Produccin de Protenas Recombinantes a Nivel Industrial en la Argentina

INTRODUCCION
Las protenas recombinantes son aquellas protenas producidas en el laboratorio mediante ingeniera gentica
en clulas distintas a las que se producen en la naturaleza. Las ventajas que presentan son varias:
Obtencin de protenas de distintos orgenes, en organismos fcilmente cultivables.
Obtencin de grandes cantidades del producto, de una forma ms fcil y reproducible, en comparacin con
el obtenido por extraccin a partir de su fuente natural.
Obtencin de productos libres de patgenos y otros riesgos potenciales. Esto es particularmente importante
en el caso de los productos farmacuticos. Por ejemplo, los factores de coagulacin o la hormona de
crecimiento pueden administrarse libres de contaminacin como protenas recombinantes, en lugar de
protenas purificadas de sangre e hipfisis humanas, respectivamente.
Pueden producirse protenas que no existen en la naturaleza, como los anticuerpos de cadena simple, tiles
en el diagnstico y tratamiento de algunas enfermedades.
Prcticamente todas las enzimas que se emplean en la industria (farmacutica, alimenticia, textil, papel,
qumica, detergentes, etc.) son recombinantes. Si bien muchas de ellas son microbianas, resulta ms fcil y
reproducible su obtencin a partir de microbios conocidos en profundidad y fcilmente cultivables. Entre los
sistemas utilizados para la produccin de las protenas recombinantes se encuentran Escherischia coli, clulas
de ovario de hmster chino CHO , lneas celulares de rin de hmster bebe y Sacharomyces cerevisiae,
siendo el ms elegido para la produccin de frmacos en uso humano la expresin en clulas eucariotas, como
las levaduras y CHO, debido a la necesidad del procesamiento postraduccionales ( por ejemplo,
glicosilaciones).
Adems existen sistemas alternativos que podran abaratar los costos de produccin, como las plantas y los
animales transgnicos, pero estos estn an en etapas de desarrollo o evaluacin.
El rea con mayor impacto es la de biofrmacos, debido a la posibilidad de producir de manera ms eficiente
medicamentos para un gran nmero de enfermedades (diabetes, cncer, insuficiencias cardiovasculares,
hemofilia, etc).
El primer biofrmaco (o medicamento biolgico) apareci en 1982. Era la insulina recombinante humana,
producida en las instalaciones del laboratorio Eli Lilly, en Indianpolis, Estados Unidos. El gen de la insulina
humana fue introducido en una bacteria que produjo la misma sustancia que elabora el pncreas, y as se
benefici a millones de diabticos de todo el mundo.
Comparado con las drogas qumicas pequeas, las protenas tienen alta especificidad y actividad en
concentraciones relativamente bajas.
Actualmente, ms de 350 biofrmacos estn siendo probados para el tratamiento de ms de 150 enfermedades
y se estima que para el ao 2012 los medicamentos biotecnolgicos representarn el 12% del total de las
ventas mundiales de medicamentos de prescripcin.
Para asegurar la consistencia en las caractersticas de los productos finales, y los perfiles de seguridad y
eficacia, tanto la fuente del material, los procesos de manufactura, la formulacin as como las condiciones de
almacenaje deben ser cuidadosamente seguidas y controladas, cumpliendo las exigencias GMP especficas
para los productos biotecnolgicos. Para tal fin existen organismos encargados de hacer cumplir dichas
normas, en la Argentina esta tarea la lleva a cabo la ANMAT (Administracin Nacional de Medicamentos,
Alimentos y Tecnologa mdica) a travs de su dependencia el INAME (Instituto Nacional de Medicamentos).
CAPITULO 1: Qu es una protena recombinante
Las protenas recombinantes son aquellas protenas producidas en el laboratorio mediante ingeniera gentica
en clulas distintas a las que se producen en la naturaleza, por ejemplo insulina humana producida en E. coli.
Se aplican en uso mdico, veterinario e industrial, siendo las ms promocionadas las aplicadas en medicina
clasificadas como Biofrmacos con base a protena.
Los Biofrmacos son medicamentos de origen biolgico, o sea producidos a partir de un ser vivo, pueden
tener base a protena o cido nucleico. Los de base a protena son de alta similitud o iguales a protenas
humanas, siendo ms complejos y lbiles que gran parte de los medicamentos compuestos de pequeas
molculas (frmacos de sntesis qumica).

Otro elemento distintivo de los productos con base a protenas es que en la mayora de los casos son difciles
de caracterizar. La protena ms bsica y simple es compleja en s misma, y hay estructuras moleculares de las
protenas que no pueden ser diferenciadas con la tecnologa disponible hoy en da. Por este motivo la
produccin de medicamentos biolgicos genricos (Biogenricos) suele ser ms difcil que la produccin de
medicamentos de sntesis qumica.
Las protenas recombinantes humanas revolucionaron el tratamiento de diversas enfermedades, como por
ejemplo diabetes, hepatitis, cncer.
El ejemplo ms conocido de protena recombinante (debido a su uso por parte del jugador de futbol Lionel
Mess) es la hormona de crecimiento humano, una sustancia que la hipfisis produce en forma natural, pero
que en algunas personas est disminuida y causa diversas alteraciones y enfermedades. Una de ellas, baja
estatura.
Como ya se mencion, igualmente existen protenas recombinantes aplicadas a otras reas fuera del rea
teraputica, como por ejemplo rea alimenticia, investigacin y diagnstico
CAPITULO 2: Sectores en la empresa - Pasos hasta el producto final
La empresa.
La empresa debe contar con departamentos o reas coordinadas y especializadas para el desarrollo de
protenas recombinantes.
Es muy importante contar con una Direccin de Desarrollo Tecnolgico (DDT) con la misin de convertir
resultados cientficos en productos finales y/o tecnologas. El proceso completo de desarrollo abarca desde el
establecimiento de las tecnologas a nivel de laboratorio con todos los parmetros de calidad requeridos, hasta
su escalado y produccin de lotes. Todo este proceso debe ser planeado metodolgicamente en una direccin
integrada de proyectos, que garantice una correcta planificacin de los objetivos y una revisin sistemtica de
su avance. En esta Direccin se combinan las normas de buenas prcticas de laboratorio y buenas prcticas de
produccin sustentadas en un sistema de calidad documentado que garantiza la mxima calidad y seguridad
de los productos y tecnologas que se desarrollan.
Se debe contar con laboratorios especializados en microbiologa, fermentacin de microorganismos,
purificacin de biomolculas, formulacin, mtodos analticos y sector de produccin de lotes adems de un
personal formado por cientficos y tecnlogos con experiencia en diversas reas de la biotecnologa, farmacia,
bioqumica, biologa entre otros, para desarrollar temas que incluyen modificacin gentica de
microorganismos, fermentacin de bacterias, purificacin de protenas, formulacin y pruebas de estabilidad y
desarrollo de tcnicas analticas.
Se debe evaluar peridicamente la influencia de los aditivos y del material de empaque en la actividad
biolgica del principio activo, de los excipientes para la estabilizacin de un producto, estudiar la estabilidad
acelerada de un producto y la estabilidad en tiempo real, el diseo de nuevos envases primario y secundario
para los productos en fase de estudios clnicos.
Esta actividad permite lograr presentaciones para los productos que le confieren, entre otros, facilidad y
seguridad de administracin, alto valor agregado y as un alto nivel competitivo.
El Departamento de Aseguramiento de la Calidad debe garantizar que se lleven a cabo las acciones
planificadas y sistemticas que son necesarias para proporcionar la confianza de que los productos y servicios
cumplen los requisitos de calidad establecidos. Debe controlar el cumplimiento de las Buenas Prcticas de
Produccin (BPP), Buenas Prcticas de Laboratorio (BPL) y Buenas Prcticas Clnicas (BPC). Las siglas en
ingls son GPP, GLP y GCP, respectivamente.
El Departamento de Regulaciones debe tener a su cargo la confeccin de los expedientes de registro de todos
los productos de la empresa y los trmites correspondientes a nuevos registros, renovaciones, autorizaciones
de ensayos clnicos y modificaciones de registros ante las autoridades reguladoras del pas de produccin y
otros pases. Debe participar en la etapa de desarrollo de nuevos productos y en la evaluacin de los cambios,
asesorando desde el punto de vista de las regulaciones vigentes. Para esos propsitos recibe informacin e
interacta con otras reas de la institucin.
Tratamiento de efluentes y residuos de laboratorio
En el laboratorio se manejan gran cantidad de productos y se efectan diversas operaciones que generan
residuos, en la mayora de los casos peligrosos para la salud y el medio ambiente.

Unas adecuadas condiciones de trabajo en el laboratorio implican inevitablemente el control, tratamiento y

eliminacin de los residuos generados en el mismo, por lo que su gestin es un aspecto imprescindible en la
organizacin de todo laboratorio.
Residuos biolgicos y orgnicos deben almacenarse en recipientes especficos convenientemente sealizados
y retirarse siguiendo procesos preestablecidos y validados. Normalmente se esterilizan y se incineran. Debe
controlarse la temperatura y la posible toxicidad de los humos producidos. La instalacin de un incinerador
slo est justificada por un volumen importante de residuos a incinerar o por una especial peligrosidad de los
mismos. En ciertos casos se pueden emplear las propias calderas disponibles en los edificios.
La gestin es el conjunto de actividades encaminadas a dar a los residuos txicos y peligrosos el destino final
ms adecuado de acuerdo con sus caractersticas; comprende las operaciones de recoleccin, clasificacin,
almacenamiento, transporte, tratamiento, recuperacin y eliminacin.
La adecuada gestin de los residuos en el laboratorio no es solamente una necesidad con el objeto de mejorar
las condiciones de trabajo sino que constituye una pieza fundamental en la aplicacin de criterios de calidad y
gestin ambiental, siendo tambin una de las exigencias de aplicacin de las buenas prcticas (BPL o GLP). A
primera vista todo ello implica un costo, pero es evidente que repercute positivamente en la gestin del
laboratorio, siendo rentable a mediano plazo.
Existe un grupo de residuos que estn afectados por disposiciones legales especficas, como son los residuos
radiactivos, los residuos cancergenos y los residuos biolgicos. Ello implica que dichos residuos deben tener
una identificacin propia que permita reconocerlos claramente y gestionarlos de manera diferenciada de
acuerdo con las prescripciones legislativas especficas.
Proceso de produccin de una protena recombinante en bacterias (E. Coli).
Estrategias de diseo de procesos
Al disear un proceso se deben tener en cuenta varios tems:
A- Conocer las propiedades fsicas y qumicas bsicas del principio activo y caractersticas del producto final,
como definir pureza requerida.
El uso determina la pureza. Para agentes teraputicos se requiere un alto grado de pureza del principio activo.
Se tolera un mximo de 100 ppm de impurezas de 10 pg/dosis, adems de estar libre de pirgenos.
B- Definir perfectamente el material de partida. Muchas veces la metodologa de purificacin condiciona
etapas de produccin. Por ejemplo, pueden existir componentes del medio de cultivo que posean sustancias
muy similares al producto final que, por lo tanto, interfieren en la purificacin del mismo. En este caso se
debe eliminar ese componente del medio de cultivo.
C- Trazar diferentes esquemas tentativos de separacin y purificacin y llevarlos a etapas de laboratorio y
piloto.
Algunas reglas que se siguen para esto son:
a. Elegir etapas sucesivas de procesos basados en diferentes propiedades fisicoqumicas.
b. Separar las impurezas de mayor proporcin en las primeras etapas.
c. Luego de concentrar, usar en las primeras etapas de purificacin un mtodo con mayor resolucin. Estos
poseen un alto rendimiento aunque no brinden la mayor pureza. En cierta medida lo que se hace es seguir
concentrando para reducir la cantidad de muestra (volumen) a tratar en las etapas posteriores.
d. Dejar el proceso ms complejo (y por lo general ms caro) para el final.
Desarrollo y obtencin de la cepa por ingeniera gentica.
Para el desarrollo del proceso y la obtencin del producto, una vez que se ha comprobado la funcin del
principio activo y que posee un potencial comercial, el siguiente paso es disear un proceso a nivel de
laboratorio para determinar las mejores condiciones para el cultivo con el objetivo de alcanzar una alta
productividad que haga rentable al proceso.
A nivel laboratorio las formas ms sencillas y productivas que actualmente se utilizan son las del crecimiento
de un microorganismo que genere el producto de inters.

Contando con la informacin de la secuencia del factor de inters, por medio de ingeniera gentica se puede
hacer que el gen o parte del mismo se exprese en un sistema bacteriano. De los sistemas ms usualmente
utilizados se encuentra el de Escherichia coli. El gen codificante para la protena qumicamente sintetizado se
inserta en el vector controlada por el promotor, obtenindose el plsmido.
Con la eleccin de cepa y vector se busca expresar la protena en el medio facilitando enormemente la
extraccin y purificacin, no son muchos los sistemas que trabajan de esta manera y sean altamente eficientes.
De no ser posible esto la preferencia es la expresin de la protena en su forma soluble o en ltima instancia,
formando cuerpos de inclusin. La eleccin del vector no solo se basa en la capacidad de expresar las
protenas en el destino deseado sino que tambin sea un sistema econmico para inducir.
Igualmente, depende de que producto se desea obtener.

Esquema 1. Pasos generales ms comunes a realizar en ingeniera gentica para obtener una cepa productora.
La sntesis del gen
Se realiza por el mtodo de reaccin en cadena de la polimerasa conocido como PCR, en donde el ADN del
gen de inters se amplifica por medio de la accin de una polimerasa como puede ser la Taq polimerasa.
- Extraccin de cualquier vector de una clula
El procedimiento suele ser, lisar la clula con detergentes y quelantes de Ca y Mg para romper y desestabilizar
la membrana, respectivamente. La centrifugacin separa los cuerpos ms grandes de los pequeos, el uso de
solventes orgnicos (como el cido tricloroactico), de proteasas y RNAsas permite la separacin de protenas
y ARN del ADN. El uso de una base fuerte (NaOH) permite la desnaturalizacin del ADN y luego el cambio
brusco de pH permite que los ADNs de menor peso (el del vector) se renaturalicen rpidamente mientras que
los de mayor peso forman agregados (ADN bacteriano) lo que luego por centrifugacin se logra la separacin
de ambas ADN. Todos los procesos se llevan a cabo en sistemas donde estn regulados el pH, concentraciones
de cofactores para el funcionamiento de las enzimas, la temperatura, la presin osmtica y la fuerza inica.
- Digestin enzimtica con enzimas de restriccin
En este paso conociendo la secuencia del inserto y que los vectores tienen un sitio de restriccin se elige con
que enzimas digerir para que luego la unin inserto y el vector sea ptima.
- Unin inserto vector (ligacin)
Obtenidos los cortes de restriccin en este paso se utiliza la parte de la maquinaria de sntesis de ADN que se
encarga de unir las bases. La encargada de este proceso es la enzima ligasa.
- Transformacin
En este paso a las bacterias se les introduce el vector con el inserto, para ello las bacterias se las vuelve
competentes, es decir que pueden captar ADN del medio, en este caso el del vector. Esto se logra utilizando
energa elctrica (electroporacin) o lavados con soluciones de Ca o Mg, estos procesos tienen como objetivo
crear poros parciales en las membranas para permitir el paso del vector.
- Bsqueda de los clones positivos (screening)
Es el proceso por el cual se buscan los clones que han incorporado el vector con el inserto para realizar su
separacin de los que no lo han incorporado.
Controles durante la obtencin de la cepa recombinante
Al menos se deben realizar los siguientes controles:
- La Presencia del plsmido o vector por medio de gel en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Si al
correr el gel se observa que la banda de la muestra es distinta al del vector original, es indicacin de que el
vector fue modificado. Al introducir el inserto y hacer el SDS-PAGE los vectores corren distintos.
- Durante la digestin enzimtica se observa hasta que punto lleg la digestin del vector por medio de un gel
en condiciones nativas. En estas condiciones el vector genera tres bandas que corresponde a su forma lineal
(corre ms rpido) que se encuentra primero (desde abajo hacia arriba del gel) le sigue su forma enrollada
pero con cortes que le quitan tensin a la molcula, y por ltimo el vector sin cortes en su forma plegada. Si la
digestin fue bien realizada en el caso de utilizar dos enzimas de restriccin, en el gel se deber observar dos
bandas, correspondientes a dos ADNs lineales, una al fragmento ms pequeo en donde se liberan lo sitios de
restriccin y la otra al resto de la molcula del vector. En el caso de utilizar una sola enzima se deber
observar la banda correspondiente al vector lineal.

- En el proceso de unin vector-gen sinttico, se verifica que porcentaje se ha alcanzado. Solo sobreviven en
el medio de cultivo con antibitico las bacterias que hayan incorporado el vector ligado ya que de lo contrario
morirn por no poder generan la resistencia que llevan (el DNA lineal no puede ser transcripto).
En la seleccin, las clulas transformadas se someten a un cultivo con antibitico si sobreviven es porque
incorporaron el vector de lo contrario mueren debido a que el vector lleva la resistencia al antibitico.
Generalmente los vectores tienen un segundo sistema de diferenciacin en donde se inserta el gen en estudio
esto le da cierta caracterstica a la colonia que incorporaron el gen-sinttico. Uno de los sistemas ms
comunes es el de gen lacZ que hace que las colonias se vean azules y las que recibieron el plsmido junto
con el gen sinttico se ven blancas debido a que el gen fue cortado por la secuencia del inserto.
Investigacin y desarrollo de las condiciones para el cultivo
Una vez obtenida la cepa productora, en el caso del estudio elegido E. coli con el vector, se procede al estudio
de las mejores condiciones del cultivo para la produccin de la protena.
A nivel laboratorio
- Cultivo continuo.
En un primer paso se utiliza el cultivo continuo para determinar las caractersticas fisiolgicas de la cepa
como la velocidad de crecimiento y como vara su produccin segn la fuente de sustrato, que factores de
crecimiento son necesarios, y cuales son las condiciones ptimas de pH y temperatura, entre las caractersticas
ms importantes.
Con este sistema se puede mantener constante la velocidad de crecimiento variando la composicin del medio
y parmetros del cultivo o viceversa.
Inconvenientes.
Inestabilidad gentica de la cepa, prdida de plsmidos.
Alta probabilidad de contaminacin.
Dificultad en establecer estado estacionario.
Debido a esto en la industria muchas veces se recurre a datos bibliogrficos de esta manera se evita la
inversin en investigacin.
- Cultivo batch alimentado.
Determinados los estudios en el cultivo continuo se procede a utilizar un cultivo batch alimentado. Este
cultivo se inicia a partir de un cultivo en batch. Aqu un cultivo en batch se alimenta continuamente con
medio nutritivo fresco. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta tcnica permite
controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo.
Es til en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formacin de producto son sensibles a la
concentracin del sustrato limitante, o sea cuando el rendimiento celular o la productividad de biomasa o del
producto es lo que interesa. Este mtodo evita fenmenos de inhibicin por sustrato.
Metodologa de trabajo. (Las condiciones de cultivo pueden cambiar. Las que se expresan son a modo de
ejemplo).
- Cultivo primario: 1mL del medio almacenado se cultivan en 30mL de medio suplementado con el antibitico
de seleccin en frascos 250mL. Incubado a 37C y 200 rpm durante 10 h.
- Cultivo secundario: 0.7mL del cultivo primario se cultivan en 70mL de medio de cultivo en frascos de
500mL, mismas condiciones que el cultivo primario durante 9h. 140 ml de cultivo se inoculan en 2.5L de
medio de produccin en un fermentador de 5L.
- Fermentacin:
- pH: 7 regulado con 2M NaOH y 1M H2SO4,
- Temperatura: generalmente 37C,
- RPM: 600,
- Caudal de aireacin: 4L/min,
- Oxgeno disuelto: aproximadamente 20% de la saturacin del aire.
- Alimentacin: fuente de carbono y energa (glucosa, glicerol, etc.)

- Controles:
- Determinacin de la densidad celular por densidad ptica a 600nm (OD600). El peso seco se estima
relacionado linealmente el peso seco y la OD600.
- La concentracin de glucosa (o glicerol) se puede medir con ensayos enzimticos utilizados en glucemia ( o
triglicridos).
- La concentracin de fosfato se determina por un kit de diagnstico basado en la reaccin entre el fosfato y el
amonio molibdato para formar cido fosfomolibdico, que forma un complejo azul con sulfato amnico
ferroso. Las protenas en las muestras se precipitan con cido tricloroactico antes de analizar el fosfato para
evitar interferencia.
-La protena recombinante producida se mide con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y
rutinariamente medido por SDS-PAGE y Western Blot para determinar su presencia. Este ltimo es cualitativo
ya que sus valores son mayores comparado con el mtodo ELISA que es ms sensible (que es cuantitativo).
A nivel produccin.
Escalado
Del proceso de laboratorio se debe pasar a los procesos de escalado piloto y produccin.
- Escalado piloto: Se determinan las condiciones ptimas al ir escalando el proceso de laboratorio. Este paso
es importante ya que aqu se validan los procesos por los entes reguladores y son los que se utilizarn para las
condiciones de producciones mayores. Tambin es necesario para corregir inconvenientes ya que en
instalaciones mayores seran muy costosas.
Los posibles cambios de bioreactor son una posibilidad que en muchos casos se ve limitada en la empresa por
el costo de los mismos. Si se considera el valor del producto final y la rentabilidad del mismo, la mejora
productiva que puede acarrear el pasaje a otro bioreactor (o sistema en el mismo), se ve reflejado en una gran
inversin.
- Produccin: Una vez puesto a punto y validado el proceso de escalado piloto, se disea la planta para una
mayor produccin. En este proceso se tienen los siguientes inconvenientes:
Disminucin del rendimiento
Cambio de cintica
Efecto de la esterilizacin
Efecto del inculo
Problemas de transporte
Entre los criterios de escalado se encuentran:
Mantener constante la potencia por volumen utilizada, P/V.
Mantener constante el coeficiente volumtrico de transferencia de masa, kLa.
Mantener constante la velocidad de la punta de las paletas del agitador, nd.
Mantener constante el tiempo de mezclado.
- Purificacin
Para la extraccin de la preparacin cruda del material de origen se utiliza una centrfuga de discos de tazn
abierto, o se realiza una filtracin que retenga partculas ms pequeas que no pude separar la centrfuga. Los
dos son sistemas cerrados que evitan la formacin de aerosoles, lo que los hacen ideal para el manejo de
microorganismos patgenos o sustancias txicas.
Estos equipos deben contar con instalaciones que regulen y controlen los fenmenos de generacin de calor,
formacin de aerosoles y de ruido.
La ms grave limitacin es el taponamiento (fouling) de las membranas, lo que disminuye el flujo.
El taponamiento irreversible puede ocurrir por las siguientes circunstancias
Ciertas protenas se adsorben a la superficie de la membrana.

 Los desechos celulares forman una fina capa sobre la membrana.

Los compuestos qumicos utilizados normalmente como antiespumantes en una fermentacin pueden ocluir
irreversiblemente los poros de las membranas.
Existen protocolos de ciclos de lavado para eliminar los depsitos sobre la superficie de las membranas
dependiente del tipo de muestra y las caractersticas qumicas de las membranas.
A medida que aumenta el dimetro de la partcula a separar, el costo de separacin por centrifugacin decrece
mientras que para la filtracin no se ve afectado. Con la filtracin puede ser que las membranas no sean
compatibles con el producto o no se pueda eliminar la interaccin con los antiespumantes.
La centrifugacin requiere un mayor capital inicial y poco de mantenimiento en cambio en los sistemas de
filtracin se requiere la compra de cartuchos de membranas peridicamente lo que se lleva el mayor capital.
Para la eleccin de estas tcnicas se depende de la escala del proceso, cuando se requieren procesar
volmenes muy grandes la centrifugacin se hace mucha ms competitiva a la filtracin. Pero en este caso se
complementan.
En el caso de tratarse de una protena con destino extracelular, los mtodos antes descriptos seran suficientes
para entrar en el siguiente paso de purificacin, pero lo que ocurre con mayor frecuencia es que las protenas
recombinantes formen cuerpos de inclusin o en menor medida, encontrarse en el citoplasma, de forma
soluble.
Si se trata de los ltimos dos casos, es necesaria la lisis celular para liberar el material proteico.
A escala de laboratorio, esto se logra mediante ruptura con ultrasonido o lisis qumica. A gran escala lo ms
comn es el uso de homogeneizadores por tener mayor capacidad. El material biolgico se coloca bajo una
fuerte presin hidrosttica (alrededor de 500 atmsferas) y la presin se libera bruscamente permitiendo que
el lquido salga por una vlvula, lo que ocasiona la lisis celular.
Si la protena es soluble, una vez que se han lisado las clulas, los restos celulares se retiran bien por
centrifugacin de gran capacidad a baja velocidad o por filtracin en membrana. Al final se obtiene un lquido
libre de clulas que es el que sufre los tratamientos posteriores para aislar y en su caso purificar el producto de
inters.
Si la protena ser purificada a partir de los cuerpos de inclusin, el producto de inters es el precipitado de la
solucin lisada, tras la centrifugacin. Este material luego debe ser resuspendido para su purificacin.
La purificacin final forma parte de las etapas ms caras en la recuperacin del producto implican el uso de
mtodos cromatogrficos. Tales mtodos son de especial valor para la purificacin de materiales biolgicos
sensibles y encuentran un amplio uso en la preparacin de materiales farmacuticos, reactivos de diagnstico
y reactivos para investigacin. Los distintos mtodos cromatogrficos que existen segn su mecanismo de
separacin son: filtracin en gel (peso molecular), cromatografa de adsorcin (interacciones hidrofbicas),
cromatografa de intercambio inico (carga), cromatografa de afinidad (actividad biolgica) y electroenfoque
(punto isoelctrico).
Esquema general del proceso (microorganismo que genera el producto de inters)
Esquema 2: Procesos generales a desarrollar para la obtencin de una protena recombinante en bacterias
No solo el producto debe ser purificado sino tambin los insumos del proceso como tambin las instalaciones
o sea contar con materias primas y elementos esterilizados libres de potenciales contaminantes del proceso.
Los siguientes esquemas muestran posibles diseo para la esterilizacin de los insumos del reactor por medios
de filtros.
- Parmetros de evaluacin de la purificacin.
Durante los procesos de purificacin se llevan a cabo controles para determinar su eficiencia y determinar si
los mtodos utilizados son los ptimos. Este paso es el que determina el tipo de inversin a realizar.

Rendimiento: % = cantidad de producto despus de la purificacin x 100/cantidad de producto en el material

de partida
Pureza: Actividad especfica (AE) = cantidad de protenas de inters /cantidad total de protenas
Factor de purificacin = AE luego de la purificacin/AE antes de la purificacin
Costo del producto = costo del material de partida + expensas /rendimiento
Expensas = f (costo de materiales de purificacin, equipamiento, personal, etc.)
- Estabilizacin final del producto.
Los ensayos de estabilidad demuestran cmo cambian los productos farmacuticos envasados y no envasados
con el tiempo segn las condiciones de temperatura, humedad y luz. Los datos obtenidos se emplean para
establecer duracin de almacenaje y las condiciones de almacenamiento de los productos.
- Secado del producto.
En este paso se utilizara uno de los procesos ms utilizados que es el liofilizado que consiste en deshidratar
una sustancia congelndolo en un primer paso y luego eliminando el agua por vaporizacin mediante
presiones bajas cercanas al vaco.
- Empaque.
Dependiendo el mercado a donde se dirija el producto el envase deber cumplir con normas preestablecidas
para asegurar el producto bajo ciertas condiciones de almacenaje adems de la esttica de la cual se encargar
el Departamento de Marketing.
- Aseguramiento de la calidad.
Una vez terminado el proceso todo lote debe estar identificado junto con un certificado de calidad.

CAPITULO 3: Uso salud humana, uso alimenticio, uso agropecuario

Empresas biotecnolgicas
Las empresas de biotecnologa realizan procesos tanto en fases de investigacin y desarrollo como en
aplicaciones productivas. Entre sus productos se encuentran las protenas recombinantes, a continuacin
separadas en tres reas mayoritarias:
Produccin agropecuaria:
- Inoculantes: producidos a partir de cepas de bacterias, destinados a aumentar la fertilidad de la produccin
agropecuaria.
- Biopesticidas y bioherbicidas
- Sanidad animal: vacunas y marcadores genticos.
Ingredientes alimentarios para bioprocesamiento:

-Coadyuvantes tecnolgicos: enzimas y cultivos.

Algunas enzimas recombinantes destinadas a la industria alimenticia son:
quimosina que sustituye a la natural obtenida del estmago de terneros, y que se obtiene a partir de los
hongos Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger transformados genticamente con genes de vacuno. Uso
coagulacin de las protenas de la leche (casena). Influencia en el sabor y aceleracin de la maduracin.
-amilasa obtenida a partir de Bacillus subtilis recombinante. Esta enzima licua el almidn y lo convierte en
dextrina en la produccin de jarabes. En la industria cervecera, favorece la retencin de la humedad del
producto y baja el contenido calrico del producto. Adems mejora la calidad del pan disminuyendo la
viscosidad de la pasta. Produce una miga muy blanca y mejora la coloracin de la superficie.
Pectinasas producidas por Aspergillus oryzae transformada con el gen de A. aculeatus. Permiten la
clarificacin de jugos concentrados al degradar las pectinas provenientes de restos de semillas.
Glucosa oxidasa y catalasa obtenidas a partir de Aspergillus niger recombinantes. Estas enzimas se utilizan
para eliminar azcares de huevos y evitan que aparezcan olores anormales durante la deshidratacin de los
mismos.
Lipasa obtenida en Aspergillus oryzae recombinante se utilizan en la fabricacin de concentrados de aceites
de pescado.
Glucosa isomerasa proveniente de Streptomyces lividens al que se le ha inserto el gen de Actinoplanes.
Permite obtener, a partir de glucosa, jarabes ricos en fructosa, con mayor poder endulzante.
-glucanasa producida por levaduras cerveceras recombinantes, que facilitan la filtracin del producto.
Salud humana:
-Actividades de diagnstico (biosensores, inmunodiagnsticos, pruebas de genes, entre otros)
- Actividades teraputicas (produccin de vacunas, reactivos, terapia gentica, estimulantes inmunes,
biofarmacuticos).

Tabla 1: Protenas recombinantes para uso en salud humana. (1)

En el ao 2005 en la Argentina la ANMAT aprob la produccin de insulina recombinante por parte de un
laboratorio nacional, Denver Farma, cubriendo de esta manera un espacio hasta el momento dominado por
empresas extranjeras. La empresa Denver Farma dijo que el mercado de las insulinas es difcil de cuantificar
con exactitud en la Argentina, sin embargo segn la auditora IMS que mide la venta de insulinas a salida de
drogueras, entre mayo del 2005 y abril del 2006 se vendieron 927.237 unidades. La Federacin Argentina de
Diabetes determin que de los cerca de 1.5 millones de pacientes diagnosticados, alrededor de 200 mil
personas deben administrarse insulina diariamente.
CAPITULO 4: Protenas recombinantes ms vendidas en la Argentina
ERITROPOYETINA (EPO):
La eritropoyetina se utiliza en el tratamiento de la anemia asociada con insuficiencia renal crnica en
pacientes adultos y peditricos en hemodilisis y en pacientes adultos en dilisis peritoneal.
Al contrario que la insulina, que se obtena del pncreas de cerdo antes del empleo de insulina recombinante,
la EPO no tuvo un origen tan arcaico. Slo mediante el aislamiento del gen de la EPO, as como mediante
clonacin y expresin in vitro, fue posible producir la hormona en cantidades suficientes para la terapia con la
ayuda de procedimientos de fabricacin biotecnolgicos.
EPO se produce en Argentina desde 1990 por la compaa Sidus tambin bajo el nombre de Hemax.
El vehculo de expresin recombinante para la produccin de las variantes de Epoetina y es en cada caso
un subclon genticamente modificado de una lnea celular del ovario de hmster chino (Cricetulus griseus),
llamadas clulas CHO (de Chinese Hamster Ovary). Para la produccin de la variante de Epoetina- se usa
una lnea celular genticamente modificada y subclonada del rin de hmster dorado sirio (Mesocricetus
auratus auratus), conocida como clulas BHK (de Baby Hamster Kidney).
Todas las variantes de EPO recombinante difieren de las nativas en la composicin de las estructuras de
azcares y diferencias entre las propias variantes recombinante.

INSULINA:
La insulina es la hormona secretada por el pncreas, cuya actividad principal es la de regular el metabolismo
de los hidratos de carbono y grasas. Se usa para el tratamiento de Diabetes Miellitus.
Las insulinas de tipo recombinante ocupan el 93% de la demanda mundial y se diferencian de las anteriores
versiones en que en vez de obtenerse a partir de bovinos o porcinos, se logra mediante fermentacin.
Denver Farma, que es el encargado de producir en el pas insulina humana, denominada Densulin,
constituyndose en el primer establecimiento de Amrica Latina en fabricar ese medicamento.
Denver Farma es una empresa farmacutica argentina de capitales y tcnicos argentinos, con slida formacin
cientfica y demostrables recursos tecnolgicos.
INTERFERON Alfa 2b (IFN 2b):
El interfern alfa es una citoquina de potente actividad inmunomoduladora, antiviral y antiproliferativa. Su
complejo mecanismo de accin involucra a la regulacin de la transcripcin de genes para distintas protenas
celulares y a la estimulacin de clulas efectoras del sistema inmune, resultando en una accin antiviral y
antitumoral.
A partir de clulas de origen humano, se aisla el fragmento de ADN que contiene el gen correspondiente para
la sntesis de hu-IFN beta y se clona en un plsmido recombinante capaz de transfectar una lnea celular en
cultivo.
La construccin gentica es integrada al genoma celular permitiendo la expresin de hu-IFN, que se secreta
al medio extracelular.
El interfern beta humano recombinante as sintetizado, es idntico en su estructura y funcionalidad al nativo.
En Argentina es producido por Bio Sidus S.A. y Laboratorio Delta Farma S.A.
HORMONA DE CRECIMENTO (hGH):
La hormona de crecimiento es una protena producida por la glndula hipfisis situada en la cara anterior del
cerebro. Circula en el torrente sanguneo y tiene efectos en todo el organismo. En ocasiones es llamada
somatotropina o somatotrofina. La hormona de crecimiento utilizada para el tratamiento se denomina
somatropina.
Durante muchos aos el tratamiento del enanismo hipofisiario fue dificultoso. La nica fuente de obtencin
de hormona de crecimiento era a partir de glndulas hipofisarias extradas de cadveres. Estas primeras
producciones de hGH no slo eran escasas, sino que tampoco ofrecan seguridad dado su origen extractivo de
glndulas cadavricas.
A mediados de los aos 80', la exitosa produccin de hGH a partir de organismos genticamente modificados,
como bacterias o clulas de mamfero, permiti una amplia disponibilidad de esta protena que rpidamente se
convirti en el tratamiento de eleccin para aquella patologa. Desde 1997, aplicando la tecnologa de ADN
recombinante, Bio Sidus produce hGH a partir de la fermentacin de bacterias que poseen el gen humano para
dicha protena.
FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS (G-CSF):
El G-CSF recombinante (fligastrim, NEUPOGEN) es una glucoprotena producida en Escherichia coli.
Aumenta las funciones fagocticas y citotxicas de los neutrfilos. Es eficaz en el tratamiento de neutropenia
grave consecutiva a trasplante de mdula sea y quimioterapia a altas dosis.
En Argentina lo producen los laboratorios Pablo Cassar y Bio Sidus SA.
INTERFERON BETA (IFN ):
El interfern beta en la Esclerosis Mltiple tiene efectos inhibitorios en la proliferacin de leucocitos y en la
presentacin de antgenos. Adems modula la sntesis de citoquinas hacia la produccin de las de tipo
antiinflamatorio sobre todo a nivel del SNC.

El Interfern beta 1 a es un interfern glicosilado, producido por tecnologa de DNA recombinante por clulas
CHO (ovario de hamster chino) genticamente modificado. La secuencia aminoacdica es idntica a la del
interfern beta natural. El interfern beta 1 b es un interfern no glicosilado producido por tecnologa de DNA
recombinante por una cepa de E.Coli. Posee sutiles diferencias estructurales con el interfern.
Biogen Idec Argentina comercializa interferon beta-1a intramuscular. En la actualidad, es el medicamento
para la esclerosis mltiple ms prescripto en todo el mundo, con ms de 135.000 pacientes en tratamiento, y el
primero en ser aprobado para pacientes que han sufrido un primer brote de esta enfermedad. En nuestro pas,
Interferon beta-1a IM fue comercializado anteriormente por Abbott Laboratories S.A.
CAPITULO 5: Laboratorios que producen protenas recombinantes
A continuacin se mencionarn los laboratorios argentinos o internacionales con sede en Argentina que
producen protenas recombinantes.
Baxter
Baxter es una empresa internacional con cede en la Argentina desde 1993. Baxter Argentina SA adquiri
Inmuno SA, con lo cual se produjo la integracin de ambas compaas. Pertenece al sector productivo salud
mdica y medicamentos. Produce protenas recombinantes, tecnologa y servicios que contribuyen al
tratamiento de la enfermedad renal crnica, hemofilia, enfermedades infecciosas, trastornos del sistema
inmune y otras graves enfermedades. En el presente, se desarrolla a travs de las siguientes reas:
Bioscience
Transfusin therapies
Medication delivery. Soluciones
Parentales_ Sistemas de Infusin_ Nutricin_ anestesia
Renal
Las protenas recombinantes que produce se muestran a continuacin.
Factor VIII de la coagulacin recombinante
Composicin: Factor VIII obtenido mediante ingeniera gentica a partir de una lnea celular de ovario de
hamster chino (CHO). El F VIII recombinante posee las mismas propiedades que el F VIII humano.
Indicaciones: Tratamiento de la hemofilia A, complemento en el tratammiento de la hemofilia A agravada por
inhibidores y deficiencia de Factor VIII adquirida.
Presentacin: Producto liofilizado de 500 y 1000 Ul de Factor VIII, frasco ampolla de 10 ml de solvente y
equipo de infusin descartable.
Factor VIII de la coagulacin 100 % recombinante, sin derivados de plasma/albumina humano ni animal.
Composicin: Factor VIII obtenido mediante ingeniera gentica a partir de una lnea celular de ovario de
hamster chino (CHO). El F VIII recombinante posee las mismas propiedades que el F VIII humano. No hay
componentes humanos no animales en la produccin del factor.
Indicaciones: Tratamiento de la hemofilia A, complemento en el tratamiento de la hemofilia A agravada por
inhibidores y deficiencia de Factor VIII adquirida.
Presentacin: Producto liofilizado de 250, 500 y 1000 Ul de Factor VIII, frasco ampolla de 10 ml de solvente
y dispositivo Baxject para su preparacin.
BioSidus
BioSidus es una empresa que se encuentra dentro del sector productivo salud humana y medicamentos. Se
especializa en la generacin de materias primas biotecnolgicas, en desarrollo biotecnolgico en campos
vegetal, animal, y salud humana. Producen eritropoyetina recombinante.
Boheringer Ingelheim Argentina.
Dentro de los numerosos medicamentos que produce, desarrolla Actilyce, activador de plasmingeno tisular
humano recombinante. A nivel mundial ocupa uno de los principales lugares en el mercado, lo que la ubica
como una de las compaas ms importantes en el rubro farmacutico.
GEMA Biotech
Compaa biotecnolgica privada con sede central en Buenos Aires Argentina. Focalizada en el desarrollo,
produccin, purificacin, caracterizacin y ensayos de citoquinas humanas producidas en medio libre de suero
para el uso teraputico.
Algunos de sus productos son: -interleuquina 2 (IL-2) protena recombinante humana producida en E. coli,
indicada para carcinoma renal y melanoma. Eritropoyetina protena recombinante producida en clulas de

mamfero, indicada para tratar la anemia. Interferon alfa 2 producido en E. coli e indicado para tratar
sarcoma de Kaposi, leucemia y hepatitis C crnica.
IDEAR
INDEAR, Instituto de Agrobiotecnologa Rosario es la compaa de I+D de Bioceres, la cual tiene en foco a
dos reas temticas: el mejoramiento de cultivos para aumentar su productividad y la produccin de enzimas
industriales en plantas. Para esto, INDEAR utiliza las herramientas de la biologa molecular moderna va
estrategias de organismos modificados genticamente y no modificados genticamente. El proyecto se basa en
la produccin de la quimosina en plantas de crtamo, la cual es una enzima de amplia utilizacin en la
industria lctea, para la coagulacin de la leche en la produccin de quesos. El proyecto est completo
respecto de las etapas de I+D y actualmente busca socios interesados en la produccin y comercializacin del
producto.
Laboratorio Pablo Cassar SRL
El Laboratorio Pablo Cassar se especializa en el sector productivo salud humana y medicamentos. Produce
protenas recombinantes en sistemas procariontes. Uno de sus principales productos es el GCSF.
Laboratorio Purissimus
Las protenas recombinantes que produce Laboratorio Purissimus son inmunoglobulinas, albmina, factor
VIII, IgG anti D, IgG ant hepatitis B, factor IX y complejo protombnico. Se trata de una empresa argentina
que consiste en una planta de hemoderivados en donde se purifican derivados del plasma. La empresa se
dedica, adems a la seguridad viral de hemoderivados.
PBL
PBL, Productos Bio-Lgicos, pertenece al sector productivo de reactivos y diagnstico. Es un
emprendimiento que surgi en el 2001 dentro del programa de incubacin de empresas de la UNQ. Se
especializa en desarrollo, produccin de reactivos e insumos para las tareas de investigacin, diagnstico e
industria mediante ingeniera gentica y la biotecnologa. Producen Taq Pegasus, una ADN polimerasa
termoestable recombinante.
PC Gen
El laboratorio PC gen una empresa incubada y pertenece al sector productivo salud humana y medicamentos.
PC-Gen ha desarrollado productos como Interfern alfa, Interleukina 2 y GM-CSF y eritropoyetina.
En el caso de eritropoyetina, ha desarrollado clones y establecido los criterios de purificacin de la protena.
Por otra parte, se han establecido todos los criterios analticos de acuerdo a Farmacopea Europea. PC-Gen
cuenta con un departamento de control de calidad en el anlisis y caracterizacin de productos
biotecnolgicos.
Zelltek
El laboratorio Zelltek pertenece al sector productivo salud humana y medicamentos. Es una empresa de
desarrollo, produccin y comercializacin de productos de inters teraputico destinado al mercado
farmacutico. Produce eritropoyetina humana recombinante. Focalizados en la produccin de nuevos
productos para el tratamiento del cncer e infecciones virales.
CAPITULO 6: Desarrollos en curso
En estos momentos, el laboratorio BioSidus S.A. maneja distintos productos que se producen en la planta y se
comercializan en el pas y en distintas partes del mundo. Las dos grandes lneas que se trabajan en la
actualidad son, por un lado, los productos de fermentacin en bacterias y por el otro, los expresados en
clulas.
En cuanto a inversin y desarrollo, para sus proyectos, Bio Sidus cuenta con un presupuesto anual de
inversin que ronda los u$s 8 millones y hay tres principales megaproyectos de investigacin.
- El primero se refiere al desarrollo de terapias gnicas en el que estn trabajando fuertemente en la aplicacin
del gen del factor de revascularizacin para problemas coronarios y obstrucciones perifricas. Este proyecto
lleva un par de aos de trabajo con la Fundacin Favaloro y con el Instituto de la Inmaculata de Roma. Por
ahora, permanecen en la etapa de estudio con animales. Una gran posibilidad sera, en lugar de usar los genes

para insertarlos en algn elemento biolgico y producir protenas que se puedan llevar al organismo, que el
gen acte en l directamente.
- El segundo gran proyecto se basa en animales transgnicos, con lo cual estn trabajando hace 4 aos
tratando de buscar el animal como reactor biolgico para la produccin de protenas recombinantes que
necesitan mayor masa y, por consiguiente, mayor volumen de reactor. Una solucin podra ser producir un
gen y expresar esa protena, por ejemplo, en la leche de la vaca o de la cabra, donde, luego, se hace un
proceso de purificacin hasta aislar la protena. Actualmente estn en la fase de desarrollo de trabajo con
animales y es un proceso que debe madurar en los prximos 5 aos.
Los animales transgnicos son aquellos que poseen un gen que no les pertenece a su especie. Generalmente, y
la forma ms sencilla para generar un animal transgnico requiere primero aislar el gen que se desea
introducir en el genoma del animal. Este gen que no pertenece al genoma de la especie del animal se
denomina transgen. Esto requiere el empleo de tecnologa de ADN recombinante e ingeniera gentica,
tcnicas bsicas de biologa molecular y su uso es muy extendido en biotecnologa.
Esta tecnologa requiere clonacin y manipulacin del genoma para que pueda ser insertado en el genoma y
expresado por el nuevo organismo. A fin de que las clulas del organismo expresen este nuevo gen o transgen,
se debe incorporar dicho transgen en un embrin en sus estadios iniciales, cuando es un cigoto. Luego de
asegurarse que el transgen fue efectivamente clonado en el embrin, se debe proceder a implantar el embrin
en un animal receptivo. Todo este procedimiento requiere una cuidadosa tecnologa de fertilizacin in
vitro .
En el caso que no interese que todas las clulas del animal contengan el transgen, sino algunas clulas
especficas o tejido especficos se debe efectuar un procedimiento similar al ya descripto, pero en lugar de
inyectar el transgen en el cigoto, se inyecta en el embrin en etapas ms tardas. Por medio de aplicar este tipo
de tecnologa de transgnesis se obtiene un animal donde algunas clulas contienen el genoma normal de la
especie, y otras clulas tienen incorporado en su genoma el transgen.
En Argentina se ha efectuado con xito la tecnologa de transgnesis en animales, llevando a la creacin de las
vacas transgnicas. Estas vacas transgnicas se han diseado para que produzcan en su leche la hormona de
crecimiento humano y otras productoras de insulina, de la misma forma. Este desarrollo biotecnolgico fue un
emprendimiento efectuado entre la Universidad de Buenos Aires y la empresa Bio Sidus. Sin lugar a dudas es
un desarrollo en biotecnologa de avanzada en la regin y porque no tambin a nivel internacional.
La aplicacin de la tecnologa de animales transgnicos presenta nuevas oportunidades de desarrollo
biotecnolgico y puede brindar a la sociedad la oportunidad de su aplicacin tanto en biomedicina, como en
otras reas de la biotecnologa, abarcando un amplio espectro en las reas de desarrollo y produccin. Sin
lugar a dudas la transgnesis ha causado una revolucin en biotecnologa, planteando adems nuevos desafos
ticos y morales.

Esquema 3: pasos generales en el desarrollo de animales transgnicos de Bio Sidus S.A.

- Por ltimo, la otra lnea importante es un proyecto con plantas transgnicas a 5/6 aos, Bio Sidus tiene una
Divisin de Biotecnologa Vegetal, donde est trabajando en el desarrollo de herramientas para la aplicacin
de la biotecnologa vegetal con el propsito de que, en un futuro, se pueda trabajar en un modelo de planta
transgnica que pueda servir para producir protena recombinante.
Productos (desarrollo en curso) por Bio Sidus:
- Parathormona humana por sntesis qumica: Hormona que induce la formacin de tejido seo; entre otros
usos sobresale su potencial eficacia en el tratamiento de la osteoporosis.
- Estreptoquinasa recombinante: Tromboltico.
- Produccin de hGH en animales transgnicos: Se procura direccionar la sntesis de hGH humana a la
glndula mamaria buscando su secrecin en leche de vacas transgnicas.
- Terapia Gnica de Revascularizacin: Mediante el uso de vectores no virales se trata de restablecer la red de
arterias en tejidos con problemas circulatorios (isquemias cardacas y problemas de circulacin perifrica en
piernas y brazos)

- Biotecnologa Vegetal: trabaja en la produccin de distintas protenas en plantas transgnicas, as como en la

mejora de varias especies vegetales, otorgndoles resistencia a virus y/o herbicidas.
- Terapia anti-IFN
- Vacuna anti TAT
Productos (desarrollo en curso) por Universidad del Litoral
Frmaco contra el cncer GM-CSF, sigla en ingls correspondiente a Factor Estimulante de Colonias de
Granulocitos y Macrfagos: contribuye a la quimio y radioterapia contra el cncer al proteger a las clulas
defensivas del organismo, que as puede tolerar dosis mayores contra el tumor. El GM-CSF que hay en el
mercado proviene de bacterias o levaduras; el de la Universidad del Litoral se produce a partir de clulas de
mamferos, lo cual evita efectos adversos. El proyecto est prcticamente terminado y estan por poner en
marcha ensayos clnicos de este producto. Hay otros dos productos en desarrollo pero, como son patentables,
no pueden darlos a conocer por razones de confidencialidad.
CAPITULO 7: Buenas prcticas de manufactura y
procedimientos operativos estandarizados
Las Buenas Prcticas de Manufactura (BPM) Good Manufacturing Practices (GMP) son prcticas de
higiene recomendadas para que el manejo de materiales garantice la obtencin de productos inocuos.
Procedimientos Operativos Estandarizados (POES SSOP Sanitation Standard Operating Procedures): son
aquellos procedimientos escritos que describen y explican como realizar una tarea para lograr un fin
especfico, de la mejor manera posible. Existen varia actividades/operaciones, adems de las de limpieza y
desinfeccin, que se llevan a cabo en un establecimiento elaborador que resulta conveniente estandarizar y
dejar constancia escrita de ello para evitar errores que pudieran atentar contra la inocuidad del producto final.
Segn la Food And Drug Administration (FDA) POES abarcan:
* Manutencin general
* Sustancias usadas para limpieza y saneamiento
* Almacenamiento de materiales txicos
* Control de plagas
* Higiene de las superficies de contacto con alimentos
* Almacenamiento y manipulacin de equipos y utensilios limpios
* Retirada de la basura y residuos
Si el establecimiento o la autoridad sanitaria detectaran que el POES fall en la prevencin de la
contaminacin adulteracin del producto, se deben implementar medidas correctivas. Estas incluirn la
correcta disposicin del producto afectado, la reinstauracin de las condiciones sanitarias adecuadas y la toma
de medidas para prevenir su recurrencia.
El establecimiento debe llevar adems, registros diarios suficientes para documentar la implementacin y el
monitoreo de los POES y de toda accin correctiva tomada. Estos registros deben estar disponibles cuando la
Autoridad Sanitaria as lo solicite.
Cada establecimiento de contar con su propio Manual de POES donde se describen todos los
procedimientos de limpieza y desinfeccin que se realizan peridicamente antes y durante las operaciones que
sean suficientes para prevenir la contaminacin adulteracin de los productos que all se manipulan.
Una vez desarrollado cada POES ser firmado y fechado por un empleado responsable/supervisor con
autoridad superior. Esta firma significa que el establecimiento implementar los POES tal cual han sido
escritos y, en caso de ser necesario, revisar los POES de acuerdo a los requerimientos normativos para
mantener la inocuidad los productos que all se manipulan.
Los POES son realizados para todas las operaciones y todos los turnos de actividad.
Estos procedimientos deben ser monitoreados, verificada su eficacia y en caso de considerarse necesario,
revisados con cierta frecuencia.
Resulta esencial el entrenamiento de los empleados para la aplicacin de POES y el nfasis en la importancia
de seguir las instrucciones de cada procedimiento para lograr la inocuidad de los productos.
CAPITULO 8: Entidades regulatorias. Exigencias

Los procesos de produccin atienden ciertas normas que difieren segn el producto que se elabore:
medicamentos por un lado, alimentos por otro, etc. El producto, adems, requiere de una evaluacin
exhaustiva que determine que es inocuo para la gente, los animales y/o el ambiente, y que tenga el efecto
esperado. Dependiendo del producto, y del proceso para obtenerlo, las normas reguladoras cambian.
En Argentina, la Administracin Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa mdica (ANMAT) se
encarga de registrar, controlar, fiscalizar y vigilar la sanidad y calidad de:
Medicamentos
Alimentos
Productos mdicos
Cosmticos, de Higiene y Tocador
Domisanitarios
Reactivos de Diagnstico
Suplementos Dietarios
Y todos aquellos que se consumen o utilizan en la medicina, alimentacin y cosmtica humana
Para la reglamentacin de los distintos productos, existen dentro del ANMAT institutos particulares. Por
ejemplo.
el INAME (Instituto Nacional de Medicamentos) controla y fiscaliza la sanidad y la calidad de las drogas,
productos qumicos, reactivos, medicamentos, elementos de diagnstico, productos de higiene, tocador, y
cosmtica humana, ya se trate de productos de origen nacional o importados. Tambin, ejerce las actividades
de fiscalizacin de los establecimientos que realizan actividades de elaboracin, importacin y en algunos
casos de distribucin de dichos productos.
El campo de accin de este Instituto debe abarcar adems, el estudio, generacin y proposicin de
legislaciones y normativas que contemplen nuevos desarrollos de productos o procesos de forma tal que el
proceso de evaluacin y aprobacin de los mismos no constituya una traba burocrtica que retarde el acceso
de la poblacin a nuevos productos de competencia del INAME.
el INAL (Instituto Nacional de Alimentos), controla y fiscaliza la sanidad y la calidad de los alimentos,
incluyendo aditivos, colorantes, edulcorantes e ingredientes utilizados en la alimentacin humana, como
tambin de los suplementos dietarios, productos de uso domstico y de los materiales en contacto con los
alimentos.
la DEM (Direccin de Evaluacin de Medicamentos) tiene a su cargo la evaluacin clnica de los
medicamentos.
CONVISA, Comisin Nacional de Biotecnologa y Salud,es la autoridad reguladora de la biotecnologa
aplicada a la salud. La misma fue creada por la Resolucin N 413/93, del director de la Administracin
Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa (ANMAT). Tiene como misin asesorar al gobierno
nacional en lo referido al desarrollo y la aplicacin de la biotecnologa en el campo de la salud. Estudia y
recomienda las normas vigentes que rigen el desarrollo, elaboracin y aprobacin de productos
biotecnolgicos destinados a la salud y el consumo humano.
En lo referente a la regulacin de protenas recombinantes, en la Argentina no hay disposiciones
especficamente desarrolladas para la regulacin de dichos productos biolgicos/biotecnolgicos. Es decir, no
existe una clasificacin que se encuentre integrada por estos productos, ms bien sern clasificados y
regulados de acuerdo a otras propiedades de los mismos. Por ejemplo, la insulina, la cual pertenece a un grupo
especial de medicamentos denominados de ventana estrecha, es decir, que por debajo de ciertas dosis no
tienen eficacia y por encima de ciertas dosis son txicas. Cualquier nuevo producto que se apruebe debera
demostrar algn tipo de equivalencia con las cuatro que se comercializan en la actualidad. Pero el ao pasado,
por ejemplo, fue aprobada una insulina que si bien no se comercializa, no present ningn tipo de estudio de
biosimilaridad. De esta manera, es posible encontrar productos no avalados por ningn ensayo o estudio serio.
Protocolos de investigacin clnica
Para que un producto farmacutico llegue al mercado y al pblico, antes debe pasar por una serie de
exhaustivos anlisis, en su conjunto conocidos como Ensayos preclnicos y Ensayos clnicos. En una primera
etapa de desarrollo, la nueva droga debe ser evaluada en animales modelo, para investigar cmo se distribuye
en el organismo, y cules son sus efectos positivos y negativos. Si esta etapa se supera con xito, comienzan
los ensayos clnicos con personas voluntarias, que deben cumplir una serie estricta de requisitos para poder
participar de los mismos. Dentro de los ensayos clnicos, se distinguen distintas fases (I, II, III) en las cules

se evala la dosis ptima, la efectividad para el tratamiento de la enfermedad en estudio, y los efectos
adversos o no deseados. En funcin de los resultados, la droga es aprobada o no para su uso como
medicamento en seres humanos.
En algunos casos el marco regulador es el mismo independientemente de la forma de obtencin. Pero, en
otros casos es diferente, como en la obtencin de insulina en leche de vacas transgnicas, o el caso del maz
Bt.
Ejemplo en la realizacin de un protocolo de ensayos clnicos en la Argentina para el componente A, el cual
es una protena recombinante .
Visita de iniciacin 7 de noviembre del 2007. Estudio abierto en Fase IIIb para el tratamiento en primera lnea
del componente A ms taxanos en monoterapia o combinacin, de pacientes con cncer de mama metasttico
o con recidivia local.
El protocolo del componente A tiene como objetivo primario evaluar el perfil de seguridad del componente A
cuando se combina con otros medicamentos en pacientes con CMm o RL. Como objetivo secundario, se
intenta evaluar la eficacia, en las mismas condiciones para determinar el perfil de seguridad. La eficacia del
componente A se mide como el tiempo hasta la progresin de la enfermedad (TP) y sobrevida total (ST). Por
otra parte, se pretende evaluar la seguridad del componente A en pacientes que desarrollan metstasis en SNC,
durante el tratamiento y en los seis meses siguientes al mismo. Los objetivos mencionados para este protocolo
en particular, evaluacin de la seguridad y eficacia, se comparten con otros protocolos ya que, son
indispensables para determinar la aprobacin del medicamento que esta siendo evaluado.
Generalidades
El nmero de pacientes a fines de octubre fue de 1146 incluidos a nivel mundial y el nmero de centros que
participaron del protocolo fueron 400 para el protocolo del componente A. Las cifras mencionadas para este
protocolo en particular, dan a entender la importancia de ampliar el nmero poblacional para evaluar la accin
teraputica de los medicamentos en vas de aprobacin. Dado que el nmero de pacientes sobre el cual se
evala es de gran magnitud y recoge datos a nivel mundial, permite hacer los anlisis estadsticos
correspondientes y ms representativos.
Duracin del estudio
La duracin del protocolo mencionado tiene implicancias generales a los dems protocolos de investigacin
clnica. En este caso particular, los pacientes recibirn el componente A hasta la progresin de la enfermedad,
el desarrollo de la toxicidad inaceptable, retiro del consentimiento del paciente o hasta el fin del estudio. Es en
este punto donde interviene las normativas sobre los estudios clnicos. El investigador a cargo deber ser
responsable en permitir la salida de un paciente del protocolo, si est su salud y vida en peligro. Aqu juega un
rol importante las normas de tica mdica, a saber:
Declaracin de Helsinki de la asociacin Mdica Mundial,
Principios ticos para las Investigaciones Mdicas en seres humanos y sus sucesivas modificaciones,
Guidelines For Good Clinical Practice E6 ,
Pautas ticas Internacionales para la Investigacin Biomdica en seres humanos, preparadas por el Consejo
de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Mdicas (CIOMS) en colaboracin con la OMS,
Principios ticos bsicos enunciados en el reporte de Belmont,
Finalmente, las leyes y reglamentos emanados por las autoridades de la salud de la Repblica Argentina.
El cumplimiento de las normas y reglamentos vigentes son evaluados por el Comit de tica Independiente,
tanto interno como externo pertenecientes al protocolo puesto en marcha y la entidad nacional reguladora
correspondiente: ANMAT. Las pautas involucradas en el protocolo no solo afectan la dedicin del
investigador principal, sino de todos los participantes del mismo.
Criterios de elegibilidad
Los pacientes que integren el protocolo debern adecuarse a los criterios de elegibilidad para ser
seleccionados. Estos son dos, los criterios de inclusin y los criterios de exclusin. El paciente podr cumplir
algn requisito explicitado en el criterio de inclusin pero, no deber reunir ningn criterio de exclusin. Por
ejemplo, para el protocolo del componente A los criterios de inclusin comprenden el consentimiento
informado por escrito obtenido antes de cualquier procedimiento especfico del estudio, funcin
hematolgica, heptica y renal adecuada y prueba srica de embarazo. Por otra parte, puede mencionarse
ejemplos del criterio de exclusin como, quimioterapia previa a CMm o RL y ciruga mayor.
Esquemas del protocolo

El protocolo esta constituido por una serie de estapas, las cuales son enrolamiento o screening, visita baseline,
visitas por ciclo, visita final, visitas de seguimiento, finalmente, visita de sobrevida. El esquema a llevar a
cabo durante la realizacin del protocolo se muestra a continuacin.

Esquema 4: realizacin de un protocolo

Sreening y evaluaciones iniciales
Durante esta fase del tratamiento se debe obtener la firma del consentimiento informado de todos los
pacientes antes de cualquier procedimiento especfico del estudio. El investigador deber confirmar la
elegibilidad del paciente segn los criterios de inclusin y exclusin del estudio. Las evaluaciones de
screening y la visita de evaluacin basal debern realizarse dentro de los 28 das de la primera infusin del
medicamento en evaluacin. Los pacientes que no renan los criterios de elegibilidad no sern enrolados. Una
vez que se haya confirmado la elegibilidad del paciente, se le asignar un nmero de enrolamiento, para el
protocolo ejemplificado, mediante el sitio web del eCRF
Fases del tratamiento
En cada ciclo, se registran datos en el eCRF, los cuales consisten en anlisis clnicos del paciente enrolado.
Puede mencionarse a modo de ejemplo, algunos datos requeridos como peso, PA y anlisis de orina. Se
informa regularmente la evaluacin de la respuesta al tratamiento segn el estndar de atencin. Se deber
monitoriar los siguientes tems en forma contina y, en cada ciclo, se registran los datos en el eCRF.
EAs, eventos adversos.
EAs de inters especial
Medicacin y terapia concomitante
Final del tratamiento
El final del tratamiento, con el componente A, el cual puede aplicarse cualquier otro medicamento en fase de
evaluacin, finalizar cuando se presente alguno de los siguientes:
Se diagnostique progresin de la enfermedad
Se presente toxicidad inaceptable en opinin del investigador o del paciente
El paciente abandone el estudio prematuramente
Se llegue al final del estudio.
Si el paciente suspendiera el medicamento en fase de evaluacin debido a toxicidad inaceptable o por
cualquier otro motivo antes de la progresin de la enfermedad, pero continuara con quimioterapia, ingresar a
la fase de seguimiento.
Confidencialidad de los registros
Cada uno de los datos que se obtienen sobre los pacientes durante la realizacin del protocolo son
confidenciales. Por ejemplo, la informacin recabada en el formulario de informacin y autorizacin para la
recoleccin de datos de la pareja embarazada es confidencial dentro de los lmites permitidos por la ley
vigente en la Repblica Argentina de Proteccin de Datos personales N 25326. Si bien los datos no sern
revelados, las autoridades sanitarias, ANMAT y el Comit Independiente de tica para ensayos en
Farmacologa Clnica, pueden examinar estos datos para asegurar que el estudio sea realizado
apropiadamente.
Regulacin para OGM
Cuando de organismos transgnicos (OGM) se trata, en Argentina se requiere de su evaluacin satisfactoria
por distintas entidades pblicas:
la CONABIA (Comisin Nacional de Biotecnologa Agropecuaria) evala la inocuidad del OGM para el
medio ambiente;
el SENASA (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria) evala su inocuidad alimentaria,
la DNMA (Direccin Nacional de Mercados Agroalimentarios), evala el impacto que la comercializacin
del OGM en estudio tendr sobre los mercados internos y externos.
Adems, si el producto ser usado como medicamento, tambin debe evaluarse mediante ensayos clnicos en
el marco de la ANMAT, como se mencion previamente.
De esta forma se garantiza que el producto llegue a la poblacin de una manera correcta y aprovechable.
Regulacin de biosimilares en la Argentina

En este momento muchas patentes sobre protenas recombinantes y otros productos biotecnolgicos han
expirado o estn prximos a hacerlo. En estas condiciones legales surgen productos no innovadores o
biosimilares, es decir, se pretenden generar productos similares a los innovadores de referencia. Los
biosimilares intentan tener el mismo mecanismo de accin y buscan ser utilizados para la misma indicacin
teraputica del biofrmaco original. Es crtico considerar que, la produccin de protenas recombinantes no es
idntica en un sistema de expresin diferente, an si el mismo est enteramente emparentado. Las normas y
regulaciones sujetas a aprobacin los productos no innovadores deberan construirse sobre la base de una
consciencia sobre las potenciales diferencias entre ambos productos biotecnolgicos.
Existen numerosas razones por las cuales un biosimilar no puede ser aprobado sin determinar su similaridad,
rigurosidad y calidad. Un biosimilar no puede ser considerado biogenrico, en analoga con los productos de
sntesis qumica. Estas razones se enuncian a continuacin.
Existe una gran dificultad o una imposibilidad en la generacin de una protena como rplica de otra en
condiciones similares pero no idnticas. De hecho dentro de un mismo lote, es posible que se encuentren
muestras que difieran de otras. No es posible, en condiciones de semejanza garantizar la identidad en la
estructura qumica, la estabilidad, farmacocintica, la farmacodinmica, la biodisponibilidad y
bioequivalencia, debido al gran tamao molecular de las protenas y al proceso de manufactura.
Los mtodos tradicionales de anlisis qumico no son suficientes para determinar la similitud en la identidad
de las protenas. Las alteraciones que pueden sufrir son diversas, por ejemplo, alteraciones en los enlaces no
covalentes, en los enlaces no covalentes: hidrlisis, deaminacin, formacin de iminas, racemizacin (formas
tridimensionales diferentes) mediante una oxidacin, intercambio de bisulfitos, isomerizacin (diferentes
posiciones en le espacio) y fotodescomposicin.
Secuencia de aminocidos, glicosilacin, pureza, excipientes, estabilidad, dosis y vias de administracin,
intervalos de dosis, sistema inmune del husped y el almacenaje.
La potencial inmunogenicidad no evaluada en los productos no innovadores
Las modificaciones en el producto no innovador que lo diferencian del producto innovador de referencia
pueden conducir a consecuencias graves en la accin teraputica del mismo, la principal desventaja que
presentan los biosimilares es su potencial efecto inmunognico, el cual debera ser evaluado mediante ensayos
en humanos. El efecto inmunognico implica la formacin de anticuerpos dirigidos contra el mismo producto
biolgico o protenas propias del paciente.
La ruta de administracin, tambin puede provocar inmunogenicidad. La va intravenosa produce menos
inmunogenicidad que la ruta intramuscular o subcutnea. Tambin la calidad del producto puede dispara la
generacin de anticuerpos. Se report inmunogenicidad en un producto por presentar grumos, mientras que el
producto soluble, no. La inmunogenicidad, tambin est asociada al estado de salud del paciente.
La principal implicancia en la inmunogenicidad es la incapacidad de determinarla sin investigacin clnica,
por lo cual no puede rpidamente aprobarse el biosimilar, de esta manera se requiere disponer del recurso
econmico para llevar a cabo dichos estudios en humanos.
Posicin de la Argentina frente a la regulacin de los productos biosimilares.
El 25 de junio de 1999, la ANMAT promulg la Disposicin 3185/99, tomando parcialmente en consideracin
las recomendaciones de WHO-96 y contemplando comenzar con un listado de drogas crticas seleccionadas
por prioridades.
El producto de referencia natural es el innovador y, en su efecto, el establecido por la autoridad sanitaria. La
ANMAT disiente en algunos de los criterios armonizados (WHO-96), como por ejemplo, el hecho de que se
exonera de estudios de bioequivalencia in vivo, a todos los productos orales bajo la forma de comprimidos y
cpsulas de liberacin simple, consideradas "sin riesgo sanitario significativo". Asimismo, a todos los
productos de aplicacin tpica (tica, oftlmica, nasal, dermatolgica, inhalaciones / aerosoles nasales)
cuando tengan esencialmente los mismos excipientes que el producto de referencia, pero definiendo que dos
excipientes son esencialmente los mismos, si cumplen la misma funcin en la formulacin del producto
(dispersante, agregante, espesante), 'aunque no tengan la misma molcula'.
Regulacin de los biosimilares por los organismos Internacionales
En la actualidad, no todos los pases de Latinoamrica tienen legislaciones robustas sobre la regulacin de los
biosimilares o quiz como Argentina solo comparten parcialmente con criterios establecidos. Por ello, es de
suma importancia, tomar como referente a aquellos pases que se han adelantado en la redaccin de normas y
se encuentran en mayor medida consolidados en esta dinmica. La FDA; la EMEA, European Mediacal
Agency; la OPS/OMS, Organizacin Panamericana de la Salud en conjuncin con la Organizacin Mundial
de Salud y FIFARMA, Federacin Latinoamericana de la Industria Farmacutica, son aquellas organizaciones
que han desarrollado su propio sistema de legislacin.

FIFARMA ha dado a conocer su posicin acerca del modo de aprobacin de los productos no innovadores, los
biosimilares. Su posicin es conciente y responsable, ya que considera con gran claridad las condiciones de
regularizacin en Amrica Latina. Su posicin fue especificada en el Documento Oficial de posicin de la
Federacin Latinoamericana de la Industria Farmacutica (FIFARMA), en marzo del 2006. Se menciona en
dicho documento, que no promueven la aprobacin de los biosimilares del mismo modo a como se realiza con
los genricos para medicamentos de sntesis qumica. Se requieren estudios clnicos para establecer la eficacia
y seguridad de los productos farmacuticos biolgicos, incluso si afirman igualdad en composicin,
manufactura y control. Expone, adems, que la ausencia de un sistema de farmacovigilancia en la mayora de
los pases de Latinoamrica es una razn ms para evitar incorporar al mercado los mencionados productos,
ya que, los mismos no sern estudiados en el tiempo posterior a su comercializacin. No obstante, esta
situacin no es la que se presenta en nuestro pas. La farmacovigilancia es llevada a cabo por el ANMAT y los
laboratorios de alto prestigio incluyen sistemas de farmacovigilancia propios, como es el caso de Roche.
Criterios propuestos por la OPS
La OPS ha propuesto una serie de criterios cientficos para la determinacin de la bioquivalencia, de acuerdo
a "Multisource (generic) pharmaceutical products: Guidelines on registration requirements to establish
interchangeability", WHO Technical Report Series, N 863, 1996 (WHO-96). Asimismo, la OPS realiz una
Reunin de Consulta de Expertos en Bioequivalencia de Productos Farmacuticos en Caracas, 13-15 de enero
de 1999 (REBQ-Caracas 99) con el objetivo de orientar la implementacin de normativas de bioequivalencia
armonizadas en nuestros pases y patrocin la 2 Conferencia Panamericana sobre Armonizacin de la
Reglamentacin Farmacutica, que tom las conclusiones y recomendaciones de la REBQ-Caracas 99.
A nivel mundial han sido estandarizadas metodologas clnicas, bioanalticas y estadsticas usuales de estos
estudios. Para el anlisis del nivel seguridad en un estudio de bioequivalencia, los voluntarios saludables son
expuestos en dosis nicas seguidas de un perodo de lavado entre ellas (caso general) o regmenes mltiples
con el mnimo de dosificaciones que sea posible, a una droga que no hubiese sido aprobada por las
Autoridades Regulatorias para ser usada en humanos. Adems, se explicita la necesidad de estudios
bioanalticos, que requiere la recoleccin de muestras de sangre u orina; la infraestructura humana necesaria,
es decir, los investigadores y el resto del personal que compone un esquema de trabajo para el protocolo.
Estos estudios deben ser efectuados de acuerdo con las Buenas Prcticas Clnicas. Adems, se menciona el
requerimiento de infraestructura material para el componente bioanaltico, el cual debe cumplir las GMP para
asegurar la valides de los estudios realizados. Por otra parte, se menciona la necesidad de infraestructura
material para el componente estadstico, el cual consiste en los materiales requeridos para la evaluacin
estadstica de los datos recolectados. Finalmente, se menciona acerca de los procedimientos de inspeccin y
de auditora, los cuales controlan el cumplimiento de los protocolos, la seleccin de los sujetos, la verificacin
del cumplimiento del diseo cruzado (u otro) previsto en el protocolo y de la administracin de los productos
de acuerdo a los lotes seleccionados para el estudio, la recoleccin, manipulacin y almacenamiento de las
muestras biolgicas y la validacin de los mtodos analticos y los procedimientos.