores de las plantas Nt-LeSYS 03 (derecha) son ms pequeas
que las flores de la planta WT (izquierda). Adems, los estambres de las plantas
Nt-LeSYS 03 fueron mas cortos (E, a la Izquierda, F, a la derecha), que los
desarrollados en las plantas control (D, a la derecha, F, a la izquierda) y no
produjeron suficiente polen (tomado de Rocha-Granados, 2004).
42
2.7.3. Resistencia a herbivora por larvas de Manduca sexta
en
plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS
Como se mencion lneas arriba, estudios previos demostraron que las

plantas de jitomate capaces de expresar el gen de la prosistemina en orientacin
antisentido fueron ms susceptibles al dao causado por larvas de Manduca
sexta que las plantas control (Orozco-Crdenas et al., 1993), mientras que
aquellas capaces de expresarlo en orientacin sentido presentaron una mayor
resistencia a insectos que se alimentan del contenido celular (Li et al., 2002b).
Tomando en consideracin estos antecedentes, era posible esperar que las
plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS presentaran igualmente una mayor resistencia a la
depredacin por larvas de Manduca sexta, debido a los altos niveles
constitutivos y/o inducibles de IT, IQT y PFO, que son protenas involucradas en
las defensas de las plantas contra el ataque de insectos, detectados en algunas
de las lneas (Figura 12). De modo que las plantas Nt-LePS 01, 08, 10 y 32 y NtLeSYS 01, fueron expuestas al ataque continuo de larvas de M. sexta durante 6
das. Los resultados mostrados en las Figuras 16 (A y B) y 17 indican que las
larvas que se alimentaron de las plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS presentaron una
reduccin significativa en peso y tamao en relacin a las larvas que se
alimentaron de las plantas control. En la Figura 18 se aprecia tambin que la
magnitud del dao causado por las larvas en las plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS
fue claramente menor al que se produjo en las plantas control, las cuales fueron
prcticamente defoliadas. Sin embargo, la clara resistencia a la herbivora por M.
sexta mostrada por todas las lneas de plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS 01 no
coincidi con los resultados obtenidos con la lnea LeSYS 03, la cual result
altamente susceptible a la herbivora por larvas de M. sexta (Rocha-Granados,
resultados no publicados) a pesar de que los ensayos bioqumicos mostraron
una acumulacin robusta de protenas relacionadas con defensa en respuesta a
dao mecnico (Figura 12). Esto sugiere que otros factores pudieran estar
involucrados en la resistencia a la herbivora observada en las plantas
transgnicas; una posibilidad podra ser la acumulacin de nicotina y/u otros
metabolitos secundarios asociados con resistencia a insectos, como el ACG y
nornicotina.
43
Control
A
Transform adas
Figura 16. Larvas de Manduca sexta antes (A) y 6 das despus (B) de haber
sido alimentadas con plantas de tabaco sin transformar (B, a la izquierda) o con
plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS (B, a la derecha) (Tomado de Rocha-Granados,
2004).
Peso (g) y longitud (cm)
10
Lo ng itu d
P eso
c
6
d
4
C o ntro l
T ran sfo rm ad as
Figura 17. Anlisis del crecimiento de larvas de M. sexta alimentadas con

plantas de tabaco sin transformar y plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS. La grfica
muestra el peso y longitud de las larvas alimentadas en plantas transgnicas y
control, en donde el promedio, error estndar, anlisis de varianza y prueba de
significancia se determinaron con una confiabilidad del 95%, usando el paquete
estadstico SPSS 10.0 para Windows. Con un nivel de significancia P0.01
(Tomado de Rocha-Granados, 2004).
44
LePS
LePS
Control
Figura 18. Vista general de la magnitud del dao causado por larvas de M. sexta
en plantas de tabaco sin transformar (control) y transformadas (Nt-LePS y NtLeSYS) (Tomado de Rocha-Granados, 2004).
45
3. HIPTESIS
La resistencia diferencial ante la folivora por larvas de Manduca sexta y

las alteraciones fenotpicas observadas en plantas transgnicas de Nicotiana
tabacum capaces de sobreexpresar la sistemina o la prosistemina de
Lycopersicon esculentum puede ser el reflejo de modificaciones en la sntesis y
acumulacin de metabolitos secundarios relacionados con defensa y/o
desarrollo.
46
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Identificacin y cuantificacin de metabolitos secundarios en plantas de

tabaco (Nicotiana tabacum) transformadas con sistemina y prosistemina de L.
esculentum en respuesta a dao mecnico, herbivora por Manduca sexta e
infestacin con mosquita blanca (Bemisia tabaci).
4.2. Objetivos especficos
1. Identificacin y cuantificacin de los niveles basales de metabolitos

secundarios (nicotina, nornicotina, cido clorognico y capsidiol),
mediante GC/MS en hoja y raz de plantas transformadas de tabaco (NtLePS 08, Nt-SYS 03 y WT Nt-LeSYS 03) en dos etapas distintas de
desarrollo.
2. Cuantificacin de fenoles totales en hoja y raz de plantas transformadas

de tabaco (Nt-LePS 08, Nt-SYS 03 y WT Nt-LeSYS 03) en dos etapas
distintas de desarrollo.
3. Identificacin y cuantificacin de nicotina, nornicotina, cido clorognico y

capsidiol, en hoja y raz de plantas transformadas de tabaco (Nt-LePS 08,
Nt-SYS 03 y WT x Nt-LeSYS 03) sometidas a dao mecnico, folivora
por larvas de Manduca sexta e infestacin por Bemisia tabaci.
4. Cuantificacin de fenoles totales en hoja y raz de plantas transformadas

de tabaco (Nt-LePS 08, Nt-LeSYS 03 y WT Nt-LeSYS 03) sometidas a
dao mecnico, folivora por larvas de Manduca sexta e infestacin por
Bemisia tabaci.
47
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. Cultivo de plantas

Las semillas de plantas Nt-LePS 08 y WT Nt-LeSYS 03, fueron
germinadas en charolas de germinacin y despus de 2 semanas se
transplantaron a macetas de 750 ml para plantas jvenes y macetas de 2.35 l
para plantas adultas con una mezcla general de tierra formada por 3 partes de
Sunshine Mix 3 (SunGro Horticulture, Canada), 1 parte de vermiculita (SunGro
Horticulture, USA) y 1 parte de perlita (Termolita S.A., Mxico). Previamente a la
realizacin de los experimentos, se realiz la prueba histoqumica de GUS para
la deteccin de las transformantes (homo y heterocigotas; ver ms adelante); las
plntulas que resultaron positivas fueron seleccionadas. Una vez seleccionadas,
se creci una planta por maceta, fertilizandose cada semana con una solucin
nutritiva 20-10-20 (N-P-K) (Peters Professional; Scotts-Sierra Horticultural
Products Co, Marysville, OH, EUA).
5.2. Cultivo in vitro de la lnea Nt-LeSYS 03
Para el desarrollo de este trabajo se parti de las hojas ms jvenes de

tabaco de la lnea Nt-LeSYS 03 las cuales fueron lavadas con jabn comercial y
desinfectadas, por espacio de 10 min en agua destilada estril + Tween 20 al
0.1% e hipoclorito de sodio (cloro comercial) al 10% (v/v). Posteriormente, fueron
enjuagadas varias veces con agua destilada estril. Las hojas se fragmentaron
en trozos de 0.5 cm 0.5 cm; posteriormente se cultivaron in vitro en frascos de
vidrio de 300 ml, con tapa de rosca, que contenan 40 ml de medio MS slido
(Murashige y Skoog, 1962), el cual contiene lo siguiente:
48
Composicin del medio de cultivo

Sacarosa o azcar comercial
30 g
Sales de Murashige y Skoog
4.32 g
Mioinositol
1g
Vitaminas de Murashige y Skoog
1 ml
Bencil amino purina
0.5 mg/l
Agar
8g
Nota: ajustar el pH=5.7 1, antes de agregar el agar,
cristalizar el medio por 10 minutos en el horno de microondas
y esterilizar a 121 C por 20 min.
La regeneracin a partir de hoja tard aproximadamente 2 meses y

medio, hasta la obtencin de plntulas a una temperatura de 25 C, con un
fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad, cambiando una sola vez el tejido a
cultivo nuevo. A partir de tallos de plntulas la regeneracin tarda de 15 a 20
das. Despus de este lapso de tiempo, las plntulas de esta lnea se utilizaron
para posteriores experimentos.
5.3. Preparacin de X-Gluc
Para realizar la prueba histoqumica de GUS, se utiliz el mtodo descrito

por Jefferson et al., (1987). El ensayo se realiz cuando las plntulas
presentaban un par de hojas bien desarrolladas. Para ello se tomaron pequeos
segmentos de hoja de plantas transformadas de tabaco Nt-LePS 08, Nt-SYS 03,
as como de la cruza de WT Nt-LeSYS 03 los cuales fueron sumergidos en la
solucin X-Gluc y puestos en la oscuridad a 37 C durante toda la noche. La
clorofila de los tejidos fue removida lavando varias veces con etanol al 70%.
Finalmente se lavaron con una mezcla de metanol: acetona, 3:1 (v/v), hasta que
pudieron verse claros. Los tejidos ya desteidos se visualizaron en un
microscopio estereoscpico.
La solucin stock para la preparacin del X-Gluc consisti de los siguientes
reactivos:
49
Solucin stock
Concentracin final
NaH2PO4 al 1 M
EDTA 0.5 M pH 8
Ferrocianuro de
potasio 0.005 M, pH 7
X-Gluc 0.02 M*
Triton X-100 10%
Agua destilada
100 Mm
10 Mm
0.5 Mm
Mezcla
(ml)
10.0
20.0
10.0
1 mM
0.1 %
_
1.0
0.1
58.9
*en 50 mg/ml de dimetilformamida o DMSO
Una vez preparada la solucin stock, se esteriliz por filtracin (0.22 m) y se

almacen en la oscuridad a 4 C.
5.4. Ensayos de dao mecnico
Para realizar los experimentos de dao mecnico se utilizaron tres plantas

de tabaco de cada una de las lneas en estudio, Nt-LePS 08, Nt-SYS 03 y WT
Nt-LeSYS 03. Como controles se usaron tres plantas WT por cada lnea
transformada utilizada.
Plantas jovenes de cuatro semanas que presentaban 4 hojas bien
desarrolladas fueron heridas en su 3 hoja (considerando como la primera hoja a
la ms desarrollada, en la base de la planta) utilizando unas pinzas metlicas de
diseccin estriles y presionando cuatro veces a lo largo de la hoja y
perpendicularmente a la vena principal. Despus del quinto da se colectaron las
hojas daadas (respuesta local) y la hoja adyacente superior sin daar
(respuesta sistmica). De igual forma, el ensayo se realiz en plantas adultas de
siete semanas, con 16-20 hojas bien desarrolladas. Para ello, la hoja media (hoja
8, 9 o 10), que representa la transicin entre tejido fuente-consumidor en N.
tabacum (Masclaux et al., 2000) fue herida; esta hoja (respuesta local), las hojas
distales intactas, inferior (hacia la base) y superior (hacia el pice), localizadas
filotcticamente en un ngulo de 0 con respecto a la hoja daada y la raz
50
fueron colectadas 5 das despus de haber aplicado el dao (respuestas

sistmicas).
5.5. Bioensayos
5.5.1. Condiciones del experimento de herbivora con M. sexta
Para este experimento se utilizaron las mismas lneas de plantas

transgnicas de tabaco empleadas anteriormente para los ensayos de dao
mecnico. Las plantas se mantuvieron en una cmara de crecimiento (Conviron,
USA) a una temperatura constante de 28 C y bajo un fotoperiodo de 16 h luz y
8 h oscuridad. Las larvas de Manduca sexta Linnaeus empleadas se
encontraban en el quinto instar de desarrollo. Estas larvas fueron crecidas en el
insectario del Cinvestav-Unidad Irapuato y alimentadas con una dieta artificial, a
base de germen de trigo, casena, azcar, levadura y una mezcla de sales,
suplementada con vitaminas (Yamamoto, 1964). Las larvas permanecieron sin
alimento durante un perodo de 12 h previo al inicio del experimento. El ensayo
de herbivora se realiz cuando las plantas alcanzaron una longitud de 40 cm y
tenan entre 16 y 20 hojas bien desarrolladas; este bioensayo se inici colocando
una larva de M. sexta por planta, en la parte media de la planta (hoja de
transicin entre tejido fuente-consumidor). Las larvas se alimentaron libremente
por un periodo de 24 horas. Transcurrido este tiempo, las larvas se retiraron de
las plantas; la coleccin del tejido (hoja daada, hojas distales en la regin apical
y basal y raz) fue hasta cinco das despus.
51
5.5.2. Infestacin con mosquita blanca (Bemisia tabaci)
Para realizar estos ensayos se utilizaron 70 mosquitas (Bemisia tabaci

Gennadius) libres de virus y recin emergidas para infestar 2 hojas por planta
(35 mosquitas/hoja). Las plantas que se utilizaron fueron plantas jvenes de
cuatro hojas, en las cuales se colocaron 2 pequeas jaulas (clip cages; de 4 cm
de dimetro y 3.5 cm de altura) fabricadas a partir de vasitos de unicel del
nmero cero, adheridas a las hojas 2 y 3, contando desde la base de la planta.
En stas se introdujeron las mosquitas para obligarlas a ovipositar en un rea
delimitada de la hoja por un perodo de 24 h. Una vez transcurrido este tiempo,
las mosquitas fueron retiradas y las plantas se mantuvieron por 28 das
adicionales en un cuarto de crecimiento (2.3 m [ancho] 4.2 m [largo] 3 m
[alto]), bajo condiciones controladas de luz, temperatura y fotoperodo (16 h luz a
28C/8 h oscuridad a 20 C), para permitir la terminacin del ciclo de vida de la
mosquita blanca. Una vez cumplidos los 28 das se consider a las dos hojas
infestadas originalmente como hojas locales, mientras que las hojas distales
localizadas filotcticamnte en un ngulo de 0 (considerado el tejido con la
mxima coneccin vascular con las hojas infestadas), en la parte basal y apical
de la planta, respectivamente, y la raz, fueron colectadas para medir la
respuesta sistmica.
5.6. Preparacin de extractos
La extraccin de metabolitos secundarios, se llev a cabo a partir de tejido

molido (con N2 lquido) y congelado (a 80 C) de hoja y raz, de las lneas
seleccionadas Nt-LePS 08, Nt-SYS 03 y WT Nt-LeSYS 03 sometidas a los
diferentes tratamientos anteriormente descritos. Para ello, se pesaron 200 mg de
tejido fresco en 1 ml de una solucin de metanol acuoso (40% metanol v/v)
conteniendo 0.5% (v/v) de cido actico y 0.1 mg/ml de timol, el cual se emple
como estandar interno, para el anlisis por GC/MS. Las mezclas se agitaron
vigorosamente por 2 horas a 4 C y se centrifugaron por 15 minutos a 12,000
52
rpm y a la misma temperatura. Los sobrenadantes obtenidos se filtraron y fueron

utilizados inmediatamente para el anlisis de los metabolitos de inters.
5.7. Anlisis de fenoles totales
La cuantificacin de fenoles totales presentes en los extractos

metanlicos se realiz de acuerdo al mtodo de Folin (Swain y Hillis, 1959)
adaptado para su uso en microplacas de 96 pozos. Para ello, se tomaron 10 l
de muestra y se aforaron a 50 l con agua desionizada. Se agregarn 50 l del
reactivo de Folin (diludo en una proporcin 1:2) y 100 l de carbonato de sodio
al 7.5% (w/v). La mezcla se incub a 45 C por 15 minutos y se dej enfriar a
temperatura ambiente por 10 a 15 min. Las lecturas se hicieron en un lector de
placas (Ultramark; Microplate Imaging System; BioRad Laboratories, Hercules,
CA, EUA) por triplicado a una longitud de onda de 750 nm y se compararon con
una curva patrn preparada con cido cafico (en un rango de 15 a 500 g/ml).
5.8. Condiciones para cuantificar e identificar metabolitos secundarios por

GC/MS
5.8.1 Derivatizacin
Para el anlisis de metabolitos secundarios por GC/MS, fue necesario

producir derivados silanizados de menor polaridad con la finalidad de
incrementar su volatilidad y su estabilidad trmica. Para ello, se sigui la
metodologa descrita por Fiehn et al., (2000). De modo que los extractos
metanlicos acidificados (250 l) se evaporaron a sequedad empleando un
sistema de concentracin al vaco (Heto Maxi Dri Lyo, Termo Electron
Corporation, Allerd, Dinamarca). Posteriormente, los extractos secos fueron
derivatizados inicialmente en una solucin de 50 l de piridina en 20 l
metoxiamina, la segunda reaccin de derivatizacin se inici inmediatemente
despus de este tiempo mediante la adicin directa de 80 l de metil-trimetil-
53
sililtrifluoracetamina (MSTFA). La nueva mezcla reactiva se incub a 37 C por

30 minutos. Las mezclas derivatizadas se dejaron reposar por dos horas a 25 C
antes de inyectar la muestra al sistema GC/MS. La metoximacin y la
trimetilsilanizacin estn diseadas para permitir la derivatizacin y anlisis de
hidroxi y amino cidos, alcoholes, azcares, poliaminas y cidos aromticos,
entre otros (Fiehn et al., 2000).
5.8.2 Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas

(GC/MS).
Los
compuestos
derivatizados
fueron
analizados
por
medio
de
cromatografa de gases usando un cromatgrafo de gases (Hewlett-Packard

5890 Series II), equipado con una columna capilar HP-1 de 30 m de largo, 0.25
mm de dimetro interior y 0.25 m de pelcula fina a base de dimetilpolisiloxano y
acoplado a un detector selectivo de masas (Hewlett-Packard/MSD 5972 series).
Se emple helio como gas acarreador, a un flujo constante de 1 ml/min. La
temperatura del inyector fue mantenida a 230 C y a una presin de 8.75 psi.
Para realizar las separaciones, se us el siguiente perfil de tiempo/temperatura:
la temperatura inicial del horno fue de 70 C, seguido por un incremento gradual
de la temperatura hasta 310 C, a una velocidad 1.0 C/min. El tiempo total de
corrida fue de 54 minutos; cada una se inici despus de la inyeccin de 1 l de
las muestras derivatizadas. Los picos fueron identificados mediante la
comparacin con los espectros de masas y tiempos de retencin de estndares
comerciales de referencia.
5.9. Curvas de calibracin
Se realizaron curvas de calibracin para nicotina, nornicotina, cido

clorognico y capsidiol. Las curvas se hicieron usando estandares comerciales
(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) con excepcin del capsidiol,
el cual se purific, por medio de cromatografa fina, a partir de extractos de fruto
54
de chile ancho (Capsicum annuum) tratado con hemicelulasa de Aspergillus

niger (Brooks et al., 1985). Los estndares se derivarizaron igual que las
muestras, a excepcin de la nicotina, la cual se diluy con metanol e inyect
directamente. Para la derivatizacin, se tomaron 10 l de cada una de las
muestras empleadas para generar las curvas tipo, las cuales se evaporaron a
sequedad, para ser posteriormente derivatizadas en las mismas condiciones que
se emplearon para las muestras problema. Cada punto de la curva de calibracin
se prepar por duplicado y se evalu por GC/MS.
Los resultados obtenidos fueron analizados para obtener las curvas de
calibracin de cada uno de los metabolitos, incluyendo sus respectivas
pendientes y coeficientes de correlacin r (que fueron superiores a 0.95 en todos
los casos). Con estas curvas se obtuvieron las ecuaciones para cuantificar cada
uno de los metabolitos de inters (ver apndice).
5.10. Anlisis estadstico
Se analizaron tres plantas por lnea seleccionada para el experimento de

dao mecnico y mosquita blanca, y de tres a cinco plantas por lnea para el
experimento de herbivora. Las lecturas se hicieron por duplicado en todos los
anlisis por GC-MS. Para el anlisis de fenoles totales, cada extracto se midi
por triplicado. Los datos fueron sometidos a un anlisis de varianza de una va
(ANOVA), utilizando para ello el programa JMP, versin 3.1.6.2., para Windows.
Los datos se reportaron como medias. stas se compararon entre s para
detectar diferencias significativas empleando el mtodo de Tukey, que es un
estimador que permite diferenciar valores calculados con un valor tabulado que
se determina en base a los grados de libertad y a una probabilidad de error.
55
6. RESULTADOS
6.1. Identificacin de metabolitos secundarios de inters por GC/MS, en

plantas jvenes y adultas
El anlisis de los metabolitos de inters se realiz por GC/MS, que result

ser una tcnica analtica ms verstil para el anlisis de un elevado nmero de
C
muestras que la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), cuyo uso se
explor tambin en este trabajo (resultados no mostrados). La identificacin se
hizo por comparacin con el tiempo de retencin y espectro de masas de
compuestos de referencia disponibles comercialmente (ej., nicotina, nornicotina,
y cido clorognico) o bien purificados a partir de tejidos vegetales (e.g.,
capsidiol). Esta estrategia se emple debido a la relativa complejidad de los
cromatogramas (se muestra un ejemplo tpico en la Fig. 19), en los cuales se
podan apreciar numerosos picos cuyos espectros de masa resultaron de difcil
interpretacin debido a que muchos de ellos se encontraban aparentemente
modificados, especialmente por oligosacridos. La comparacin entre el tiempo
de retencin y espectro de masas de los compuestos de inters presentes en las
soluciones de referencia y en los extractos metanlicos crudos de tabaco
analizados, se muestran a continuacin para nicotina (Figs. 20 y 21), cido
clorognico (Figs. 22 y 23), capsidiol (Figs. 24 a 26) y nornicotina (Figs. 27 y 28).
En este ltimo caso, slo se pudo detectar un producto de degradacin del
capsidiol en los extractos, lo que coincidi con la conocida inestabilidad de este
compuesto in vivo (Ward et al., 1977; Guedes et al., 1982; Whitehead et al.,
1987; Threlfall y Whitehead, 1988).
56
Abundance
TIC: NT193b.D
1.2e+07
1.1e+07
1e+07
9000000
8000000
7000000
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
15.83
T
1000000
5.00
*20.05
*
32.78
48.83
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
Time-->
Figura 19. Cromatograma tpico obtenido al separar extractos metanlicos

derivatizados de hoja de Nicotiana tabacum por GC/MS. La nicotina emergi
despus de 15.83 min (*); timol (T), empleado como estndar interno) despus
de 15.71 min (*); nornicotina despus de 20.05 min (*); el posible producto de
degradacin del capsidiol (dihidrocapsenona) despus de 32.78 min (*), y el
cido clorognico despus de 48.83 min (*).
57
Abundance
TIC
: nic102a.D
15.80
2400000
2200000
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
45.00
50.00
Tim
e-->
Abundance
Scan 2173 (15.811 min): nic102a.D

84
450000
400000
350000
300000
250000
200000
133
150000
161
100000
42
50000
0
51
30
30
40
50
58
65
60
70
119
92
77
80
99105
90
145
100 110 120 130 140 150 160 170
m/z-->
Figura 20. A) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de nicotina, con un

tiempo de retencin de 15.80 min (*), y B) su correspondiente espectro de
masas.
58
Abundance
TIC: NT193b.D
4000000
3500000
3000000
14.84
2500000
2000000
15.83
1500000
16.74
15.39
1000000
16.82
15.35
18.57
14.20
500000
19.02
15.70
14.50
15.00
15.50
16.00
16.50
17.00
17.50
18.00
18.50
19.00
Tim
e-->
Abundance
B
450000
Scan 2360 (15.821 min): NT193b.D

84
400000
350000
300000
250000
200000
133
150000
161
100000
42
50000
119
65
105
0
40
60
80
145
207
299
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z-->
Figura 21.
A) Cromatograma tpico de GC/MS de un extracto de hojas de
Nicotiana tabacum, identificando a nicotina con un tiempo de retencion de 15.83

min (*) , y B) su correspondiente espectro de masas.
59
Abundance
TIC: clorogenico30a.D
48.90
1.25e+07
1.2e+07
1.15e+07
1.1e+07
1.05e+07
1e+07
9500000
9000000
8500000
8000000
7500000
7000000
6500000
6000000
5500000
5000000
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
47.22
38.00
40.00
42.00
44.00
46.00
48.00
50.00
52.00
Time-->
Abundance
500000
Scan 8289 (48.812 min): clorogenico30a.D

345
450000
400000
73
350000
300000
255
250000
307
200000
150000
147
100000
191
219
397
50000
372
45
0
50
103
127
100
283
167
150
200
250
300
419
350
400
462 491
450
m/z-->
Figura 22.
A) Cromatograma de GC/MS del estndar puro del cido
clorognico, con un tiempo de retencin de 48.90 min (*), y B) su espectro de

masas.
60
Abundance
800000
TIC: NT193b.D
750000
700000
650000
600000
550000
500000
450000
400000
48.83
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
46.50 47.00 47.50 48.00 48.50 49.00 49.50 50.00 50.50 51.00 51.50 52.00
Time-->
Abundance
Scan 8479 (48.829 min): NT193b.D

345
55000
50000
45000
73
40000
35000
30000
255
307
25000
20000
15000
147
10000
191 219
5000
45
0
50
103123
100
283
167
150
200
250
300
372
326
350
397
419
400
462
450
m/z-->
Figura 23.
Nicotiana tabacum, identificando al cido clorognico con un tiempo de retencion

de 48.83 min (*), y B) su correspondiente espectro de masas.
61
Abundance
1100000
TIC: estCAP1.D
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
32.35
32.18
200000
100000
0
31.80
31.90
32.00
32.10
32.20
32.30
32.40
32.50
32.60
32.70
32.80
32.90
33.00
33.10
Time-->
Abundance
32000
Scan 5393 (32.187 min): estCAP1.D

73
30000
28000
26000
24000
22000
20000
18000
16000
319
14000
147
12000
10000
220
8000
6000
189
4000
2000
103
45
243
169
271291
361
451
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
m/z-->
Figura 24. A) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de capsidiol [32.35

min (*)] derivatizado y un producto de degradacin estable [posiblemente
capsenona, con un tiempo de retencin de 32.18 min (*),, y B) el espectro de
masas correspondiente al pico surgido a los 32.18 min.
62
Abundance
TIC: estCAP1.D
1100000
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
32.35
32.18
200000
100000
0
31.80
31.90
32.00
32.10
32.20
32.30
32.40
32.50
32.60
32.70
32.80
32.90
33.00
33.10
Time-->
Abundance
Scan
5421
(32.338
min):
estCAP1.D
73
25000
24000
23000
22000
365
21000
20000
275
19000
18000
290
17000
16000
15000
14000
13000
12000
11000
10000
9000
8000
7000
6000
219
249
5000
117
4000
91
3000
2000
157
193
133
45
380
234
1000
173
319
337
0
40
60
80
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
m/z-->
Figura 25. A) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de capsidiol [32.35

min (*)] derivatizado y un producto de degradacin estable [posiblemente
capsenona, con un tiempo de retencin de de 32.18 min (*), y B) el espectro de
masas correspondiente al pico surgido a los 32.35 min.
63
Abundance
340000
320000
TIC: NT193b.D
300000
280000
260000
240000
32.78
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
32.3032.4032.5032.6032.7032.8032.9033.0033.1033.2033.3033.4033.5033.60
Time-->
Abundance
48000
46000
Scan 5503 (32.775 min): NT193b.D

204
44000
42000
40000
38000
36000
34000
73
32000
30000
28000
26000
24000
22000
20000
18000
16000
14000
319
12000
10000
147
8000
6000
4000
2000
103
45
128
0
50
100
233
172
150
200
259
250
291
300
466
361
350
400
450
m/z-->
Figura 26.
Nicotiana tabacum, identificando a un posible producto de degradacin del

capsidiol con un tiempo de retencion de 32.78 (*), y B) su correspondiente
espectro de masas.
64
Abundance
TIC
: nornicotinastd3a.D
20.54
600000
550000
500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
30.00
32.00
34.00
Tim
e-->
Abundance
Scan 3063 (20.618 min): nornicotinastd3a.D
142
19000
18000
17000
16000
15000
14000
13000
12000
11000
10000
9000
8000
7000
73
6000
5000
4000
205
3000
2000
1000
220
191
45
59
32
88
106
118
132
177
0
30
40
50
60
70
80
90 100110120130140150160170180190200210220
m/z-->
Figura 27. A) Cromatograma de GC/MS del estndar puro de nornicotina

derivatizado, con un tiempo de retencin de 20.57 min (*), y B) su
65
Abundance
TIC: NT19b.D
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20.57
20000
20.44 20.46 20.48 20.50 20.52 20.54 20.56 20.58 20.60 20.62 20.64 20.66
Time-->
Abundance
Scan 3055 (20.569 min): NT19b.D
142
7000
6500
6000
5500
5000
4500
4000
3500
3000
73
2500
2000
205
1500
220
1000
45
500
32
191
59
84
100
117
161
177
0
30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220
m/z-->
Figura 28. A) Cromatograma tpico de GC/MS de un extracto metanlico

derivatizado de hojas de Nicotiana tabacum, identificando a la nornicotina con un
tiempo de retencin de 20.57 min (*), y B) su correspondiente espectro de
masas.
66
6.2. Cuantificacin de nicotina en plantas jvenes y/o adultas
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 29. En plantas WT

adultas (Fig. 29 B), se detect un aumento altamente significativo en los niveles
de nicotina en la hoja daada (de 2.2 a 5.9 g/mg peso freso [PF]), hojas distales
intactas (superior: de 1.4 a 5.2 g/mg peso freso [PF]; inferior: de 2.0 a 2.7
g/mg peso freso [PF]) y raz (de 0.96 a 1.22 g/mg peso freso [PF]). Aunque
todas las diferencias se produjeron con un nivel de significancia p <0.01, stas
fueron ms marcadas en la hoja daada y en la hoja distal joven. La induccin
en la hoja distal vieja est de acuerdo con la generacin de seales
bidireccionales que podran ser de diferente naturaleza qumica, en coincidencia
con los resultados reportados por Schittko y Baldwin (2003).
En plantas de la cruza transgnicas WT Nt-LeSYS 03, se observ un
patrn de induccin casi idntico al de plantas WT, excepto por la falta de una
induccin local significativa, quizs como consecuencia de los niveles basales
ms altos que los observados en plantas WT. La acumulacin de nicotina
inducida por dao en races de esta lnea de plantas fue la ms alta detectada
(de 0.88 a 2.12 g/mg PF).
En plantas de las lneas Nt-LeSYS 03 y Nt-LePS 08, los niveles basales
tambin resultaron ms altos que en plantas WT. Adems, se observ una
acumulacin de nicotina inducida por dao ms intensa, en particular en la hoja
daada (respuesta local: de 3.3 y 3.7 a 7.3 y 7.2 g/mg PF, respectivamente) y
la hoja distal joven (respuesta sistmica en direccin hacia el pice: de 4.62 y
4.69 a 9 y 8.23 g/mg PF, respectivamente). No se observ induccin sistmica
de nicotina en respuesta al dao en la hoja distal inferior (en direccin hacia la
base) de plantas Nt-LeSYS 03. En estas plantas se observaron los niveles de
nicotina ms bajos en raz, tanto basales como inducidos por dao (0.6 y 0.85
g/mg PF, respectivamente).
En resumen, los resultados obtenidos en plantas adultas daadas indican
que: i) los niveles basales de nicotina en plantas adultas intactas fueron ms
altos en plantas transformadas que en plantas WT, excepto en la raz de plantas
67
Nt-SYS 03, y ii) la induccin local y sistmica (en hojas distales apicales) de
nicotina por dao mecnico fue ms intensa en las lneas Nt-LePS 08 y NtLeSYS 03.
Los niveles basales de nicotina en hoja y raz de plantas WT jvenes
resultaron similares a los detectados en plantas adultas (2.2 y 0.9 g/mg PF,
respectivamente) (Fig. 29 A). Sin embargo, el dao mecnico en plantas jvenes
no indujo una acumulacin local de nicotina, mientras que en hojas distales se
detect una reduccin significativa en los niveles de nicotina (de 3 a 2.1 g/mg
PF).
En general, el efecto causado por dao mecnico en plantas transgnicas
jvenes fue similar (neutro o negativo) al observado en plantas WT. Slo se
detectaron niveles superiores a los de las plantas intactas en la respuesta local
en la lnea Nt-LeSYS 03 y en la respuesta sistmica en plantas WT Nt-LeSYS
03. En contraste, los niveles de nicotina, locales y sistmicos (en hoja y raz),
detectados en las plantas Nt-LePS 08 fueron significativamente inferiores a los
detectados en plantas intactas (1.12 vs 1.21, 1.0 vs 1.6 y 0.73 vs 0.54 g/mg PF
en hoja daada, hoja distal y raz de plantas daadas e intactas,
respectivamente).
En plantas WT, el aumento en los niveles de nicotina causado por

herbivora en la hoja daada fue similar al observado en plantas daadas
mecnicamente, mientras que en la raz, la acumulacin de nicotina fue
aproximadamente 5 veces mayor a la inducida por dao mecnico (1.2 vs. 6.2
g/mg PF). A su vez, no se detectaron diferencias en la acumulacin sistmica
de nicotina entre ambos tratamientos (Fig. 30).
En todas las plantas transgnicas daadas por larvas de M. sexta se
observ una marcada reduccin en la acumulacin de nicotina en todos los
tejidos analizados, con respecto a niveles basales detectados en plantas
transformadas no daadas de la misma edad, particularmente en raz. Este
efecto fue mucho ms evidente en las lneas Nt-LePS 08 (Fig. 30 B), y en WT
68
PLANTA JVEN
0
HL
HS
ug Nicotina/mg PF
5 da
**
0
HL
HS
RAZ
0h
Nt-LePS 08
2
ug Nicotina/mg PF
0h
WT X Nt-LeSYS 03
2
ug Nicotina/mg PF
RAZ
5 da
**
**
**
HL
HS
0h
Nt-LeSYS 03
4
3
RAZ
5 da
2
1
0
HL
HS
RAZ
ug Nicotina/mg PF
0h
WT
5 da
**
**
**
0
HL
D
8
ug Nicotina/mg PF
HDV
HDJ
RAZ
0h
WT X Nt-LeSYS 03
5 da
**
**
**
2
0
HL
F
ug Nicotina/mg PF
5 da
0h
WT
HDV
HDJ
RAZ
0h
Nt-LePS 08
10
8
6
4
2
0
**
*
HL
10
8
6
4
2
0
5 da
**
**
H
ug Nicotina/mg PF
ug Nicotina/mg PF
PLANTA ADULTA
**
HDV
HDJ
RAZ
0h
Nt-LeSYS 03
**
5 da
**
HL
HDV
HDJ
RAZ
Figura 29. Niveles de nicotina en plantas (jvenes y adultas) WT y transgnicas

intactas (0 h) y cinco das despus de haber sido sometidas a dao mecnico (5
da). En hoja local (HL), hoja sistmica (HS), hoja distal vieja (HDV), hoja distal
jven (HDJ) y raz. Los asteriscos indican la diferencia estadsticamente
significativa (P 0.05*; P 0.01 **).
69
Nt-LeSYS 03 (Fig. 30 A) que en la lnea Nt-LeSYS 03 (Fig. 30 C). Esto se reflej

en la deteccin de contenidos de nicotina en las plantas transgnicas daadas
por M. sexta que fueron marginal o significativamente inferiores a los observados
en plantas WT igualmente tratadas.
Los resultados indicaron que la sobreexpresin de LePS y LeSYS en N.
tabacum, caus una represin generalizada de la acumulacin de nicotina en
respuesta a herbivora por M. sexta. Este efecto se observ en todos los tejidos
analizados, particularmente en raz, y en menor proporcin en las hojas daada
y distal superior. Mientras tanto, la acumulacin de nicotina inducida por
herbivora en plantas WT se detect nicamente en las hojas daadas y la raz.
En raz, la induccin fue sumamente fuerte: 6.5 los niveles detectados en raz
de plantas intactas, y 5.1 los niveles detectados en raz de plantas daadas
mecnicamente.
6.2.3. Tratamiento: infestacin por mosquita blanca (plantas

adultas)
Los resultados obtenidos al analizar las plantas en estudio al trmino del

ciclo de vida de B. tabaci (28 das), en los cuales se compararon los niveles de
nicotina acumulados en plantas WT con cada una de las lneas transgnicas, se
muestran en la Figura 31 (A-C). Los niveles de nicotina detectados en la hoja
infestada y en la raz de las plantas WT resultaron menores a los niveles basales
de nicotina en plantas intactas de edad similar, especialmente en raz, donde se
observ una reduccin a niveles no detectables. A su vez, se observ un ligero
incremento de nicotina (1.5) en la hoja distal superior.
En forma similar a lo observado en los ensayos con M. sexta, la
infestacin con B. tabaci en las tres lneas de plantas transgnicas redujo
marcadamente los niveles de nicotina en relacin a plantas transgnicas intactas
de la misma edad. Este efecto se reflej ms claramente en la hoja infestada y la
raz. En dos lneas (WT Nt-LeSYS 03 y Nt-LePS 08), ver Figs. 31 A y B, la
nicotina en raz se redujo a niveles no detectables, mientras que sta se
mantuvo sin cambio en la lnea Nt-LeSYS 03 (Fig. 31 C).
70
ug Nicotina/mg PF
WT
WT X Nt-LeSYS 03
8
6
4
**
**
ug Nicotina/ mg PF
**
0
HL
HDV
HDJ
RAZ
WT
Nt-LePS 08
6
4
2
**
**
**
0
HL
HDV
HDJ
WT
8
ug Nicotina/mg PF
RAZ
Nt-LeSYS 03
**
**
0
HL
HDV
HDJ
RAZ

transgnicas adultas, 5 das despus de haber sido expuestas a herbivora por
larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja local (HL), hoja distal vieja (HDV), hoja
distal jven (HDJ) y raz. Los asteriscos indican la diferencia estadsticamente
71
Al comparar los niveles de nicotina presentes en plantas infestadas WT y

transgnicas, se observ un incremento significativo en la respuesta local y
sistmica en follaje de plantas Nt-LePS 08 (Fig. 31 B). En las plantas Nt-LeSYS
03 (Fig. 31 C), la acumulacin sistmica de nicotina fue significativamente
superior a la observada en plantas WT, particularmente en raz, mientras que el
efecto represor de la infestacin por MB fue muy fuerte en plantas WT NtLeSYS 03 (Fig. 31 A), cuyos niveles de nicotina en hoja infestada y hoja distal
superior fueron significativamente inferiores a los detectados en plantas WT
infestadas.
Los resultados obtenidos indica que la infestacin por B. tabaci no tuvo un
efecto evidente sobre la induccin de la acumulacin de nicotina en hojas de
plantas WT (1.5 los niveles basales detectados en plantas intactas de la
misma edad), pero redujo drsticamente la acumulacin de nicotina en raz (a
niveles no detectables). Curiosamente, la ausencia de nicotina en la raz de
plantas infestadas no se observ en la lnea Nt-LeSYS 03 (Fig. 31 A), mientras
que los niveles de nicotina en las hojas de las plantas transgnicas infestadas
Nt-LePS 08 (respuesta local y sistmica; Fig. 30 B) y Nt-LeSYS 03 (slo
respuesta sistmica; Fig. 31 C), fueron significativamente superiores a los
detectados en plantas WT, pero menores a los niveles basales detectados en las
plantas transgnicas intactas de la misma edad. Finalmente, en las plantas WT
Nt-LeSYS 03 infestadas se observ una represin de la acumulacin de nicotina
en hojas, la cual fue significativamente menor a la observada en plantas WT.
6.3. Cuantificacin de cido clorognico en plantas jvenes y/o adultas
Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 32 A (plantas

jvenes) y 32 B (plantas adultas). En general, el contenido de cido clorognico
(ACG) detectado tanto en hoja como en raz fue ms alto que el reportado en la
literatura, inclusive al ser comparado con los niveles detectados en plantas de N.
tabacum capaces de altas tasas de sntesis de fenilpropanoides causada po
72
A
WT
ug Nicotina/mg PF
WT X Nt-LeSYS 03
**
**
0
HL
HS
RAZ
B
WT
ug Nicotina/mg PF
**
Nt-LePS 08
**
2
0
HL
ug Nicotina/mg PF
HS
RAZ
WT
**
Nt-LeSYS 03
**
**
0
HL
HS
RAZ

transgnicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia tabaci (28
das despus de la oviposicin). En hoja local (HL), hoja sistmica (HS) y raz.
Los asteriscos indican la diferencia estadsticamente significativa (P 0.05*; P
0.01 **).
73
redireccionamiento de la ruta biosinttica de los fenilpropanoides debido a la

sobreexpresin de FAL (Howles et al., 1996), de una enoil-CoA hidratasa
bacteriana (Mayer et al., 2001) o del gen C58-6b de Agrobacterium tumefaciens
(Glis et al., 2002). En estos casos, los niveles mximos reportados fueron de
0.3 a 5 g/mg PF. Esta discrepancia posiblemente refleje diferencias entre
variedades de N. tabacum, en forma similar a lo que se ha reportado entre
especies de Nicotiana. Por ejemplo, en la especie silvestre N. attenuata los
niveles de ACG son extremadamente bajos, de aproximadamente 27 g/g PF
(Keinnen et al., 2001). Las diferencias observadas tambin podran haberse
debido al empleo de GC/MS, en lugar de otras tcnicas como HPLC/MS, para su
aislamiento y cuantificacin.
En plantas WT adultas (Fig. 32 B), los niveles basales promedio de cido
clorognico (ACG) detectados fueron los siguientes: 9.01 g/mg PF (hoja de
transicin entre tejido consumidor-tejido fuente [C-F], u hoja local), y 4.3 y 4.1
g/mg PF en las hojas distales vieja y joven, respectivamente. En raz, los
niveles de ACG fueron ms bajos (1.7 g/mg PF). El dao mecnico indujo un
incremento significativo en los niveles de ACG tanto local como sistmico y en
todos los tejidos analizados: es decir, se detect una acumulacin de ACG que
fue 1.5, 1.2, 1.3 y 1.18 veces ms alta que en plantas intactas en la hoja daada,
en hojas distales inferior y superior y en raz, respectivamente.
En la lnea WT Nt-LeSYS 03 los niveles basales de ACG en todos los
tejidos analizados, excepto la hoja de transicin tejido consumidor-tejido fuente
(C-F), fueron superiores a los detectados en las plantas WT (entre 1.95 [raz] y
3.8 [hoja distal inferior] veces ms altos). Sin embargo, el dao mecnico caus
una disminucin significativa en los niveles de ACG en todos los tejidos
analizados de estas plantas (entre 2.4 [respuesta sistmica en raz] y 5.3
[respuesta sistmica en hoja distal superior] veces ms bajos).
Al comparar los niveles basales de ACG en plantas WT y Nt-LePS 8, se
observ una drstica reduccin (27 menores), a valores casi indetectables, en
la hoja de transicin C-F (hoja local) de sta ltima, mientras que en las hojas
distales inferior y superior, y en raz, los niveles basales de ACG fueron
superiores a los de las plantas WT (1.5 [hoja distal inferior], 4.1 [hoja distal
superior] y 1.3 [raz] veces ms altos). Curiosamente el dao mecnico caus
74
un incremento significativo en ACG solamente en los tejidos areos ms viejos

de plantas de esta lnea (hoja C-F o local [25] y hoja distal inferior [1.6]); en
raz y en la hoja distal superior se observ una disminucin significativa, la cual
fue mucho ms marcada en ste ltimo tejido (13). En plantas WT Nt-LeSYS
03 se detect una disminucin altamente significativa de ACG en todos los
tejidos de las plantas daadas.
En la lnea Nt-LeSYS 03 se observ una disminucin generalizada en los
niveles basales de ACG, los cuales fueron entre 2.5 (raz) y 6.2 (hoja C-F) ms
bajos que los detectados en plantas WT intactas. Al igual que la lnea WT NtLeSYS 03, el dao mecnico provoc una disminucin altamente significativa en
los niveles de ACG en tejido areo, particularmente la hoja distal inferior
(respuesta sistmica basal) donde el ACG disminuy a valores no detectables.
En cambio, esta lnea fue la nica en la cual se detect una acumulacin
significativa de ACG en races de plantas daadas.
Los niveles basales de ACG en plantas WT jvenes fueron menores a los
detectados en las plantas adultas, particularmente en la hoja inferior, u hoja
local (0.56 g/mg PF) (Fig. 32 A). Los niveles de este metabolito fueron 16
(hoja inferior), 3.3 (hoja superior) y 4.5 veces ms bajos que los detectados en la
hojas C-F y distal inferior, y races de plantas adultas, respectivamente. Un
comportamiento similar se observ en las tres lneas de plantas transgnicas. A
su vez, el dao mecnico en plantas WT slo produjo una acumulacin sistmica
significativa de ACG en las hojas inferiores adyacentes intactas y en la raz.
Los niveles basales de ACG en hojas de las tres lneas de plantas
transgnicas analizadas fueron menores a los detectados en las plantas WT,
particularmente en las hojas de la lnea Nt-LeSYS 03, donde no se detect este
metabolito en las hojas inferiores. En hojas jvenes adyacentes superiores los
niveles se redujeron, entre 3.0 y 3.6 veces, con respecto a hojas similares en
plantas WT. La respuesta sistmica al dao mecnico en la lnea WT NtLeSYS 03 fue similar a la observada en plantas WT, mientras que en las races
de plantas daadas se observ una desaparicin de ACG. La ausencia de ACG
en races de plantas daadas tambin se observ en la lnea Nt-LePS 08.
Asimismo, el dao mecnico caus una reduccin significativa de ACG a nivel
local (Nt-LePS 08) y sistmico (Nt-LeSYS 03). Result interesante observar la
75
completa falta de respuesta local al dao mecnico en esta ltima lnea, lo cual
contrast con la acumulacin de ACG en raz, cuyos niveles fueron los ms
elevados de todas las plantas en estudio.
En sntesis, los niveles de ACG en tabaco estn al parecer regulados por
el estado de desarrollo de la planta, ya que se incrementaron notablemente en
plantas WT adultas. El estado de desarrollo de la planta tambin ejerci una
influencia sobre la acumulacin de ACG en follaje en respuesta al dao
mecnico en plantas WT, ya que sta fue detectada tanto en forma local como
sistmica en plantas adultas, mientras que en plantas jvenes solo se observ
en forma sistmica, incluyendo la raz. Excepto en casos aislados, se observ
una disminucin generalizada en los niveles de ACG basales e inducidos por
dao en las plantas transformadas, la cual tambin se vio fuertemente influida
por el estado de desarrollo de la planta. El ejemplo ms claro de esta tendencia
se observ en la lnea WT Nt-LeSYS 03, que en hojas de plantas jvenes se
comport en forma similar a las plantas WT, detectndose un incremento
significativo de ACG en respuesta al dao en tejido sistmico, mientras que en
plantas adultas el dao caus una disminucin significativa en los niveles de
ACG en todos los tejidos analizados. Asimismo, los niveles de ACG, tanto
basales como inducidos por dao, se redujeron drsticamente tanto en plantas
jvenes (lneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03) como adultas (lnea Nt-LeSYS 03).
Esta ltima lnea se distingui por la alta acumulacin constitutiva de ACG en
raz, cuyos niveles se incrementaron an ms en plantas adultas daadas
mecnicamente. Esta caracterstica contrast con lo observado en las races de
plantas jvenes y adultas de las dos lneas restantes, en las cuales el dao
mecnico redujo el contenido de ACG en forma altamente significativa,
especialmente en plantas jvenes, donde no pudo ser detectado.
76
PLANTA JVEN
1
0
ug Clorognico/mg PF
0.6
HS
RAZ
5 da
0.4
0.2
0.0
HL
HS
RAZ
0h
Nt-LePS 08
ug Clorognico/mg PF
0.6
5 da
0.4
0.2
0.0
HL
HS
RAZ
0h
Nt-LeSYS 03
0.6
5 da
0.4
0.2
0.0
HL
HS
10
RAZ
5
HL
20
*
**
0h
WT X Nt-LeSYS 03
5 da
15
ug Clorognico/mg PF
HL
0h
WT
20
ug Clorognico/mg PF
HDV
HDJ
WT X Nt-LeSYS 03
RAZ
0h
5 da
15
10
5
**
**
0
HL
F
ug Clorognico/mg PF
ug Clorognico/mg PF
5 da
ug Clorognico/mg PF
0h
WT
HDV
**
**
RAZ
HDJ
0h
Nt-LePS 08
20
5 da
15
10
**
**
**
HDJ
RAZ
0
HL
HDV
0h
Nt-LeSYS 03
3
ug Clorognico/mg PF
PLANTA ADULTA
5 da
**
**
0
HL
HDV
**
HDJ
RAZ
Figura 32. Niveles de cido clorognico en plantas (jvenes y adultas) WT y

transgnicas intactas (0 h) y cinco das despus de haber sido sometidas a dao
mecnico (5 da). En hoja local (HL), hoja sistmica (HS), hoja distal vieja (HDV),
hoja
distal
jven
(HDJ)
raz.
Los
asteriscos
indican
la diferencia
77
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 33. En plantas WT

sometidas a herbivora con larvas de M. sexta solo se detect ACG en las hojas
daadas. Adems, los niveles detectados en stas disminuyeron drsticamente
con respecto a lo observado en hojas similares en plantas intactas (21
menores) y daadas mecnicamente (31 menores).
El efecto negativo sobre los niveles de ACG causado por la folivora de
larvas de M. sexta en plantas WT se agudiz en las tres lneas de plantas
transgnicas analizadas, ya que en todos casos, el ACG disminuy a niveles no
detectables en todos los tejidos analizados.
En resumen, la folivora por M. sexta provoc una disminucin muy
marcada en los niveles de ACG en plantas WT y una supresin de su sntesis y
acumulacin en las plantas transformadas, donde este metabolito se redujo
hasta niveles no detectables.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 34. En plantas WT se

observ una disminucin en los niveles de ACG, con respecto a los niveles
basales en plantas no infestadas de la misma edad, en las hojas infestada con B.
tabaci (1.8 menores) y en races (2.1 menores); mientras que en la hoja distal
superior (respuesta sistmica, direccin acropetal), los niveles de ACG fueron
ligeramente superiores (1.9 ms altos).
Los niveles de ACG detectados en tejidos de plantas infestadas de la
lnea Nt-LePS 08 no resultaron estadsticamente diferentes a los detectados en
plantas WT, mientras que en la lnea Nt-LeSYS 03, el contenido de ACG en
follaje se redujo hasta niveles no detectables, mientras que en raz la cantidad
detectada fue significativamente menor a la detectada en races de plantas WT
infestadas. A su vez, el nivel de ACG en races de plantas Nt-LeSYS 03
infestadas fue 1.7 menor a la detectada en plantas transgnicas de la misma
edad no infestadas.
78
ug clorognico/mg PF
WT
1.0
WT X Nt-LeSYS 03
0.5
0.0
**
HL
HDV
HDJ
WT
ug clorognico/mg PF
B 1.0
Nt-LePS 08
0.5
0.0
**
HL
HDV
HDJ
RAZ
WT
C
1.0
ug clorognico/mg PF
RAZ
Nt-LeSYS 03
0.5
0.0
**
HL
HDV
HDJ
RAZ
Figura 33. Comparacin entre los niveles de cido clorognico en plantas WT y

transgnicas adultas, 5 das despus de haber sido expuestas a herbivora por
larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja local (HL), hoja distal vieja (HDV), hoja
79
La misma tendencia se observ en la lnea WT Nt-LeSYS 03. Sin embargo, la

disminucin con respecto a plantas WT infestadas, aunque significativa, no fue
tan drstica, al menos en follaje. La infestacin con B. tabaci caus tambin una
disminucin considerable en ACG en todos los tejidos analizados de plantas WT
Nt-LeSYS 03 con respecto a los niveles basales de ACG en tejidos
equivalentes de plantas de esta lnea no infestadas de la misma edad.
Los resultados obtenidos indican que la infestacin con B. tabaci en
plantas WT indujo un incremento sistmico (en hoja) y una disminucin local y
sistmica (en raz) en los niveles de ACG en relacin a los niveles detectados en
tejidos de plantas WT no infestadas. En forma similar a los resultados obtenidos
de plantas daadas por M. sexta (Fig. 33), la infestacin con B. tabaci caus una
disminucin generalizada en los niveles de ACG en plantas WT y transgnicas.
Sin embargo, el efecto fue mucho ms marcado en plantas transformadas con
LeSYS (lneas Nt-LeSYS 03 y WT Nt-LeSYS 03).
6.4. Cuantificacin de dihidrocapsenona en plantas jvenes y/o adultas
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 35. Los datos que aqu
se presentan representan una cuantificacin indirecta de los niveles de capsidiol,
ya que debido a la conocida inestabilidad de este metabolito in planta, aunada a
los largos perodos de muestreo (28 d) solo pudo detectarse un producto de
degradacin de este metabolito (ver Figs. 11 y 24-26), cuya identidad no pudo
ser determinada, pero cuyo espectro de masas result semejante al del cis-9,10dihidrocapsenona, un posible catabolito estable de capsidiol detectado en
cultivos celulares en suspensin de C. annuum (Ward et al., 1977; Whitehead et
al., 1987). Se considero, por lo tanto, que la dihidrocapsenona indica los niveles
de su precursor el capsidiol). Los niveles detectados en las plantas en estudio
resultaron de 3 a 4 rdenes de magnitud ms altos a los reportados en la
literatura en tejido de N. tabacum inducido por patgenos o PMAP.
80
ug clorognico/mg PF
WT
15
WT X Nt-LeSYS 03
10
0
HL
ug clorognico/mg PF
ug clorognico/mg PF
**
HS
RAZ
WT
Nt-LePS 08
15
10
5
0
HL
HS
RAZ
WT
15
Nt-LeSYS 03
10
5
0
**
HL
**
HS
*
RAZ
Figura 34. Comparacin entre los niveles de cido clorognico en plantas WT y

transgnicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia tabaci (28
das despus de la oviposicin). En hoja local (HL), hoja sistmica (HS) y raz.
0.01 **).
81
En plantas WT, los niveles basales de dihidrocapsenona
en plantas
jvenes fueron entre 6.5 (en raz) y 7.5 (en la hoja distal superior) veces mayores
a los detectados en tejidos equivalentes de plantas adultas, en las cuales no se
detect dihidrocapsenona l en las hojas C-F. Adems, el dao mecnico abati
los niveles de dihidrocapsenona en todos los tejidos analizados de plantas
jvenes (la disminucin fue altamente significativa a nivel local y sistmico en la
hoja daada y en raz, respectivamente, y marginal a nivel sistmico en la hoja
adyacente superior), mientras que lo contrario se observ en plantas adultas, en
las cuales el dao indujo una acumulacin altamente significativa de
dihidrocapsenona en todos los tejidos (aunque sin alcanzar los niveles
detectados en las plantas jvenes). Esto sugiere que la sntesis constitutiva e
inducida de capsidiol esta regulada por el estado de desarrollo de la planta.
El efecto del dao mecnico tambin se modific en las tres lneas de
plantas transgnicas analizadas el cual fue, asimismo, influido por el estado de
desarrollo. De manera que en plantas jvenes, el dao mecnico en plantas NtLePS 08 y WT Nt-LeSYS 03 indujo una acumulacin de dihidrocapsenona en
todos los tejidos analizados (excepto en la respuesta local en la lnea Nt-LePS
08), aunque los niveles basales en estas dos lneas de plantas fueron, en
promedio, aproximadamente 6 veces menores a los detectados en las plantas
WT. Sin embargo, los niveles de detectado dihidrocapsenona en plantas WT y
transgnicas (de estas dos lneas) daadas mecnicamente fueron muy
similares. En plantas Nt-LeSYS 03, el efecto del dao fue mucho ms notable,
particularmente en follaje, ya que al parecer indujo la sntesis de novo de este
metabolito, el cual no se detect en plantas intactas, mientras que en raz no se
detectaron
cambios
significativos.
pesar
de
ello,
los
niveles
de
dihidrocapsenona en plantas Nt-LeSYS 03 daadas fueron, en general, menores

a los detectados en el resto de las plantas daadas analizadas.
Al igual que en plantas WT, el dao mecnico en plantas adultas de las
lneas plantas Nt-LePS 08 y WT Nt-LeSYS 03 indujo una acumulacin
generalizada y altamente significativa de dihidrocapsenona. La diferencia radic
en el hecho de que los niveles de este metabolito acumulados en las plantas
transgnicas daadas fueron muy elevados, entre 9 (respuesta sistmica en hoja
distal superior en las lnea WT Nt-LeSYS 03) y 80 (hoja daada de ambas
82
lneas) veces ms altos a los detectados en plantas WT daadas. En plantas NtLeSYS 03 adultas, que a diferencia de las plantas jvenes tenan niveles basales
detectables de dihidrocapsenona en follaje, pero que en raz fueron 1.8 veces
menores a los detectados en plantas jvenes, slo se observ un incremento
significativo en los niveles de dihidrocapsenona a nivel sistmico en la hoja distal
superior. En la hoja distal inferior el efecto del dao fue inhibitorio, mientras que
no se observaron cambios significativos en la hoja daada ni en la raz. En
plantas adultas de esta lnea, la acumulacin sistmica de dihidrocapsenona
inducida por dao no fue de la magnitud observada en las dos lneas restantes,
sino similar a la observada en plantas WT.
Los resultados se muestran en la Figura 36. En plantas WT adultas

sometidas a herbivora por M. sexta, se observ un incremento con respecto a
los niveles basales de dihidrocapsenona, el cual fue ms marcado en la hoja
daada y en la raz (8.3 ms alta). El incremento en dihidrocapsenona en
ambas hojas distales fue menor, particularmente en la hoja superior. Los niveles
de dihidrocapsenona detectados en plantas adultas sometidas a herbivora
tambin fueron superiores a los detectados en plantas adultas daadas
mecnicamente.
En la lnea Nt-LePS 08, la herbivora caus una marcada reduccin en los
niveles de dihidrocapsenona, hasta valores no detectables en ambas hojas
distales (respuesta sistmica acropetala y basipetala), mientras que en la hoja
daada C-F (respuesta local), la dihidrocapsenona aument hasta niveles
detectables, en contraste con la ausencia de este metabolito en hojas C-F de
plantas intactas. A su vez, el contenido de dihidrocapsenona en races de
plantas de esta lnea daadas por M. sexta se redujo a niveles no detectables, lo
que contrast con la acumulacin significativa de dihidrocapsenona detectada en
races de plantas daadas mecnicamente.
83
PLANTA JVEN
PLANTA ADULTA
0 da
WT
1.5
5 da
0.4
1.0
**
**
**
0.3
P=0.06 5
0.5
0 da
WT
0.5
5 da
**
**
0.2
**
0.1
0.0
0.0
HL
1.5
HS
RAZ
0 da
WT X Nt-LeSYS 03
HL
15
5 da
**
1.0
HS
RAZ
0 da
Nt-LePS 08
**
**
15
5 da
HDV
HDJ
**
RAZ
0 da
Nt-LePS 08
5 da
**
**
10
**
**
**
0.5
**
0.0
HL
HS
HL
RAZ
0 da
Nt-LeSYS 03
5 da
1.0
0.5
5 da
HL
1.0
1.5
**
0
HL
RAZ
0 da
0.0
1.5
HDJ
WT X Nt-LeSYS 03
10
**
0.5
HDV
HDV
5 da
**
0.1
**
**
0.0
0.0
HL
RAZ
0 da
Nt-LeSYS 03
0.3
0.2
**
HDJ
HS
RAZ
HL
HDV
HDJ
RAZ
Figura 35. Niveles de capsidiol, cuantificado directamente en su posible

producto de degradacin (dihidrocapsenona), en plantas jvenes y adultas, WT y
transgnicas intactas 0 da y cinco das despus de haber sido sometidas a dao
mecnico. En hoja local (HL), hoja sistmica (HS), hoja distal vieja (HDV), hoja
84
En la lnea WT Nt-LeSYS 03 se observ un patrn similar aunque

menos marcado, particularmente en la respuesta local a la herbivora, que no fue
diferente a la detectada en plantas intactas de la misma edad. En races de esta
planta, los niveles de dihidrocapsenona en plantas daadas por M. sexta fueron
3.7 ms altos a los basales.
Los niveles de dihidrocapsenona detectados en plantas Nt-LePS 08 y WT
Nt-LeSYS 03 daadas por M. sexta fueron considerablemente inferiores a los
detectados en plantas WT daadas. Asimismo, en ambas lneas se observ un
contraste muy marcado entre los niveles de dihidrocapsenona acumulados en
plantas daadas mecnicamente (acumulacin hasta niveles excepcionalmente
altos) o por larvas de M. sexta (disminucin en los niveles o represin de su
sntesis).
Una vez ms, la lnea Nt-LeSYS 03 se comport en forma diferente a las
otras dos. En todos los tejidos analizados, los niveles de dihidrocapsenona se
incrementaron en respuesta a herbivora, con respecto a los niveles basales
detectados en plantas Nt-LeSYS 03 intactas de la misma edad. El efecto ms
marcado fue en la hoja daada y en la hoja distal inferior (niveles 5.3 ms altos
en ambos casos). Los niveles detectados en plantas sometidas a folivora por M.
sexta tambin fueron ms altos a los detectados en plantas daadas
mecnicamente. La acumulacin de dihidrocapsenona en follaje en respuesta a
herbivora en estas plantas fue marginal o significativamente (respuesta
sistmica en hoja distal inferior) ms alta a la detectada en plantas WT. Sin
embargo, al igual que en las lneas Nt-LePS 08 y WT Nt-LeSYS 03, los niveles
de dihidrocapsenona en la races de plantas daadas por M. sexta fueron
significativamente inferiores a los detectados en plantas WT similarmente
tratadas.
85
WT
WT X Nt-LeSYS 03
ug capsidiol/ mg peso fresco.
2.0
1.5
1.0
**
0.5
*
**
0.0
HL
HDV
HDJ
RAZ
B 2.0
WT
Nt-LePS 08
1.5
1.0
0.5
*
**
0.0
HL
Figura
36.
indirectamente
RAZ
WT
Nt-LeSYS 03
P= 0.07
**
1.0
0.5
P = 0.22
**
0.0
HL
Comparacin
en
HDJ
2.0
1.5
**
**
HDV
forma
HDV
entre
de
HDJ
los
un
niveles
posible
RAZ
de
capsidiol,
producto
de
cuantificado
degradacin
(dihidrocapsenona) en plantas WT y transgnicas adultas, 5 das despus de

haber sido expuestas a herbivora por larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja
local (HL), hoja distal vieja (HDV), hoja distal jven (HDJ) y raz. Los asteriscos
86
Los resultados obtenidos de este tratamiento se muestran en la Figura 37.

La infestacin por B. tabaci caus un marcado e inusual incremento en los
niveles de dihidrocapsenona en todos los tejidos analizados de plantas WT,
particularmente en la hoja infestada. Los altos niveles detectados apoyan la
proposicin de que el dihidrocapsenona inducido por la infestacin por B. tabaci
se acumul gradualmente en forma de su catabolito ms estable durante los
relativamente largos tiempos de muestreo empleados en este experimento (28
das). La acumulacin sistmica de dihidrocapsenona tambin fue elevada (11 y
13 mayor en la raz y la hoja distal superior, respectivamente, a la detectada en
plantas WT intactas de la misma edad). Comparando todas las plantas en
estudio, fue evidente que la infestacin por B. tabaci indujo la mayor
acumulacin de dihidrocapsenona en plantas WT.
Excepto por la cada en los niveles de dihidrocapsenona en las races de
plantas WT Nt-LeSYS 03 infestadas, el patrn de acumulacin de
dihidrocapsenona en respuesta a MB en las Nt-LePS 08 y WT Nt-LeSYS 03
fue similar, aunque de menor magnitud, al observado en las plantas WT. En la
lnea Nt-LeSYS 03 la respuesta sistmica en hoja y raz tambin fue superior o
similar a la de las dems plantas, mientras que dihidrocapsenona en la hoja
infestada disminuy hasta niveles no detectables. En la lnea Nt-LePS 08 la
acumulacin local de dihidrocapsenona en plantas infestadas y daadas
mecnicamente fue similar, mientras que la respuesta sistmica, tanto en la hoja
distal superior como en la raz, fue menor en las plantas infestadas.
En las tres lneas de plantas transgnicas la acumulacin local y sistmica
(hoja distal superior y raz) de dihidrocapsenona en respuesta a B. tabaci fue
igual o significativamente menor a la detectada en tejido equivalente de plantas
WT infestadas, excepto por la respuesta sistmica en hoja en plantas Nt-LeSYS
03,
en
la
cual
los
niveles
de
dihidrocapsenona
detectados
fueron
significativamente ms altos que en plantas WT.

En sntesis, los cambios observados en los niveles basales de
dihidrocapsenona mayores en plantas WT jvenes, y su incremento en plantas
adultas, o disminucin (plantas jvenes) en respuesta al dao mecnico indican
87
que los niveles constitutivos o inducidos de este metabolito en planta estn

ontognicamente determinados. La acumulacin de dihidrocapsenona en
respuesta a dao mecnico en plantas adultas y a infestacin por MB se
potenci marcadamente en la lnea Nt-LePS 08 y en menor grado en la lnea WT
Nt-LeSYS 03, particularmente en la hoja daada o infestada. El dao por
insectos chupadores y masticadores indujo una acumulacin local y sistmica de
dihidrocapsenona en plantas WT, la cual fue ms intensa en respuesta a B.
tabaci. En general, la induccin de dihidrocapsenona en respuesta al dao por
insectos se redujo significativamente en las plantas transgnicas.
6.5. Cuantificacin de nornicotina en plantas jvenes y/o adultas
Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 38 A y B. stos

indicaron que la sntesis basal de nornicotina (NN) y la induccin de su
acumulacin en respuesta a dao mecnico en N. tabacum dependen del estado
de desarrollo de la planta, del tipo de tejido analizado y de la filotaxia de la
planta. De manera que no se detect este alcaloide en plantas WT jvenes ni en
la hoja de transicin C-F de plantas adultas intactas. En stas, NN se detect en
las dos hojas distales, superior (0.041 g/mg PF) e inferior (0.031 g/mg PF) en
relacin a la hoja C-F y ms claramente en raz (0.17 g/mg PF). La cantidad de
NN detectada result menor a lo esperado para N. tabacum, donde este
alcaloide alcanz hasta 0.35 g/mg PF, equivalentes al 3% del contenido total de
alcaloides en esta especie (Saitoh et al., 1985). Al igual que en el anlisis de
CGA descrito con anterioridad, esta variacin podra haberse debido a
diferencias genticas y/o analticas.
El dao mecnico en plantas WT adultas indujo una sntesis y
acumulacin significativa de NN en la hoja daada (de niveles no detectables a
0.045 g/mg PF) y en la hoja distal superior (de 0.041 a 0.12 g/mg PF),
mientras que redujo su concentracin a niveles no detectables en la hoja distal
88
WT
ug Capsidiol/mg PF
15
WT X Nt-LeSYS 03
10
**
5
**
**
HL
HS
RAZ
B
ug Capsidiol/mg PF
WT
15
10
HL
HS
ug Capsidiol/mg PF
37.
indirectamente
Nt-LeSYS 03
10
**
**
**
Comparacin
en
RAZ
WT
15
HL
Figura
Nt-LePS 08
**
forma
entre
de
HS
los
un
niveles
posible
RAZ
de
capsidiol,
producto
de
cuantificado
degradacin
(dihidrocapsenona), en plantas WT y transgnicas adultas, medidos al cumplirse

el ciclo de vida de Bemisia tabaci. En hoja local (HL), hoja sistmica (HS) y raz.
0.01 **)
89
inferior. Tambin se observ una disminucin significativa en el contenido de NN

en races de plantas adultas daadas mecnicamente (de 0.17 a 0.04 g/mg PF)
(28 das despus de la oviposicin). Los asteriscos indican la diferencia
La lnea Nt-LeSYS 03 se caracteriz por ser la nica lnea en la cual se
detect NN en forma constitutiva en follaje de plantas jvenes. El dao mecnico
en estas plantas caus una reduccin a niveles no detectables (ND) en la hoja
daada (respuesta local inhibitoria), mientras que en la raz indujo su sntesis de
novo (de ND a 0.05 g/mg PF). En la hoja distal adyacente se detect un
aumento marginal de NN (0.03 a 0.12 g/mg PF). Un comportamiento muy
similar se observ en follaje de plantas adultas de la lnea Nt-LeSYS 03 daadas
mecnicamente, ya que se volvi a presentar una reduccin significativa de NN
en hojas daadas, mientras que el incremento detectado en hojas distales
superiores (7.6 mayor; de 0.09 a 0.69 g/mg PF) fue ahora altamente
significativo. Los niveles de NN sintetizados en races de plantas jvenes NtLeSYS 03 daadas mecnicamente resultaron muy similares a los niveles
constitutivos detectados en las races de plantas adultas, los cuales no variaron
significativamente en respuesta al dao mecnico.
El dao mecnico tuvo un efecto sistmico negativo sobre los niveles de
NN en las dos restantes lneas de plantas adultas transformadas (Nt-LePS 08 y
WT Nt-LeSYS 03), observado en la hoja distal superior y raz. Aunque en
ambas lneas el dao mecnico caus una disminucin de NN a niveles no
detectables, el efecto observado fue particularmente severo en la raz.
No se detect NN en plantas de cualquiera de los genotipos analizados
sometidas a herbivora por M. sexta o infestacin por MB (resultados no
mostrados).
90
PLANTA JOVEN
PLANTA ADULTA
A
ug Nornicotina/mg PF
5 da
0.2
0.1
**
**
0.0
HL
HDV
HDJ
RAZ
WT X Nt-LeSYS 03
0h
5 da
0.3
0.2
0.1
HL
HDV
P=0.072
0.1
0.0
**
**
HL
HS
RAZ
0h
Nt-LePS 08
5 da
0.2
**
RAZ
0.3
5 da
0.2
0.1
**
**
HDJ
RAZ
0.0
HL
0 da
Nt-LeSYS 03
**
HDJ
0.0
0h
WT
0.3
HDV
0h
Nt-LeSYS 03
5 da
1.0
**
0.5
0.0
HL
HDV
HDJ
RAZ
Figura 38. Niveles de nornicotina en plantas (jvenes y adultas) WT y

hoja
distal
jven
(HDJ)
raz.
Los
asteriscos
indican
la diferencia
91
6.6. Cuantificacin de fenoles totales en plantas jvenes y/o adultas
Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 39 A y B. Los niveles

basales de fenoles totales en plantas WT adultas fueron superiores (entre 1.92 y
7.7 ms altos) en las hojas distal inferior y de transicin C-F, pero ms bajos
(entre 1.7 y 1.1 menores) en raz, que los observados en tejidos equivalentes
de plantas de las tres lneas transgnicas en estudio (Fig. 39 B)
Asimismo, los niveles basales de fenoles en la raz de las tres lneas de
plantas transgnicas jvenes fueron menores a los detectados en plantas WT de
la misma edad, particularmente en la lnea WT Nt-LeSYS 03 en la cual no se
detectaron. En follaje se repiti esta tendencia en las lneas Nt-LePS 08 (1.3 y 2
veces menores en las hojas inferiores y superiores, respectivamente) y WT NtLeSYS 03 (2.7 y 3.8 veces menores en hojas inferiores y superiores,
respectivamente), mientras que en la lnea Nt-LeSYS 03, los niveles de fenoles
en follaje no variaron mucho en relacin a los detectados en las plantas WT
(Fig.39 A).
En plantas WT jvenes daadas mecnicamente se observaron efectos
sistmicos contrastantes, ya que se detect un incremento y disminucin
significativos en la hoja distal adyacente superior y raz, respectivamente. En las
plantas transgnicas jvenes, el dao mecnico no indujo un cambio en los
niveles basales de fenoles en follaje (lnea WT Nt-LeSYS 03) o bien provoc
una reduccin significativa de stos (lneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03). En raz,
la disminucin significativa de fenoles totales observada en plantas WT daadas,
se repiti en la lnea Nt-LePS 08, mientras que en las dos restantes se detect
un incremento significativo (Figs. 39 C, G).
En plantas WT adultas daadas mecnicamente, slo se observ un
aumento significativo en fenoles totales a nivel sistmico en la hoja distal inferior.
En contraste con lo observado en las plantas Nt-LePS 08 jvenes, el dao
mecnico aplicado a plantas adultas de esta lnea indujo un incremento
significativo generalizado en fenoles totales, tanto en follaje como en raz. En las
lneas Nt-LeSYS 03 y WT Nt-LeSYS 03, se observ en general lo contrario, ya
92
que los niveles de fenoles totales detectados en la hoja daada (respuesta local),
hojas distales inferiores y superiores y raz (respuesta sistmica) resultaron
marginal o significativamente menores a los observados en plantas intactas
(excepto por el incremento significativo detectado en la hoja distal superior en la
lnea WT Nt-LeSYS 03) (Fig. 39 D).
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 40. La herbivora por

M. sexta caus, en general, una reduccin en los niveles de fenoles totales (en
relacin a los niveles basales detectados en plantas intactas de la misma edad)
en todos los tejidos analizados, tanto de plantas WT como transgnicas (excepto
en la lnea Nt-LePS 08, en cuyas hojas distales superior e inferior,
respectivamente, se observ un ligero aumento). La disminucin fue ms
marcada en la hoja daada, en la hoja distal inferior (es decir en las hojas ms
viejas) y en raz, mientras que en la hoja distal superior los niveles se
mantuvieron iguales o variaron levemente.
El nivel de fenoles detectado en follaje y raz de las plantas transgnicas
daadas por M. sexta result marginal o significativamente inferior al detectado
en plantas WT, excepto en la raz de la lnea Nt-LeSYS 03, cuyos niveles
resultaron significativamente superiores al de las plantas WT.
93
PLANTA JVEN
WT
*
HL
HS
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
**
HS
Raz
0 da
Nt-LePS 08
0.6
0.4
**
**
**
0.2
0
HL
HS
Raz
5 da
1.5
1
0.5
**
**
0
HL
HS
2
0
HL
HDV
Raz
HDJ
Nt-LeSYS 03 X WT
4
3
2
1
0
Raz
0 da
5 da
**
*
*
HL
HDV
HDJ
Raz
0 da
Nt-LePS 08
5 da
**
**
**
**
0
HL
HDV
0 da
Nt-LeSYS 03
**
5 da
0.8
5 da
ug/mg peso fresco
5 da
HL
0 da
Nt-LeSYS 03 X WT
E
ug/mg peso fresco
Raz
ug/mg pesofresco
ug/mg peso fresco
ug/mg peso fresco
5 da
**
0 da
WT
ug/mg peso fresco
5
4
3
2
1
0
0 da
ug/mg peso fresco
ug/mg peso fresco
PLANTA ADULTA
HDJ
0 da
Le-Nt'SYS
Nt-LeSYS
0303
Raz
5 da
2
1
**
**
HDV
HDJ
0
HL
Raz
Figura 39. Fenoles solubles totales en plantas (jvenes y adultas) WT y

hoja
distal
jven
(HDJ)
raz.
Los
asteriscos
indican
la diferencia
94
WT
A
ug/mg peso fresco
1.6
WT X Nt-LeSYS 03
1.2
*
0.8
**
**
0.4
**
0
HL
HDV
HDJ
WT
1.6
ug/mg peso fresco
Raz
Nt-LePS 08
1.2
0.8
**
**
0.4
0
HL
HDV
HDJ
WT
1.6
ug/mg peso fresco
Raz
Nt-LeSYS 03
1.2
**
0.8
0.4
0
HL
HDV
HDJ
Raz
Figura 40. Comparacin entre los niveles de fenoles totales solubles en plantas
WT y transgnicas adultas, 5 das despus de haber sido expuestas a herbivora
por larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja local (HL), hoja distal vieja (HDV),
hoja
distal
jven
(HDJ)
raz.
Los
asteriscos
indican
la diferencia
95
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 41. En plantas WT, la

infestacin por B. tabaci caus una disminucin en los niveles de fenoles en
follaje, particularmente en la hoja infestada donde los niveles fueron 2.9 veces
menores a los detectados en plantas WT no infestadas de la misma edad. En la
raz, los niveles de fenoles fueron similares en plantas WT infestadas y no
infestadas.
En las plantas transgnicas, el comportamiento en respuesta a la
infestacin por B. tabaci fue variable: mientras que en la lnea Nt-LePS 08 se
observ un aumento de fenoles totales tanto local (2 ms alto) como sistmico
(3.3 ms alto), con respecto a plantas no infestadas de la misma edad, en las
dos restantes la respuesta fue inhibitoria, excepto por el ligero incremento
detectado en la hoja distal superior de la lnea WT Nt-LeSYS 03. El efecto
inhibitorio fue ms marcado en la hoja infestada (2.6 menor en ambas lneas).
En raz de las tres lneas transformadas se detect una disminucin en los
niveles de fenoles con respecto a plantas no infestadas de la misma edad.
Los niveles de fenoles en todos los tejidos analizados de plantas
transgnicas infestadas fueron iguales (Nt-LePS 08) o significativamente
menores (Nt-LeSYS 03 y WT Nt-LeSYS 03) a los detectados en plantas WT
infestadas. A su vez, el cambio en los niveles de fenoles totales detectado en
plantas transgnicas y WT en respuesta a herbivora por M. sexta e infestacin
por MB fue similar.
96
WT
ug/mg peso fresco
W T Nt-L e SYS 03
**
**
**
0
HL
HDJ
Ra z
WT
ug/mg peso fresco
N t -L eP S 08
0
HL
ug/mg peso fresco
HDJ
Ra z
WT
N t- L eSYS 03
**
**
**
0
HL
HDJ
Ra z
Figura 41. Comparacin entre los niveles de fenoles solubles totales en plantas
WT y transgnicas adultas, medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia
tabaci (28 das despus de la oviposicin). En hoja local (HL), hoja distal jven
(HDJ) y raz. Los asteriscos indican la diferencia estadsticamente significativa (P
0.05*; P 0.01 **).
97
DISCUSIN DE RESULTADOS
Las plantas del gnero Nicotiana (Solanaceae) son capaces de sintetizar

una gran diversidad de metabolitos secundarios, principalmente alcaloides,
compuestos fenlicos y terpenoides, muchos de los cuales ejercen una influencia
sobre las interacciones biolgicas que estas plantas tienen con su ambiente
circundante.
Este trabajo es parte de un estudio cuyo objetivo fue determinar el efecto
que la sobreexpresin de prosistemina (LsPS) y sistemina (LeSYS) de jitomate
en N. tabacum pudiera tener sobre la capacidad de responder a agobios
(a)biticos. La inquietud de analizar los niveles constitutivos e inducibles de
metabolitos secundarios relacionados con defensa contra herbvoros y/o
patgenos (nicotina, nornicotina, cido clorognico, capsidiol y fenoles solubles
totales) en estas plantas surgi de la posibilidad de que la resistencia diferencial
contra herbivora por larvas de M. sexta, as como las numerosas modificaciones
morfolgicas y fisiolgicas observadas en plantas transformadas con LePS y/o
LeSYS (Rocha-Granados, 2004 y resultados no publicados) podra deberse a
cambios en la sntesis y/o acumulacin de estos metabolitos en follaje y raz. En
apoyo a esta propuesta est el hecho de que la sntesis de novo de muchos de
estos
compuestos,
principalmente
alcaloides,
compuestos
fenlicos
terpenoides, se incrementa dramticamente como respuesta al dao mecnico o

ataque por herbvoros y/o patgenos, y que este cambio es inducido en muchos
casos por cido jasmnico, el cual funciona como una seal mediadora de
cambios en el metabolismo secundario en respuesta a muchos tipos de agobio
bitico y abitico (Gundlach et al., 1992; Hildman et al., 1992; Reinbothe et al.,
1994). Es tambin bien conocido que la induccin de genes de defensa en
respuesta al dao en L. esculentum, parte de la cual es dependiente de
sistemina, ocurre a travs de la intermediacin de AJ (Schilmiller y Howe, 2005).
La nicotina es uno de los metabolitos secundarios de defensa ms
estudiados. Es el alcaloide predominante en variedades comerciales de N.
tabacum, incluyendo la variedad Xanthi utilizada en esta investigacin. La
nicotina constituye en promedio el 94.8% del total de alcaloides (ca. 11.5 mg/g
de peso seco) presentes en follaje de N. tabacum (subgnero Tabacum; seccin
98
Genuinae); el resto est constituido por los alcaloides nornicotina (3.0%),

anabasina (0.3%) y anabatina (1.9%) (Saitoh et al., 1985). Se estima que la
nicotina contribuye a la resistencia contra insectos herbvoros gracias a su
capacidad de interactuar con receptores de acetilcolina del sistema nervioso de
animales (Steppuhn et al., 2004; Liu et al., 2005). Asimismo, se ha encontrado
que el dao al follaje, mecnico o por herbvoros, tanto en N. tabacum como en
las especies silvestres N. attenuata, N. sylvestris y otras, induce la sntesis de
novo de nicotina en races, la cual es posteriormente reubicada en el follaje (va
el xilema) para contribuir a la defensa de la planta y reducir la prdida de rea
foliar por herbivora. El cido jasmnico, que es producido en las hojas daadas
y rpidamente transportado a las races va el floema, es un componente
esencial de la sealizacin entre hoja y raz que facilita esta respuesta (Zhang y
Baldwin, 1997). De acuerdo a Ohnmeiss y Baldwin (2000), la distribucin de la
nicotina proveniente de la raz en el follaje estar determinada por los postulados
de la teora de defensa ptima, que predice que los tejidos ms valiosos para la
planta, o aquellos con una mayor probabilidad de ser atacados, sern los mejor
defendidos. stos son en general los tejidos jvenes, con altas tasas
fotosintticas y/o las estructuras reproductivas; sin embargo, se ha encontrado
que el valor del tejido vara de acuerdo a la ontogenia de la planta y puede estar
influido por su nivel nutricional. El ataque por herbvoros o patgenos tambin
puede alterar la cantidad y la distribucin de metabolitos defensivos.
Como se observa en las Figuras 29 A y B, los niveles basales de nicotina
fueron similares en plantas WT jvenes y adultas. Sin embargo, la acumulacin
significativa de nicotina en respuesta a dao mecnico slo se observ en los
tejidos analizados (predominantemente en la hoja daada y en la hoja distal
joven) de las plantas adultas; en plantas jvenes daadas, se observ, en
contraste, una disminucin generalizada en los niveles de nicotina, la cual fue
significativa a nivel sistmico. De acuerdo a la teora de la defensa ptima,
descrita anteriormente, la diferencia entre plantas jvenes y adultas podra
explicarse en parte, si se considera que el valor que tienen las hojas expandidas
en una planta joven es similar debido a que la diferencias en el estado de
desarrollo son mnimas, tal como se ha observado en plantas de N. sylvestris en
el estadio de roseta (Baldwin et al., 1997). Otros factores que podran haber
contribuido a la dbil respuesta en plantas jvenes, en cuanto a la induccin de
99
la acumulacin de nicotina en respuesta al dao mecnico, son los siguientes: i)

la alta disponibilidad de recursos en plantas jvenes, los cuales al no estar
sindo desviados hacia la generacin de estructuras reproductivas o produccin
de semillas, permiten la utilizacin de estrategias menos costosas desde el punto
de vista metablico que la sntesis de nicotina, como el rebrote de tejidos
despus del dao; ii) las plantas jvenes son incapaces de fijar altas
concentraciones de nicotina; iii) la nicotina no es necesariamente el metabolito
de defensa ms importante en esta etapa de desarrollo; iv) el similar valor que el
tejido foliar tiene en plantas jvenes garantiza una distribucin uniforme de
metabolitos de defensa, y/o v) la incapacidad de exportar suficiente JA a la raz
para inducir la sntesis de nicotina, an a pesar de que los tejidos jvenes y
reproductivos son los que producen los mayores niveles de AJ, tanto
constitutivos como inducibles (Creelman y Mullet, 1997;Ohnmeiss y Baldwin,
2000). Esta ltima posibilidad podra haberse debido al hecho de que las hojas
inmaduras constituyen tejidos consumidores que importan fotosintatos desde las
hojas maduras y viejas, de manera que la exportacin de AJ hacia el floema y
eventualmente hacia la raz, podra estar comprometida en plantas jvenes en
crecimiento activo y sin un aparato fotosinttico eficiente.
En cuanto a las plantas WT adultas daadas, la mxima acumulacin de
nicotina se observ a nivel local y sistmico apical, lo que sugiere que estas
hojas tienen un mayor valor para la planta que la hoja distal basal. De manera
que la acumulacin local de nicotina podra ser parte de una estrategia de
defensa para la defensa de tejidos valiosos (e. g., aquellos con las tasas
fotosintticas ms altas por rea foliar, tal como se ha reportado para hojas
maduras en N. sylvestris) contra insectos, especialmente de aquellos que tienen
poca movilidad. Tambin se ha especulado que la acumulacin de defensas en
tejido daado puede disuadir a los herbivoros a consumir tejido de menor valor e
inclusive, a migrar hacia plantas vecinas competidoras. En todo caso, los
resultados para nicotina obtenidos en este trabajo contrastaron con los
reportados para N. sylvestris, en las cuales se observ que la sensibilidad al
dao mecnico disminua gradualmente a medida que las plantas avanzaban en
su estado de desarrollo (Ohnmeiss et al., 1997; van Dam et al. 2001).
En plantas transgnicas jvenes, exceptuando la lnea Nt-LeSYS 03, los
niveles basales de nicotina fueron menores a los detectados en las plantas WT.
100
El efecto negativo que el dao mecnico tuvo sobre el contenido de

nicotina en plantas WT jvenes se hizo ms marcado en la lnea Nt-LePS 08
(disminucin significativa generalizada), lo cual contrast con la induccin local
(en Nt-LeSYS 03) y sistmica (en WT Nt-LeSYS 03) de niveles
significativamente ms altos de nicotina. En plantas adultas, el patrn de
acumulacin de nicotina como respuesta al dao result muy similar entre
plantas WT y transgnicas, aunque estas ltimas mostraron una respuesta ms
intensa al dao, particularmente la respuesta sistmica en la hoja distal joven en
las lneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03. Estos resultados sugieren que la
expresin de LePS y LeSYS en tabaco alter el patrn de sntesis y distribucin
de nicotina en la planta. Tomando en cuenta que la acumulacin de metabolitos
defensivos en tabaco se produce de acuerdo al valor relativo que los tejidos
tienen para la planta atacada, es vlido sugerir que el comportamiento
observado fue un indicio de que el valor de estas hojas en las plantas
transgnicas se increment. Las razones de este cambio se desconocen, pero
podran
estar
relacionados
con
cambios
fisiolgicos
causados
por
la
sobreexpresin de estos genes en tabaco, los cuales podran haber alterado las
relaciones entre tejidos consumidores y tejidos fuente (debido a la sntesis
constitutiva de protenas y metabolitos de defensa) o bien, podran haber
alterado el desarrollo normal de N. tabacum. Este ltimo argumento podra
aplicarse a la lnea Nt-LeSYS 03, la cual presenta un fenotipo caracterizado por
alteraciones marcadas en su desarrollo, como enanismo, hojas modificadas,
floracin precoz y senescencia acelerada (Rocha-Granados, 2004 y resultados
no publicados; ver Fig. 13). En plantas adultas de todos los genotipos analizados
se observ tambin un incremento significativo de nicotina en raz en respuesta
al dao, lo que fue un indicio de que la sntesis de novo de AJ en las hojas y su
posterior transporte, va floema, a la raz, no se alter en las plantas
transgnicas. Sin embargo, los niveles de nicotina en races de plantas NtLeSYS 03 intactas y daadas, fueron inferiores a los detectados en plantas WT y
dems plantas transgnicas. Es posible que la floracin precoz y la senescencia
acelerada observada en esta lnea hayan causado una reduccin en la sntesis
de nicotina y/o un aumento en el catabolismo de nicotina como parte de una
estrategia para canalizar el nitrgeno hacia la produccin de estructuras/tejidos
101
reproductivos. Esta propuesta se sustenta en cierta medida con lo observado en

plantas de N. attenuata y N. sylvestris, en las cuales se detect una reduccin en
el contenido de nicotina durante las etapas de elongacin (generacin de
estructuras reproductivas) y floracin (Ohnmeiss y Baldwin, 2000; Baldwin,
2001).
La reduccin en los niveles de nicotina, con respecto a plantas intactas,
observados en hojas de plantas WT y transgnicas sometidas a herbivora por
larvas de M. sexta (Figuras 30 A y 30 B) estuvo de acuerdo a varios reportes en
la literatura en los que se ha observado que el dao causado por este insecto
tolerante a la nicotina en especies silvestres de Nicotiana, reprime su sntesis, a
pesar de un marcado aumento en los niveles de AJ, tanto en hoja como en raz
(McCloud y Baldwin, 1997). Este efecto se ha atribuido a una sntesis de novo
sostenida de etileno, que al igual que en otras especies (e.g., Arabidopsis
thaliana, Griffonia simplicifolia), es antagnico al efecto inductivo local y/o
sistmico de AJ (Zhu-Salzman et al., 1998; Rojo et al., 1999; Kahl et al., 2000).
Adems, se ha demostrado que est inhibicin se debe a la supresin por etileno
de dos genes (putrescina-N-metil transferasas 1 y 2) que son esenciales para la
sntesis de nicotina en raz (Winz y Baldwin, 2001). El contraste observado entre
dao mecnico (induccin) y herbivora (represin), coincidi con estudios
previos que han demostrado que la sntesis de etileno, responsable a su vez de
la represin de la sntesis de nicotina, se produce exclusivamente en respuesta a
un grupo de amidas, sintetizadas a partir de la conjugacin de cidos grasos con
aminocidos, presentes en las secreciones orales de M. sexta (Halitschke et al.,
2001; Schittko et al., 2001). Adems de su efecto sobre la sntesis de nicotina, la
herbivora por M. sexta tambin causa una reorganizacin transcripcional en
plantas de tabaco diferente a la observada en respuesta a dao mecnico, la
cual se caracteriza por la expresin diferencial de ms de 500 genes
involucrados en fotosntesis, transporte de electrones, sntesis y funcionamiento
del citoesqueleto, metabolismo de carbono y nitrgeno, y respuesta al dao o
invasin por patgenos (Hermsmeier et al., 2001).
La represin de la acumulacin de nicotina en hojas atacadas por M.
sexta fue, sin embargo, mucho ms marcada en las plantas transgnicas que en
las plantas WT. Estos resultados sugieren que la sobreexpresin de LePS y
LeSYS en tabaco potenci el efecto inhibitorio que la herbivora por M. sexta
102
tiene sobre la sntesis de nicotina. Considerando que los ensayos de dao

mecnico no afectaron la induccin de la acumulacin local y sistmica de
nicotina en las plantas transformadas, y que estudios previos han confirmado
que la sntesis de AJ no es afectada negativamente por herbivora (McCloud y
Baldwin, 1997), es posible que la potenciacin del efecto inhibitorio observado en
las plantas transgnicas se haya debido a una sobre-produccin de etileno
endgeno en respuesta a las secreciones orales de M. sexta. Esta es una
posibilidad que deber analizarse con mayor detalle, ya que no hay evidencia de
que la sobreexpresin de prosistemina, por lo menos en L. esculentum,
favorezca la sntesis de etileno en respuesta a herbivora. El efecto sistmico en
raz fue an ms marcado, ya que en las plantas transgnicas los niveles
disminuyeron marcadamente (1.67 veces en la lnea Nt-LeSYS 03 y hasta
niveles no detectable en las otras dos lneas). Esto contrast con las plantas WT,
en las cuales se detect una acumulacin de nicotina en raz de plantas daadas
por herbivora que fue 6.8 veces mayor a la observada en plantas WT daadas
mecnicamente. Este efecto se podra explicar en base a los argumentos de
Baldwin (2001), quin sugiri que la acumulacin de nicotina en races de
plantas daadas por herbvoros que consumen follaje constituye una estrategia
benfica para la planta, ya que al localizar la sntesis y localizacin de este
metabolito en la raz, se favorece el empleo de la nicotina para la defensa de
tejidos areos durante el subsiguiente perodo de recuperacin, en la cual la
capacidad fotosinttica de la planta (y por lo tanto la sntesis de novo de nicotina)
estar seriamente comprometida.
La infestacin B. tabaci tambin tuvo un efecto negativo sobre la
acumulacin de nicotina en plantas WT y transgnicas, particularmente a nivel
local. Es posible que el efecto observado haya sido debido, al igual a lo
observado por dao con M. sexta, a la sntesis facilitada de etileno, aunque esto
no ha sido demostrado an. La nica evidencia experimental a favor de esta
posibilidad, es la induccin de protenas RP en jitomate en respuesta a la
infestacin por este insecto (Mayer et al., 1996), las cuales dependen de etileno
para su expresin en patgenos (Kombrink y Somssich, 1997; Ohtsubo et al.,
1999). Sin embargo, parece ms probable que la infestacin por B. tabaci, que
es un insecto succionador que se alimenta directamente del floema, haya
cambiado la relacin tejido fuente-tejido consumidor en los tejidos infestados, de
103
manera que la demanda de fotosintatos en la hoja infestada de las plantas WT

podra haber reducido la fuerza de la raz como tejido consumidor, similarmente
a lo que ocurre cuando las plantas de tabaco entran en la fase de floracin
(Shiroya et al., 1961), causando una disminucin en el transporte de JA a la raz,
con la consecuente supresin de la induccin de la sntesis de nicotina. Esta
posibilidad se apoya en los resultados obtenidos al analizar las races de las
plantas infestadas, excepto la lnea Nt-LeSYS 03, en las cuales la nicotina se
redujo hasta niveles no detectables. Otra posibilidad es que los niveles de
nicotina regresaron a sus niveles basales, al menos en follaje, debido al largo
tiempo de muestreo, que se hizo 28 das despus de haber infestado con
insectos adultos las hojas de plantas que, al inicio del experimento, tenan solo 4
hojas expandidas. De acuerdo a lo anterior, es probable que los bajos niveles de
nicotina detectados en hojas y races de plantas WT y transgnicas infestadas
por B. tabaci se hayan debido a una combinacin de efectos ontognicos y
fisiolgicos, caracterizados estos ltimos por cambios en el estatus fotosinttico
del tejido fuente o consumidor de los tejidos analizados. Esta suposicin
concuerda en cierto modo con evidencias experimentales previas obtenidas en
Nicotiana que indican que cualquier tratamiento capaz de incrementar la fuerza
de la raz como tejido consumidor (e. g., fertilizacin con nitrgeno) facilita el
transporte de AJ y consecuente sntesis de nicotina, desde las hojas daadas a
la raz (Ohnmeiss y Baldwin, 2000) y con la nocin de que las relaciones tejido
fuente-tejido consumidor ejercen una influencia muy marcada sobre la
resistencia de las plantas a agobios biticos y abiticos (Coleman 1986;
Coleman y Leonard, 1995).
Despus de la nicotina, la nornicotina es el alcaloide ms abundante en N.
tabacum (3% y 6% del total de alcaloides en hojas y races, respectivamente)
(Saitoh et al., 1985). En ciertas especies como N. glauca, la nornicotina es
acilada mediante la formacin de enlaces amida con cidos grasos de 12 a 16
tomos de carbono en respuesta a dao mecnico y AJ exgeno; esta
transformacin la hace ms txica hacia herbvoros adaptados a la nicotina
como M. sexta (Laue et al., 2000). Los resultados obtenidos en plantas WT, en
las cuales solo se detect nornicotina en las hojas distales superior e inferior y
en la raz de plantas adultas intactas, coincidieron en cierto modo con los
reportados en plantas de N. sylvestris (cuyo contenido de nornicotina es superior
104
al reportado en N. tabacum) en las cuales la nornicotina y otros alcaloides

menores fueron cuantitativamente importantes slo en plantas senescentes
(Baldwin, 1989). En forma similar a la acumulacin de derivados acilados de
nornicotina en plantas de N. glauca daadas y tratadas con AJ, la nornicotina se
acumul en hojas daadas y distales superiores de plantas WT. Por su parte, la
acumulacin en respuesta al dao en plantas adultas se reprimi completamente
en las lneas Nt-LePS 08 y WT Nt-LeSYS 03, mientras que en la lnea NtLeSYS 03 se observ una induccin sistmica apical relativamente intensa (ver
Figura 30). Adems, esta lnea fue la nica en la que se detect este alcaloide,
tanto en forma constitutiva como inducible, en hojas y races de plantas jvenes.
Tampoco se detect nornicotina en todos los genotipos sometidos a herbivora
por M. sexta o a infestacin por B. tabaci, lo que posiblemente fue un reflejo de
los niveles abatidos de nicotina detectados en respuesta a estos tratamientos.
Los resultados sugieren que la expresin de LeSYS en tabaco altera el flujo
biosinttico de nitrgeno entre nicotina en raz y nornicotina en follaje,
especialmente en plantas jvenes. La presencia de nornicotina en plantas
jvenes de esta lnea podra haber sido consecuencia de la senescencia
acelerada que la caracteriza.
El cido clorognico (ACG) es un metabolito presente constitutivamente
en varias especies de plantas, particularmente en solanceas, que funciona
como agente protector contra desafos de tipo bitico. Por ejemplo, en plantas de
jitomate y tabaco con altos niveles de este metabolito (en tabaco se acumula en
los tricomas glandulares de la superficie de las hojas), se observ una
progresin ms lenta y una reduccin en los niveles de infeccin por
Pseudomonas syringae y patgenos fungosos, respectivamente (Maher et al.,
1994; Shedle et al., 2003). Asimismo, incrementos en el contenido de cido
clorognico fueron detectados en hojas de plantas infectadas con virus del
mosaico de tabaco, aunque stos se asociaron ms con la formacin de
quinonas y productos polimricos que con la generacin de lesiones necrticas y
acumulacin de compuestos fenlicos propias de la reaccin hipersensible
(Tanguy y Martin, 1972). Su efecto se atribuye, al menos en parte, a la actividad
antioxidante de este metabolito. Esta cualidad favorece su oxidacin, despus
del dao causado por la infeccin microbiana o por insectos, por la enzima
105
polifenol oxidasa para generar quinonas reactivas, que tienen la propiedad de

limitar el crecimiento de microorganismos invasores y/o el dao tisular gracias a
su capacidad de formar entrecruzamientos con componentes de la pared celular
(Rober, 1989; Keinnen et al., 2001).
Los niveles basales de ACG resultaron mucho menor en hojas de plantas
jvenes que en las de plantas adultas. Este resultado posiblemente fue un reflejo
del control estricto que sobre la biosntesis de fenilpropanoides se presenta
durante el desarrollo de la planta (Bate et al., 1994; Whetten y Sederoff, 1995).
Al parecer, el nivel de estos metabolitos en hoja depende de un balance entre la
actividad de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato-sintasa, DAHPS (ruta
del cido shiqumico) y fenilalanina amonio liasa, FAL (ruta de los
fenilpropanoides de donde se produce finalmente el ACG). La actividad de FAL
tambin depende de seales (a)biticas derivadas del medio ambiente, como
aquellas que se producen en respuesta al dao, lo que coincidi con la
acumulacin sistmica y local de ACG (en plantas WT adultas). A su vez, la
expresin de LePS y de LeSYS en plantas transgnicas jvenes caus una
disminucin generalizada, en relacin a las plantas WT, del contenido de ACG
en plantas intactas y daadas. En plantas transgnicas adultas de la lnea WT
Nt-LeSYS 03 y Nt-LeSYS 03 tambin se observ una marcada disminucin en
los niveles de ACG locales y sistmicos de plantas daadas, particularmente en
sta ltima. La lnea Nt-LePS 08 mostr un efecto altamente contrastante
caracterizado por niveles muy bajos de ACG en la hoja de transicin tejido
fuente-consumidor, pero muy elevados en la hoja distal superior de plantas
intactas, situacin que se invirti en los mismos tejidos de plantas daadas. A su
vez, los niveles de ACG disminuyeron drsticamente en plantas WT (reduccin a
niveles no detectables en la respuesta sistmica en hoja y raz) y transgnicas
(reduccin generalizada a niveles no detectables en todos los tejidos analizados)
sometidas a herbivora por M. sexta (Figs. 33 A, B y C). La infestacin por B.
tabaci tambin provoc una disminucin en los niveles de ACG, pero sta fue de
mucho menor intensidad, excepto en hojas de la lnea Nt-SYS 03, donde el ACG
se mantuvo por debajo de los lmites de deteccin (ver Figura 34 B). Estos
resultados indican que al igual que en el caso de la nicotina, la herbivora por
insectos, particularmente M. sexta, redujo los niveles de ACG en plantas WT y
106
que este efecto negativo se potenci en las plantas transgnicas, observndose

inclusive en plantas daadas mecnicamente. Esto sugiere que el metabolismo
de fenilpropanoides se alter, de un modo an no determinado, por la expresin
de LePS y LeSYS en N. tabacum.
Sin embargo, los resultados obtenidos en plantas de la lnea Nt-LeSYS
03, en las cuales se detectaron en general niveles significativamente reducidos
de ACG podran ofrecer una posible pista sobre el mecanismo mediante la
expresin de LePS y LeSYS pues podran estar afectando la ruta de los
fenilpropanoides, ya que el crecimiento y desarrollo anormal que se presenta en
estas plantas caracterizado por enanismo de las plantas, floracin precoz,
morfologa alterada de las hojas (lanceoladas, con bordes irregulares y lesiones
necrticas constitutivas) y flores (ms pequeas, con un desarrollo incompleto de
los estambres), lo que se reflej en una produccin de semillas reducida con
muy baja eficiencia de germinacin (Rocha-Granados, 2004) se asemeja al
observado en plantas de tabaco en las cuales se encuentra alterado el
metabolismo de fenilpropanoides. Con estos antecedentes se podran sugerir los
siguientes escenarios para explicar la reduccin de ACG (y de fenoles totales) en
plantas de tabaco sobreexpresantes de LeSYS y LePS: i) alteracin del balance
de aminocidos aromticos, tal como se observ en plantas transgnicas de
tabaco en las cuales la sobreexpresin de triptfano y tirosina descarboxilasas
result, curiosamente, en una reduccin en los niveles de triptfano y tirosina.
Esto caus alteraciones fisiolgicas y bioqumicas en las plantas transgnicas
debido a un giro compensatorio en el flujo de la ruta del cido shiqumico para
favorecer la sntesis de estos dos aminocidos y disminuir la de compuestos
fenilpropanoides; tales cambios se asociaron a la deteccin de niveles
anormales de metabolitos secundarios como nicotina y cido clorognico (Guillet
et al., 2000); ii) modificacin del equilibrio entre citocininas y auxinas, similar a la
observada en plntulas de tabaco transformadas con variantes del gen 6b de
Agrobacterium tumefaciens, que se considera como un gen accesorio que
modula la accin de estas hormonas. Este cambio se atribuy a una reduccin
en el catabolismo de auxinas debido al efecto protector asociado con la
acumulacin temprana de los fenilpropanoides escopolina y ACG (Glis et al.,
2002, 2004), y/o iii) alteracin en la actividad de la enzima fenilalanina amonio
liasa (FAL), que es la enzima clave responsable de catalizar la reaccin limitante
107
en la sntesis de ACG, que junto con la rutina, son los compuestos fenlicos
extrables ms abundantes en hoja de tabaco. Esta ltima posibilidad se apoya
en el hecho de que plantas de tabaco en las cuales la expresin de FAL
endgeno se suprimi por la sobreexpresin de dos genes FAL exgenos,
provenientes de frjol, presentaron niveles muy bajos de fenilpropanoides as
como un fenotipo caracterizado por alteraciones morfolgicas severas como
enanismo, curvatura y cambio en la textura de las hojas, morfologa y
pigmentacin alterada de las flores, reduccin de la viabilidad del polen, lesiones
necrticas y fluorescentes en hojas y lignificacin reducida, particularmente en el
xilema (Elkind et al., 1990).
Una forma relativamente sencilla de comprobar que existe una relacin
entre la reduccin de ACG, un mayor catabolismo de auxinas y una consecuente
inhibicin del crecimiento por citocininas en plantas Nt-LeSYS 03, podra hacerse
mediante la adicin de niveles bajos (0.3 M) de auxinas sintticas exgenas
(ej., cido naftalenactico) al medio de cultivo usado para la regeneracin in vitro
de estas plantas, tal como fue demostrado por Glis et al., (2002).
Por lo menos siete sesquiterpenos bicclicos (capsidiol, risitina, lubimina,
solavetivona, fituberina, fituberol y debneiol) se acumulan en respuesta a estrs
en N. tabacum (Guedes et al., 1982; Threlfall y Whitehead, 1988). De stos, el
capsidiol es el ms abundante, no slo en N. tabacum sino en otras plantas
solanceas como Capsicum annuum, Solanum tuberosum y Datura spp.
(Guedes et al., 1982). Usualmente, el capsidiol se encuentra ausente en tejidos
sanos y se sintetiza rpidamente en N. tabacum; la acumulacin de esta
fitoalexina se detecta entre 12 y 24 h despus de la infeccin de plantas intactas
por hongos, oomicetos, bacterias y virus o de la induccin de suspensiones
celulares con evocadores boticos (esporas fungosas, fragmentos de paredes
celulares de hongos, glicoprotenas derivadas de oomicetos como criptogena,
celulasa, etc.) o abiticos (e. g., iones metlicos) (Threlfall y Whitehead, 1988;
Vgeli y Chappel, 1988, 1990; Yin et al., 1997; Keller et al., 1998). Sin embargo,
la acumulacin de capsidiol en cultivos celulares inducidos de tabaco, papa y
chile es relativamente fugaz, ya que ste tiende a desaparecer con la misma
velocidad con la cual se acumul, mediante un proceso catablico que no ha
sido plenamente identificado (Threlfall y Whitehead, 1988). En contraste, la
108
sntesis de capsidiol est bien definida. Este metabolito, al igual que todas las
fitoalexinas sesquiterpnicas, se sintetiza a travs de la ruta biosinttica de los
isoprenoides. Su sntesis de novo es precedida por la activacin de la enzima
clave 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (HMGR), de cuya reaccin se
derivar eventualmente el farnesil pirofosfato (FPP). El FPP es el ltimo
compuesto en comn por el que compiten las rutas biosintticas de los esteroles
y sesquiterpenos, respectivamente. En esta ltima, los esqueletos carbonados
son dirigidos hacia la sntesis de capsidiol y otras fitoalexinas similares mediante
una ruta cuya reaccin determinante, catalizada por la enzima 5-epiaristoloqueno sintasa (EAS), es la conversin de FPP a 5-epi-aristoloqueno
(Dudley et al., 1986; Croteau et al., 1987; Threlfall y Whitehead, 1988; Bohlmann
et al., 2002).
En este estudio no se pudo detectar capsidiol sino un producto de
degradacin (Ramrez E, comunicacin personal) que bien podra ser similar a
aquellos reportados por otros investigadores, como la capsenona o la cis-9,10dihidrocapsenona (Zacharius et al., 1985; Whitehead et al., 1987). Es probable
que la ausencia de capsidiol en las muestras analizadas tomadas de las plantas
daadas mecnicamente o por insectos se haya debido a los tiempos de
muestreo, los cuales rebasaron ampliamente la vida media del capsidiol (12-24
h). Resulta, sin embargo, difcil de explicar la deteccin de catabolitos del
capsidiol en tejidos de plantas intactas donde, debido a la naturaleza
estrictamente inducible de este metabolito, no debera estar presente (pero ver
los argumentos presentados ms adelante).
Posiblemente, y tal como se ha observado con otros metabolitos
secundarios de N. tabacum analizados en este trabajo, la acumulacin
constitutiva del capsidiol, la cual se asume por la presencia de su catabolito,
pudiera estar regulada tambin por la ontogenia de la planta, ya que los niveles
constitutivos de esta fitoalexina detectados tanto en hoja como en raz, fueron de
9 a 30 veces ms altos en plantas jvenes. El efecto sobre los niveles de
capsidiol causado por dao mecnico, que se sabe induce levemente la
expresin de EAS (Yin et al., 1997), tambin vari con la edad de las plantas,
siendo inductivo en plantas adultas, e inhibitorio en plantas jvenes (Fig. 35 A y
B). La deteccin de bajos niveles de dihicrocapsenona en plantas intactas,
aunque inesperada, tiene relacin con resultados previos en los cuales se
109
detect una expresin basal del gen GUS en hojas, tallos y races de un nmero
de plantas transgnicas de N. tabacum transformadas con el promotor de EAS4,
uno de las 12 a 15 copias del gen de esta sesquiterpeno ciclasa que se han
detectado en el genoma de N. tabacum (Fachini y Chappel, 1992). De manera
que la presencia de mltiples formas del gen EAS en tabaco sugiere que, en
esta especie, cada uno de los genes podra ser regulado independientemente, y
en forma diferencial, durante el desarrollo o en respuesta a diferentes estmulos
ambientales (Yin et al., 1997), lo que podra explicar los resultados contrastantes
entre plantas jvenes y adultas obtenidos tanto con plantas intactas como
daadas. En las races de plantas de N. tabacum intactas tambin se detect
capsidiol cuantificado en forma directa como dihicrocapsenona cuyos niveles, al
igual que en follaje, fueron superiores en plantas jvenes. Este resultado
coincidi con lo encontrado en races de plantas de tabaco silvestres (N.
attenuata y N. sylvestris), donde se detect la expresin constitutiva del gen
EAS, a la cual se le atribuy una leve acumulacin de capsidiol (10 ng/g PF) en
races de plantas intactas (Bohlmann et al., 2002). De acuerdo a estos
investigadores, este hallazgo sugiere que el capsidiol no es solamente un
metabolito defensivo cuya acumulacin se induce en respuesta a patgenos,
sino que constituye una defensa de tipo constitutivo que se expresa en forma
tejido especfica en algunas especies de Nicotiana para impedir la invasin de
patgenos en la rizsfera, cuyas clulas epidrmicas, las cuales carecen de una
capa de cutcula protectora, son particularmente vulnerables debido a la abrasin
a la que continuamente estn expuestas.
La sobreexpresin en tabaco de LePS y LeSYS redujo, en general, los
niveles
constitutivos
de
capsidiol
(dihidrocapsenona),
en
las
plantas
transformadas, que en algunos casos (e. g., hojas de plantas jvenes de la lnea
Nt-LeSYS 03) estuvieron por debajo del lmite de deteccin. El dao mecnico
tuvo un ligero efecto inductivo en plantas transgnicas jvenes, que contrast
con lo observado en plantas WT, mientras que en plantas transgnicas adultas
(excepto en la lnea Nt-LeSYS 03) el dao mecnico caus una acumulacin
extraordinaria de dihidrocapsenona, particularmente en plantas Nt-LePS 08 (Fig.
35 F). Estos resultados sugieren fuertemente que los mecanismos de regulacin
que controlan la sntesis de este metabolito en N. tabacum se alteraron de tal
forma que permitieron la sobre acumulacin de dihidrocapsenona en respuesta a
110
dao mecnico. Un posible blanco podra ser el gen EAS, cuya expresin est
estrechamente relacionada con la acumulacin de capsidiol y otras fitoalexinas
sesquiterpnicas en N. tabacum. De modo que, al igual a lo que se ha observado
en la induccin del gen FAL (Kuhn et al., 1984; Bolwell et al., 1985; Lawton y
Lamb, 1987; Lois et al., 1989), que como se ha mencionado anteriormente es
una de las enzimas claves que regulan la ruta biosinttica de los
fenilpropanoides, la sntesis elevada y estable de capsidiol en la plantas Nt-LePS
08 y WT Nt-LeSYS 03 podra haberse debido a un incremento en: i) la tasa de
traduccin de los ARNm que codifican para las diferentes formas del gen EAS y
la subsiguiente sntesis de novo de la enzima EAS; ii) la estabilidad de los
transcritos de EAS; y/o, iii) la velocidad de transcripcin del gen EAS. Esta
hiptesis se apoya en los hallazgos de un estudio realizado por Vgeli y
Chappell (1990), quienes demostraron que la regulacin de la actividad de la
enzima sesquiterpeno ciclasa en N. tabacum est mediada por un control, a nivel
transcripcional, de la expresin del gen EAS. Sin embargo, no puede descartarse
una posible contribucin de otros genes reguladores de la sntesis de
isoprenoides, como el HMGR. Estas son posibilidades que quedan sujetas a
posterior investigacin para ser verificadas o desmentidas.
La acumulacin de capsidiol (dihidrocapsenona) en plantas WT sometidas a
herbivora por larvas de M. sexta fue ligeramente superior a la detectada en
plantas daadas mecnicamente (Figs. 35 y 36). Un efecto similar se observ en
plantas Nt-LeSYS 03 (Fig. 36 C), mientras que en las lneas Nt-LePS 08 y WT
Nt-LeSYS 03, la herbivora fue claramente incapaz de inducir la acumulacin de
los mismos niveles de capsidiol observados en plantas daadas mecnicamente,
lo que sugiere que cualquiera que haya sido el factor generado por dao
mecnico que dispar la sntesis de capsidiol en estas plantas transgnicas, fue
neutralizado o suprimido por componentes presentes en las secreciones orales
de M. sexta, tal como se discuti anteriormente en el caso de la nicotina. A pesar
de ello, la leve induccin de capsidiol coincidi con los resultados reportados por
Bohlmann et al., (2002), quienes detectaron la acumulacin de transcritos de
EAS y de capsidiol, aunque en niveles inferiores a los reportados en
suspensiones celulares de N. tabacum (Vgeli y Chappell, 1988), en tejido areo
de plantas de N. attenuata y N. sylvestris daadas por larvas de M. sexta. Por el
111
contrario, se detect una fuerte acumulacin de capsidiol (dihidrocapsenona),

particularmente a nivel local (excepto en la lnea Nt-LeSYS 03), en plantas
infestadas por mosquita blanca (Fig. 37 A a 37 C). Los altos niveles de capsidiol
detectados en estas plantas coinciden con la propuesta de que los insectos
chupadores que se alimentan directamente del floema son percibidos por la
planta como patgenos, debido a las similitudes que existen entre la manera en
que las hifas fungosas y el estilete de los insectos chupadores penetran la planta
y en menor medida, entre el tipo de enzimas hidrolticas que se liberan durante la
invasin por hongos patgenos o alimentacin de los insectos (Fidantsef et al.,
1999; Walling, 2000). La expresin de respuestas defensivas similares a las
inducidas por patgenos en plantas infestadas por insectos chupadores tambin
se ha atribuido a los virus y/o microorganismos, endo simbiontes que ellos
frecuentemente se encuentran (McKenzie et al. 2002). Es probable que la
induccin de capsidiol (dihidrocapsenona), por mosquita blanca detectada en las
plantas estudiadas, al igual a lo observado en plantas transgnicas de N.
tabacum transformadas con el promotor EAS4 fusionado al gen GUS (Yin et al.,
1997), haya sido independiente de cido saliclico, cido jasmnico y H2O2. Esta
propuesta se apoya, en cierta medida, en los resultados reportados por van de
Ven et al., (2000), quienes encontraron que la expresin del gen SLW3, inducida
en plantas de calabaza infestadas por B. argentifolii, fue independiente de estas
molculas de sealizacin.
112
8. CONCLUSIONES
1. La extraccin simple con metanol actico acuoso, result ser eficiente y

confiable para la obtencin de metabolitos secundarios de inters (alcaloides,
fenoles y terpenos) con varias propiedades qumicas, obviando la necesidad de
procesos de extraccin ms elaborados.
2. La tcnica anlitica por GC/MS en la cuantificacin e identificacin de

metabolitos de inters (nicotina, c. clorognico, capsidiol y nornicotina) no
modificados por la insercin de cadenas laterales (glicosilacin, acetilacin,
mutilacin, etc.), result ms confiable y precisa que HPLC.
3. La cantidad y distribucin de metabolitos defensivos vari de acuerdo a la

ontogenia y tipo de desarrollo de la planta en Nicotina tabacum (WT y
transgnica), as como tambin por el tipo de tratamiento y tejido analizado.
4. La cantidad y distribucin de metabolitos defensivos se modific por la

expresin de LePS y LeSYS en N. tabacum, lo que podra tener relacin con los
diferentes grados de resistencia contra herbivora detectados entre plantas WT,
Nt-LePS y Nt-LeSYS y con el fenotipo anmalo de plantas Nt-LeSYS 03.
113
9. PERSPECTIVAS
Sera conveniente llevar a cabo un anlisis tipo Tail-PCR para detectar

secuencias aledaas de la insercin del T-ADN en la lnea Nt-LeSYS 03, con el
propsito de descartar la posibilidad de que el fenotipo alterado no se debi a la
interrupcin de algn gen involucrado en procesos se desarrollo y crecimiento
de la planta, causante del fenotipo anormal.
Sabindo que el cido jasmnico (AJ) induce la acumulacin de nicotina
en plantas de N. attenuata, el cual se incrementa en las hojas daadas y
rpidamente se transporta a las races va floema, y que es un componente
esencial de la sealizacin entre hoja y raz, sera interesante determinar los
niveles de AJ en plantas transgnicas de Nt-LePS y Nt-LeSYS
en distintas
etapas de desarrollo para corroborar si existe una relacin entre los niveles de
AJ in planta y los resultados obtenidos por dao mecnico y hervibora.
La inhibicin de la sntesis de nicotina en hojas atacadas por M. sexta fue
mucho ms marcada en las plantas transgnicas que en las plantas WT. Se
sugiere que la sobreexpresin de LePS y LeSYS en tabaco potencia el efecto
inhibitorio que la herbivora por M. sexta tiene sobre la sntesis de nicotina,
posiblemene por una acumulacin de etileno endgeno. De modo que sera
conveniente analizar esta posibilidad, pues no se conoce que la expresin de
sistemina y/o prosistemina incremente los niveles de Et en respuesta a
herbivora por Manduca sexta.
Sera interesante cuantificar los niveles de nicotina el da de mxima
acumulacin (5o da), en plantas infestadas con Bemisia tabaci, pues se sabe
que en plantas de Nicotiana los niveles de este metabolito se incrementan en
repuesta a dao, y verificar si la induccin de nicotina se reprime en este lapso al
igual como ocurre con herbivora por Manduca sexta.
Sera interesante comprobar si existe algn desbalance o reduccin de
algn componente de la ruta de los fenilpropanoides como FAL en la planta NtLeSYS, pues su fenotipo anormal se asemeja al observado en plantas de tabaco
en las cuales se encuentra alterado el metabolismo de fenilpropanoides y si
114
existe una relacin entre la reduccin de ACG observado con un mayor

catabolismo de auxinas y una consecuente inhibicin del crecimiento por
citocininas, debido a la expresin de LeSYS.
Considerando que el espectro de masas de la mayora de los picos
obtenidos por GC/MS produjo seales que indicaban la presencia de
modificaciones por oligosacridos y otros compuestos orgnicos, sera
conveniente realizar un anlisis de los extractos despus de su hidrlisis cida
para tener una idea del grado de modificacin que pudieran tener los metabolitos
secundarios de inters en tabaco. Resultara interesante determinar si el grado
de modificacin cambia en respuesta al dao mecnico y herbivora, y si estos
cambios tienen relacin con su actividad biolgica.
115
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CENTRO DE INVESTIGACIN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Identificacin y cuantificacin de metabolitos secundarios

DR. JOHN PAUL DLANO FRIER

A Humberto Valenzuela Soto, por su apoyo incondicional en todo momento.

A mis queridas tas y primas, que me han alentado en este camino.

El presente trabajo de tesis fue realizado en el

2.1. Mecanismos de defensa

2.1.1. Tipos de respuestas de defensa en planta

2.1.1.1. Respuesta innata y respuesta especfica, gen por gen.

2.1.1.2. Respuesta local

2.1.1.3. Respuesta sistmica

2.2. Mecanismos de defensa en tabaco

2.3. Respuestas de resistencia en plantas contra el ataque de plagas

2.3.1. Inhibidores de proteasas

2.3.2. Polifenol oxidasas

2.4.1. Actividad y translocacin de sistemina

2.4.2. Modelo de la ruta de sealizacin activada por sistemina

2.4.3.Glicopptidos ricos en hidroxiprolina (sisteminas) de tabaco

2.5.1. Expresin y supresin de la actividad de la prosistemina

2.5.2. Homologa de la prosistemina de jitomate en plantas solanceas

2.6. Metabolitos secundarios en tabaco

2.6.1. Alcaloides (nicotina, nornicotina)

2.6.2. Compuestos fenlicos

2.7. Modelo de estudio

de jitomate Nt -LePS 08, Nt -LeSYS 03 y la cruza WT X Nt -LeSYS 03

2.7.3. Resistencia a herbivora por larvas de Manduca sexta en plantas

4.1. Objetivo general

4.2. Objetivos especficos

5.1. Cultivo de plantas

5.2. Cultivo in vitro de la lnea Nt -LeSYS 03

5.3. Preparacin de X-Gluc

5.4. Ensayos de dao mecnico

5.5.1. Condiciones del experimento de herbivora con Manduca sexta

5.5.2. Infestacin con mosquita blanca (Bemisia tabaci)

5.6. Preparacin de extractos

5.7. Anlisis de fenoles totales

5.8. Condiciones para cuantificar e identificar metabolitos secundarios por

5.8.2 Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas

5.10. Anlisis estadstico

6.1. Identificacin de metabolitos secundarios de inters por GC/MS, en

plantas jvenes y adultas.

6.2.1. Tratamiento: dao mecnico

6.2.2. Tratamiento: herbivora por larvas de M. sexta (plantas adultas)

6.2.3. Tratamiento: infestacin por mosquita blanca (plantas adultas)

6.3. Cuantificacin de cido clorognico en plantas jvenes y/o adultas

6.3.1. Tratamiento: dao mecnico

6.3.2. Tratamiento: herbivora por larvas de M. sexta (plantas adultas)

6.3.3. Tratamiento: infestacin por mosquita blanca (plantas adultas)

6.4. Cuantificacin de dihidrocapsenona en plantas jvenes y/o adultas

6.4.1. Tratamiento: dao mecnico

6.4.2. Tratamiento: herbivora por larvas de M. sexta (plantas adultas)

6.4.3. Tratamiento: infestacin por mosquita blanca (plantas adultas)

6.5. Cuantificacin de cido nornicotina en plantas jvenes y/o adultas

6.6.1. Tratamiento: dao mecnico

6.6.2. Tratamiento: herbivora por larvas de M. sexta (plantas adultas)

6.6.3. Tratamiento: infestacin por mosquita blanca (plantas adultas)

Adenosina Monofosfato Cclica

Ciclasa de xido de aleno

Fenilalanina amonio liasa

Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de

Glicoprotenas ricas en hidroxiprolina

Hoja distal joven (apical)