El interfern-gamma (IFN-) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) son

necesarias en las primeras etapas de induccin de clulas CD4 y CD8 T

citotxicos por Mycobacterium leprae protena de choque trmico (hsp) 65
kD
M Del , C Sasiain , S De La Barrera , S Fink , M Finiasz , M Alemn , MH Faria , *
G Pizzariello , * y R Valdez

Este artculo ha sido citado por otros artculos en PMC.

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ABSTRACTO
Las clulas T citotxicas (CTL) pueden jugar un papel importante en la defensa del
husped contra las infecciones micobacterianas. CD4 CTL son preferentemente
inducida por micobacterias, pero ambos CD4 y CD8 CTL puede ser componentes
necesarios de una respuesta inmune protectora. La protena de choque trmico
mycobacterium 65 kD (hsp65) es un pobre inductor de CTL en lepra multibacilar
(MB) de los pacientes. En este estudio se evala la posible papel de las citocinas
en la modulacin de la actividad citotxica de CTL de pacientes con lepra y de los
individuos normales (N) contra macrfagos autlogos que presentan
Mycobacterium leprae hsp65. Nuestros resultados muestran que los CTL
especficos-hsp65 se genera a partir de ambos linfocitos CD4 y CD8. En N,
citoquinas individuales, as como la combinacin de ellos fueron capaces de
modificar la actividad citotxica inducida hsp65. El efecto de las citoquinas en los
linfocitos de los pacientes de lepra era diferente en (PB) de los pacientes
paucibacilares MB y. Por lo tanto, IL-6, IL-2, IFN- o TNF- no modificaron la
generacin de hsp65-CTL de cualquiera de MB (con o sin un episodio eritema
nudoso (ENL)) o PB. En todos los pacientes se requiere la adicin simultnea de
dos citoquinas con el fin de aumentar la generacin de CTL. En MB, IL-6 ms IFN o IL-2 aumentado tanto CD4 y CD8 CTL, mientras que TNF- ms IFN- hasta
reguladas slo CD4 CTL. En PB, CD8 CTL eran prominentes con IL-6 ms IFN-,
mientras que el aumento fue significativo en CD4 CTL con IL-6 ms IL-2. Downregulacin de CTL se observ mediante la adicin de IL-4, IL-10, anti-IFN- o antiTNF- en los controles N. Nuestros datos demuestran que el IFN- y TNF- deben
estar presentes durante al menos la primera 60 h de la etapa de induccin a fin de
generar CTL hsp65 completa. Por lo tanto, IFN- y TNF- seran factores clave en
la generacin de CTL hsp65.

Palabras clave: hsp65- M. leprae , CTL, interfern-gamma, factor de necrosis

tumoral-alfa
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INTRODUCCIN
Parsitos intracelulares como Mycobacterium leprae o M. tuberculosis son
bacterias patgenas que residen y se replican dentro de los macrfagos. La lepra
lepromatosa se caracteriza por una clula T especfica no respuesta a la M. leprae
[ 1 ]. Varios antgenos implicados en la respuesta inmune hacia M. leprae han sido
identificados. Anlisis de las respuestas de clulas T de sujetos expuestos a M.
leprae han indicado que hsp de 10 kD, 18 kD, 65 kD y 71 kD, as como el complejo
antgeno 85, son importantes antgenos de clulas T [ 2 - 4 ]. Sin embargo, la
contribucin de estas respuestas de clulas T especficas de antgeno a la
proteccin o inmunopatognesis de la lepra sigue siendo poco clara.

Mycobacterium leprae citotxico especfico de la actividad de clulas T se ha

identificado en pacientes de lepra [ 5 - 7 ]. Las clulas T citotxicas pueden ser
beneficiosos para el husped mediante la eliminacin de M. leprae dentro de las
clulas de Schwann y los macrfagos, pero al mismo tiempo que participan en
algunas de las respuestas adversas observadas en pacientes de lepra. Es bien
conocido que la actividad citotxica de clulas T puede ser regulada por citoquinas
[ 8 , 9 ]. Tipo 1 y Tipo 2 citoquinas normalmente funcionan de manera equilibrada,
pero la exposicin a diversos agentes patgenos pueden dar lugar a un
subconjunto de ser dominante, como se ha sugerido en algunas enfermedades
infecciosas, como la lepra [ 10 ]. En particular, las citoquinas son capaces de
modular M. leprae citotoxicidad inducida de clulas T que lleva tanto el fenotipo
CD4 y CD8 [ 8 ].

Hemos demostrado previamente [ 11 ] que hsp de M. leprae y M. tuberculosis

podra inducir a las clulas T citotxicas en paucibacilar (PB) de los pacientes e
individuos normales (N). Se observ falta de actividad citotxica inducida hsp65-in
(MB) de los pacientes multibacilares y slo los pacientes sometidos a un MB
eritema nudoso leproso (ENL) Episodio desarroll-hsp65 especficos de las clulas
efectoras (HSP-CTL) [ 11 ]. En el presente estudio analizamos si hsp65 induce
citotxicos clulas CD4 y CD8 T efectoras de una manera diferencial a travs del
espectro de la lepra y si la falta de CTL observada en pacientes MB puede ser
debido a un equilibrio con impedimentos de tipo 1 y tipo 2 citoquinas. Nuestros
resultados muestran que hsp65 induce tanto CD4 y CD8 CTL en todo el espectro
de la lepra, y que el IFN- y TNF- juegan un papel clave durante la activacin
CTL hsp65.

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PACIENTES Y MTODOS

Pacientes

Veinticinco pacientes con lepra, diagnostican sobre la base de criterios clnicos y

bacteriolgicos y clasificados de acuerdo con Ridley y Jopling [ 12 ], se estudiaron:
17 lepromatosa (LL), dos lepromatosa borderline (BL), cuatro tuberculoide (TT) y
dos borderline tuberculoide (BT) de los pacientes. Se dividieron en dos grupos: PB
(TT y BT) (tres mujeres, tres hombres; 18 a 70 aos) y MB (LL y BL) (10 mujeres y
nueve hombres; 20 a 68 aos) de los pacientes. Todos los pacientes incluidos en
este estudio estaban libres de otras enfermedades infecciosas y estaban
recibiendo terapia de mltiples frmacos (MDT) de acuerdo con las
recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud. Los pacientes
sometidos a una LL ENL (MB-ENL) estaban recibiendo la talidomida. La mayora
de los pacientes procedan o residan en las zonas endmicas en el momento del
estudio.

Diecisis bacilo de Calmette-Gurin (BCG) -vaccinated N (10 mujeres y seis

hombres; 30 a 55 aos) fueron estudiados simultneamente.

Las clulas mononucleares

La sangre heparinizada se recogi y las clulas mononucleares de sangre

perifrica (PBMC) se aislaron mediante gradiente de Ficoll-Hypaque centrifugacin
[ 13 ]. Las clulas se recogieron de la interfase y se resuspendieron en RPMI 1640
medio de cultivo tisular (G ibco Labs, Grand Island, NY) que contena gentamicina
85 mg / ml y 15% de suero inactivado por calor de ternera fetal (FCS; G ibco )
(medio completo).

Las clulas efectoras para ensayos de citotoxicidad

PBMC (2 10 6 clulas / ml) se cultivaron en tubos Falcon 2063 a 37 C en un

5% humidificado CO 2 atmsfera, en medio completo con o sin la protena
recombinante de 65 kD de M. leprae (hsp65) (lote ML65-6; la concentracin de
endotoxinas es 1,65 10 3 U / mg de protena de acuerdo con Limulus ensayo de
lisado de amebocitos; amablemente proporcionados por el Dr. M. Singh, GBF,
Braunschweig, Alemania, a travs del PNUD / Banco Mundial / OMS) en presencia
o ausencia de (i) IL-6 20 U / ml, (ii) IFN- 100 U / ml, (iii) la IL-2 50 U / ml, (iv) TNF 10 g / ml, (v) IL-10 10 o 20 ng / ml, (vi) IL-4 10 o 20 g / ml, o (vii) combinaciones

de IL-6 ms IFN-, IL-6 ms IL-2 o TNF- ms IFN- (con o sin IL-4 o IL-10). Con
el fin de evaluar el papel de IFN- y TNF- en la generacin de clulas efectoras
citotxicas inducida hsp65-, se aadieron diferentes concentraciones de
neutralizacin de anti-IFN- o anti-TNF- a los cultivos de PBMC. Todas las
citoquinas empleados en este trabajo se adquirieron de Genzyme (Cambridge,
MA) y eran protenas recombinantes. Anti-humano se adquiri IFN- AcMo (ratn
tipo de clase IgG2a) de Genzyme y policlonal de conejo anti-TNF- humano de
Sigma (St Louis, MO). (Bioactividad: una concentracin de anticuerpo de 0,4 mg /
ml neutraliza 50% de la citotoxicidad de 1 U-R humano de TNF-.) En el da 7, el
tratamiento y control de las clulas se lavaron tres veces con RPMI 1640, se
resuspendieron en medio completo ( 2 10 6 clulas / ml) y probado para la
actividad citotxica.

Aislamiento de CD4 y CD8 empobrecido clulas efectoras

Despus de 7 das de cultivo, las PBMC se agota de linfocitos que portan el

antgeno CD4 o CD8 por tratamiento de las clulas efectoras inducidas por hsp65
o de control (estimulado o no con linfocinas) con anti-CD4 o perlas magnticas
anti-CD8 AcMo conjugados (Dynal Inc , Oslo, Noruega). Brevemente, 2-4 10 6
clulas mononucleares, se resuspendieron en 100 l de PBS que contena 2% de
FCS, se mezclaron con 75 l de anti-CD4 o 40 l de anti-CD8 perlas conjugadas
(anti-CD4 y anti-CD8 Dynabeads eran suministrado como una suspensin de 1,4
10 8 cuentas / ml) y se incubaron durante 45 min a 2-4 C. Entonces, PBS-FCS
se aadi a un volumen final de 5 ml y las suspensiones de clulas se colocaron
en un concentrador de partculas magnticas durante 3 min para recoger las
clulas en roseta y las perlas no unidas. Se recogieron las clulas CD4empobrecido (CD8) y empobrecido en CD8 (CD4), se lavaron tres veces, despus
se resuspendieron con medio completo y se ensayaron para determinar su
actividad citotxica. La pureza de las poblaciones CD4 o CD8 fue verificada por
anlisis de citometra de flujo. Se emplearon MoAbs FITC o conjugados con PE,
especficas para CD3, CD4, CD8, CD16 y CD56 (Becton Dickinson, San Jose,
CA).

Las clulas diana

Los monocitos se dejaron adherir a la parte inferior de placas de 24 pocillos de

fondo plano Falcon por incubacin de PBMC (5 10 6 / ml) durante 2 h a 37 C.
Despus de eliminar las clulas no adherentes, clulas restantes en las placas
(10% de la suspensin celular original) se incubaron a 37 C en un 5% de CO

humidificado 2 ambiente durante 7 das. Para los ensayos citotxicos, en el da 6

de la incubacin, las clulas se pulsaron con hsp65 (10 mg / ml). Los macrfagos
mantenido en las mismas condiciones pero sin la adicin de antgeno se utilizaron
como controles. Las placas se enfriaron durante 2 horas a 4 C para facilitar el
desprendimiento de las clulas adherentes mediante pipeteo vigoroso usando
medio enfriado con hielo. Estas clulas se lavaron y pellets de 5-7 10 5 clulas
se marcaron con 100 Ci de Na 2 51 CrO 4 (NEN, Boston, MA) por incubacin
durante 1 h a 37 C. Luego, las clulas se lavaron tres veces y se resuspendieron
en medio completo a 1 10 5 clulas / ml.

Ensayo de citotoxicidad

Las clulas diana (1 10 4 ) se sembraron en cada pocillo de placas de

microtitulacin de 96 pocillos (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). Se
aadieron clulas efectoras por triplicado en una relacin de efector: clula: (T E)
de 40: objetivo 1 en 0,2 ml de volumen final. Las placas se centrifugaron a 50 g
durante 5 min y se incubaron a 37 C en 5% de CO 2 durante 4 h. Despus de
centrifugacin a 500 g durante 5 min, 100 l de los sobrenadantes se retiraron de
cada pocillo. La radiactividad de los sobrenadantes y pellets se midi en un
contador gamma. Los resultados se expresaron como porcentaje de citotoxicidad:

imagen ecuacin
La liberacin espontnea es la radiactividad liberada por las clulas diana
incubadas con medio completo solo. Se vari de 8% a 20%.

En todos los casos, los ensayos de citotoxicidad realizados con PBMC cultivadas
en ausencia de hsp65 o con los macrfagos no pulsadas con antgeno (datos no
mostrados) rindi una citotoxicidad insignificante (0-6%), incluso si citocinas se
incluyen en las culturas (2-7 %). Ratn inmunoglobulina IgG2a (Becton Dickinson)
se utiliz como control de isotipo para anti-IFN- en el ensayo de citotoxicidad, se
observ ni la inhibicin ni la mejora de los valores citotxicos de hsp65. La
citotoxicidad contra los macrfagos no hsp65-pulsados se restar de los valores
experimentales determin usando objetivos-hsp65 pulsada.

PBMC se incubaron durante 7 das con lipopolisacrido (LPS; Escherichia coli 011:
B4, Sigma), a la misma concentracin como endotoxina est presente la
contaminacin de la preparacin de hsp65, resulte insignificante (1-2%)
citotoxicidad contra macrfagos-hsp65 pulsada. Para los experimentos de

bloqueo, 5 l de anti-pura clase I (Immunotech, Marsella, Francia) o anti-clase II

(anti-DR; Becton Dickinson) se aadieron MoAbs a las clulas efectoras, o antiCD56 (Caltag, San Francisco, CA) que se aade a las clulas diana. Tambin se
realizaron reacciones con controles de isotipo, y estos anticuerpos no modificaron
la actividad citotxica. Posteriormente se aadieron clulas efectoras en una
proporcin E: T de clulas 40: 1. Las clulas de pacientes PB no pudieron ser
probados en este tipo de experimento.

Actividad asesina natural

CMSP, frescos o cultivadas durante 7 das, obtenido de pacientes MB y controles

N se emplearon como clulas efectoras con el fin de poner a prueba su natural
killer (NK) actividad citotxica. 51 marcadas con Cr clulas diana K562 (1 10 5
clulas / ml) se mezclaron con las clulas efectoras (1 10 6 clulas / ml) en un
volumen total de 0,20 ml en cada pocillo de placas de microtitulacin de 96
pocillos (Falcon) en una relacin de clula efectora de 40: 1. Las placas se
centrifugaron (200 g ) durante 1 min y se incubaron a 37 C durante 4 h en un CO
2 incubadora. A continuacin, se centrifugaron a 500 g durante 5 min, se retiraron
y se contaron para la radioactividad 100 l de sobrenadante. Los resultados se
expresaron como porcentaje de citotoxicidad:

imagen ecuacin
La liberacin espontnea de las clulas diana K562 no super el 10%.

El anlisis estadstico

Las comparaciones de los pacientes MB y PB y controles normales se realizaron

utilizando de Student t -test. Valores de citotoxicidad obtenidos de los diferentes
subconjuntos de clulas efectoras de cada individuo se compararon mediante el
Wilcoxon pares firmado rank test.

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RESULTADOS
Hsp65 CTL levant de CD4 y las clulas T CD8

Con el fin de evaluar si podra inducir hsp65 CD4 o CD8 CTL, las clulas efectoras
inducidas por hsp65-se agotaron de clulas T que llevan el fenotipo CD8 o CD4
antes de realizar el ensayo citotxico. Despus de cultivar PBMC durante 7 das
con hsp65, 3-10% de las clulas eran CD3 - CD56 + CD16 + . La pureza de la
poblacin CD4 fue: clulas CD4 80-94% CD4 + y 3-7% CD8 + ; Clulas CD8 7785% CD8 + y 5-9% CD4 + . Para analizar la contribucin de CD4 y CD8 a la
actividad citotxica (CTL CD4 y CD8 CTL), valores <10% de citotoxicidad se
consideraron como negativos. Este valor de corte resulta de restar 2 sd al nivel
ms bajo de N citotoxicidad. Como se muestra en la Tabla 1 , slo CD4 CTL se
generaron en dos (NOS 2 y 9) de los cinco pacientes MB que respondieron a
hsp65, dando lugar a CTL, mientras que en los tres pacientes restantes CD4 y
CD8 CTL se generaron igualmente en pacientes 7 y 12, y un paciente (no. 8)
genera slo CD8 CTL. En MB-ENL, hsp65 no hizo ninguna diferencia entre CD4 o
CD8 respuestas citotxicas. PB pacientes desarrollaron un CD8 mayor que la
respuesta CTL CD4, mientras que por el contrario, los controles de N presentaron
mayor actividad de CD4 CD8 CTL. El desarrollo de CD4 y CD8 CTL por hsp65 se
confirm mediante la adicin de anti-clase I, anti-clase II o anti-CD56 durante la
fase efectora de el ensayo de citotoxicidad (datos no mostrados). En tres N
controles, anti-clase I, se aadieron anti-clase II y anti-CD3 juntos. Como
resultado, ninguna actividad citotxica podra ser detectada en cualquiera de los
casos (datos no mostrados)

Tabla 1
Tabla 1
La citotoxicidad inducida por Hsp65-de subconjuntos de clulas T CD4 y CD8
Efecto de la IL-6, IFN-, IL-2 y TNF- en la actividad citotxica inducida hsp65-

Para analizar la capacidad de las citoquinas para modular la generacin de

citotoxicidad inducida hsp65-, las PBMC se estimularon con hsp65 en presencia
de cualquiera de IL-6, IL-2, IFN- o TNF-.

Como se muestra en la Tabla 2 , ninguno de estas citoquinas fue capaz de

aumentar la actividad citotxica inducida hsp65 en pacientes MB y MB-ENL. En
los pacientes PB, IL-6 e IFN- inducidos slo un ligero aumento, mientras que en
N controla esta actividad citotxica fue significativamente mayor de las cuatro
citocinas. Por otro lado, las tres combinaciones de citoquinas probadas mejora de
forma significativa la respuesta CTL de pacientes de lepra y N ( Tabla 2 ).

Tabla 2
Tabla 2
Efecto de las citoquinas sobre la citotoxicidad inducida por hsp65Por lo tanto, examin si esta modulacin se ejerce sobre todas las clulas
efectoras o en cualquiera de las clulas CD4 o CD8. Como se muestra en la Tabla
3 , IL-6 e IFN- aadido juntos mejorado significativamente la actividad ltica de
ambas clulas efectoras CD4 y CD8 en los cuatro grupos estudiados. La
combinacin de IL-6 y IL-2 tambin fue capaz de mejorar tanto CD4 y CD8
actividad citotxica en MB, MB-ENL y N, mientras que este efecto positivo slo se
ejerce sobre las clulas CD4 en pacientes PB. Citotoxicidad mediada por CD4 se
increment ms que la actividad mediada por CD8 en N por la adicin de IL-6 ms
IFN- o IL-2 ( P <0,05), mientras que en los pacientes PB se observ un mayor
incremento en la actividad citoltica CD8 cuando IL -6 + IFN- se emplearon
simultneamente ( P <0,05).

Tabla 3
Tabla 3
Efecto de las citoquinas en las clulas efectoras inducidas por hsp65-CD4 y CD8
La adicin de TNF- junto con IFN- aumento de clulas CD4 efectoras de CTL en
MB-ENL (MB-ENL: CD4 frente a CD8 = P <0,05), y la misma tendencia se observ
en MB. Slo en pacientes PB fue la actividad citoltica modificados. Se observ
una mejora tanto de CD4 y CD8 CTL en los controles N por esta combinacin de
citoquinas.

La actividad NK inducida por la hsp65 y citoquinas

Con el fin de determinar si las diferencias observadas en la citotoxicidad inducida

por hsp65-MB entre los pacientes y los controles de N podran ser debido a la
actividad NK, los ensayos se realizaron utilizando el objetivo clsica NK, K562.
Como se muestra en la Tabla 4 , los pacientes MB desarrollaron menor
citotoxicidad NK que los controles de N cuando se emplearon las CMSP. Despus
de 7 das de cultivo, las clulas de control disminuyeron su actividad NK, pero se
podra mejorar mediante la adicin de citoquinas. En la presencia de hsp65 y
citoquinas se observ una actividad NK mayor con respecto a las clulas no
estimuladas en MB, as como controles de N, pero no se observaron diferencias
significativas entre ambos grupos.

Tabla 4
Tabla 4
Asesinas naturales (NK) la actividad citotxica de las clulas mononucleares de
sangre perifrica frescos y 7 das cultivadas (PBMC)
IL-4 e IL-10 regulan por disminucin la citotoxicidad inducida por hsp65-

La capacidad de IL-4 e IL-10 para ejercer un efecto inhibidor sobre las respuestas
mediadas por clulas T [ 14 , 15 ] y la expresin preferencial de IL-4 e IL-10 ARNm
en las lesiones de pacientes LL [ 10 ] han sido bien documentado. Con el fin de
determinar si estas dos citoquinas tambin inhiben la generacin de actividad CTL
inducida hsp65-, se aadieron IL-4 o IL-10 durante la estimulacin de PBMC con
hsp65. Los estudios se llevaron a cabo en los controles normales debido a la baja
actividad citotxica contra hsp65 observado en pacientes MB. Tanto la IL-4 (20 mg
/ ml) e IL-10 (20 ng / ml) abrogada la actividad CTL hsp65 ( Fig. 1 ). Sin embargo,
cuando se aadieron IL-6 ms IL-2 o IFN-, o TNF- plus-IFN junto con IL-4 o IL10 a cultivos de PBMC, el efecto inhibidor de IL-4 o IL-10 se superado
parcialmente.

Fig. 1
Fig. 1
Clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMC) a partir de cinco controles
normales (N) se cultivaron con hsp65 o hsp65 con IL-6 ms IFN-, IL-6 ms IL-2 o
TNF- ms IFN- en presencia o ausencia de IL-4 o IL-10 durante 7 das.
Entonces ...
Por otro lado, la adicin de IL-10 a 10 ng / ml a los cultivos de PBMC de pacientes
MB y MB-ENL fue suficiente para abrogar la actividad CTL (citotoxicidad (%), MB,
n = 3: hsp65 CTL = 9 1, (hsp65 + IL-10) CTL = 3 1; MB-ENL, n = 2: hsp65 CTL
= 17-14, (hsp65 + IL-10) CTL = 2-0), mientras que en esta concentracin de N IL10 slo produjo una inhibicin parcial de la citotoxicidad (CTL hsp65 = 35 3, (CTL
hsp65 + IL-10) = 16 5).

IFN- y TNF- son necesarias para desarrollar la actividad de CTL inducida por la
hsp65-

Teniendo en cuenta el papel clave de IFN- y TNF- en la proteccin contra las

infecciones micobacterianas, se analiz el efecto de anti-IFN- y anti-TNF- en la

generacin de clulas efectoras inducidas por hsp65. PBMC de controles

normales se utilizaron para este conjunto de experimentos.

Como se muestra en la Fig. 2 , la neutralizacin de IFN- o TNF- produjo una

marcada inhibicin de la citotoxicidad inducida por hsp65. Adems, la inhibicin de
CTL no poda ser revertida por la adicin de citoquinas exgenas cuando anti-IFN o anti-TNF- estaban presentes al inicio de la estimulacin antignica.

Fig. 2
Fig. 2
Clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMC) a partir de cinco controles
normales (N) se cultivaron con hsp65 o hsp65 con IL-6 ms IFN-, IL-6 ms IL-2 o
TNF- ms IFN- en presencia o ausencia de anti-IFN- (0,4 mg / ml) ...
Con el fin de analizar si se requera la presencia de la produccin endgena de
TNF- o IFN- durante los 7 das de cultivo, se aadieron los anticuerpos en
diferentes puntos de tiempo de la etapa de induccin y se mantuvieron en el medio
de cultivo hasta el final de CTL generacin. Como se muestra en la Fig. 3 , ya sea
TNF- o IFN- eran necesarias durante la primera 48 h de la induccin de CTL,
pero para la activacin completa de IFN- y TNF- tenan que estar presentes
durante al menos 60 h. El efecto inhibidor observado con anti-TNF- o anti-IFN-
era dependiente de la dosis (datos no mostrados). Adems, se observ una
abrogacin de la citotoxicidad inducida por hsp65-upon adicin simultnea de
ambos anticuerpos neutralizantes durante la primera 24 h. Un efecto inhibidor
parcial se observ hasta 60 h despus del comienzo del cultivo. Estos resultados
sugieren que tanto TNF- e IFN- juegan un papel clave en la generacin de CTL
hsp65.

Fig. 3
Fig. 3
Clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMC) a partir de seis controles
normales (N) se cultivaron durante 7 das con hsp65 (), hsp65 y anti-IFN- (0,2
mg / ml) (), anti-TNF- (15 / ) () o ambos anticuerpos (). ...
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DISCUSIN
Varios estudios han sugerido que CTL podra desempear un papel importante en
la respuesta inmune a infecciones micobacterianas tales como la lepra y la

tuberculosis (TB) [ 5 , 7 , 16 ]. En un trabajo previo hemos demostrado que M.

leprae hsp65 podra inducir clulas T efectoras citotxicas a partir de PBMC de los
pacientes PB y los controles normales; en pacientes MB se encontr una marcada
deficiencia en el desarrollo de la actividad CTL-hsp65 especfica [ 10 ]. La protena
65-kD es uno de los antgenos de micobacterias hsp ms ampliamente estudiados
[ 17 , 18 ]. Clulas T, as como clones de clulas T reactivas contra la hsp65
micobacteriana se han identificado [ 19 ]. La respuesta inmune humana a este
antgeno parece estar dirigida principalmente contra eptopos antignicos de
reaccin cruzada, ya que estn ampliamente distribuidos entre muchas especies
de micobacterias [ 20 ].

Aunque micobacterias inducen preferentemente CD4 CTL [ 16 , 21 ], que [ 8 ], as

como otros [ 5 ] han demostrado que tanto CD4 y las clulas efectoras citotxicas
CD8 se pueden generar a partir de PBMC. Un papel importante ha sugerido
recientemente para las clulas de clase I restringido T CD8 en la tuberculosis
[ 22 ]. Sin embargo, cmo estas clulas contribuyen al control de la infeccin
micobacteriana todava no se ha dilucidado. Nuestro estudio demostr que hsp65
induce una mayor actividad citoltica CD8 en pacientes PB y ms CD4 CTL en los
controles N. Esto est de acuerdo con nuestros datos anteriores, todo cuando M.
leprae se emplearon como estmulo [ 8 ]. Por otro lado, el comportamiento de MB
y MB-ENL era diferente a la observada en nuestro informe anterior [ 8 ], ya hsp65
no indujo CTL CD4 preferentemente en MB-ENL, y ni CD4 ni CD8 CTL se
generaron en la mayora de MB pacientes. La generacin de CD4 y CD8
respuestas citotxicas por hsp65, en presencia o ausencia de citoquinas, se
confirm mediante el bloqueo de clase I o clase II antgenos durante la fase
efectora (datos no mostrados). Varios informes recientes cuestionan la visin
clsica que los antgenos citoplasmticos requieren necesariamente una ruta de
presentacin de clase I, y soluble antgenos clase II uno [ 23 ]. Antgenos filtrado
de cultivo, as como polipptidos solubles carabina por hsp tambin se pueden
presentar de manera eficiente en un contexto de MHC de clase I [ 23 , 24 ]. Se ha
demostrado que un subconjunto de clulas presentadoras de antgeno (APC)
puede tambin presentan antgenos o protenas exgenos transferidos de
fagosomas al citoplasma en las molculas de clase I. Esta ruta de presentacin
puede ser importante en la iniciacin de una respuesta de CTL contra los
patgenos tales como bacterias intracelulares [ 25 ].

Se ha sugerido que la inmunidad mediada por clulas a las micobacterias est

estrechamente asociado con la induccin de una respuesta Th1. que codifica para
IL-2, IFN-, IL-1, TNF-, factor estimulante de colonias de granulocitos y
macrfagos (GM-CSF) e IL-6 mRNA se encontraron ser ms abundantes en las
lesiones de pacientes TT. En contraste, IL-4 e IL-10 mRNAs aparecieron ms

prominente en LL [ 15 ]; durante las reacciones de ENL, un aumento selectivo en

la expresin de IL-6, IL-8 e IL-10 se encontr [ 26 ]. Por otra parte, los estudios
llevados a cabo en PBMC no mostraron esta claro de corte en el patrn de
citocinas: Th0, Th1 o Th2 patrones se detectaron independientemente del
antgeno utilizado y el tipo clnico de la lepra [ 27 - 29 ].

Tanto CD4 y CD8 hsp65 CTL podran modularse slo por una combinacin de
citoquinas ( Tabla 2 ). Es de sealar que, en presencia de TNF- ms IFN- una
fuerte respuesta CTL CD4 fue generada en MB-ENL ( Tabla 3 ), e IL-6 ms IFN-
hecho CD8 CTL ms prominente en pacientes PB. En nuestro estudio, ninguna
actividad CTL antgeno-independiente se observ en PBMC se incubaron con
citoquinas. Aunque la actividad NK fue generada en PBMC durante el cultivo en
presencia de hsp65 mediante la adicin de citoquinas ( Tabla 4 ), las diferencias
en la respuesta citotxica hsp65 no pueden atribuirse a la actividad NK, ya que en
ambos MB y N controla los niveles de actividad ltica observados en un ensayo
citotxico NK clsica despus de 7 das de cultivo no fueron significativamente
diferentes (excepto en el caso de IL-6 + IFN-), mientras que se observaron
diferencias notables cuando los macrfagos autlogos-hsp65 pulsada eran las
clulas diana de CTL ( Tabla 2 ). Aunque las clulas NK son efectores importantes
de la actividad citotxica como primera lnea de defensa, sino que tambin deben
ser tenidos en cuenta por su papel en la regulacin inmune en virtud de su
produccin de citoquinas [ 30 , 31 ], y que pueden ser el papel que desempean
en nuestro modelo experimental.

La funcin supresora de IL-4 e IL-10 en las respuestas mediadas por clulas T es

bien conocido [ 14 ], y el efecto opuesto de IFN- [ 32 ] ha demostrado que emplea
M. leprae [ 33 - 35 ]. Se observ una inhibicin de la actividad citoltica de PBMC
normales cuando se estimularon con hsp65 en presencia de altas concentraciones
de citocinas de tipo 2 ( Fig. 1 ). Adems, el efecto inhibitorio de la IL-4 o IL-10 fue
parcialmente contrarrestado por la adicin de citoquinas de tipo 1. Uno podra
especular que altas concentraciones de citoquinas de tipo 2, producidos durante la
estimulacin de antgeno, podra regular a la baja no slo la citotoxicidad inducida
por hsp65, sino tambin el efecto potenciador de tipo 1 citoquinas, como se
observa en pacientes MB. Por otro lado, la mayor citotoxicidad hsp65 observado
en MB-ENL podra ser debido a un cambio en el patrn de citocinas observados
durante los episodios de ENL, tales como aumento de los niveles de TNF- o IL-6
[ 26 , 27 ].

IFN- y TNF- desempean un papel importante en el desarrollo de la respuesta

protectora contra M. leprae y M. tuberculosis [ 36 - 38 ]. IFN- aumenta la actividad

microbicida a travs de la liberacin de TNF-, IL-1 e IL-6 [ 39 ], y tambin modula

la IL-12 e IL-10 secrecin de [ 35 , 40 ]. Por otra parte, TNF- aumenta la
expresin de HLA y la induccin de IL-6 de produccin [ 41 ], y parece estar
implicada en la formacin y mantenimiento de granulomas. TNF- junto con IFN-
puede actuar como una seal de autocrina para aumentar la actividad microbicida
de macrfagos [ 42 ]. Sin embargo, el papel de esta monocina en la lepra est
claro; ttulos altos de TNF- se han detectado en la lepra lepromatosa, as como
durante los episodios de ENL [ 6 , 43 ].

Un hallazgo sorprendente de nuestro estudio es que el IFN- y TNF- son

necesarios durante las primeras etapas de la induccin de CTL, y que su
presencia sera obligatorio para la activacin completa de CTL a partir de PBMC.
Cuando IFN- o TNF- se neutralizaron al comienzo de la generacin de CTL, las
citocinas aadidas de forma exgena no modificaron el efecto inhibidor de la
actividad citoltica ( Fig. 2 ). El hecho de que una inhibicin casi total de CTL se
obtuvo mediante la neutralizacin de slo una de las citoquinas, ya sea IFN- o
TNF-, o ambos, en el comienzo de la generacin de CTL a partir de PBMC ( Fig.
3 ) claramente demostrado que tanto TNF- y IFN- acto coordinadamente y no de
una manera individual. Estos resultados excluyen la participacin de otras
citocinas en esta primera etapa con el fin de desarrollar una citotoxicidad hsp65
completo. NK y / o clulas podran ser la fuente de TNF- y IFN- en esta
etapa. La falta de estas dos citoquinas no pudo ser compensada por otros que tal
vez actuaran en etapas posteriores de la activacin [ 44 ]. Es bien conocido que
los pacientes tienen una baja MB in vitro la produccin de IFN-, y por otro lado
una elevada in vivo la produccin de TNF- se ha demostrado en MB y MB-ENL
[ 6 , 43 ]. Uno podra esperar de los datos obtenidos con N controla una actividad
citotxica ms alto de clulas MB pacientes que la observada. Por otra parte, IL-4
podra derogar la citotoxicidad inducida por hsp65 en PBMC derivado de N ( Fig. 1
), por lo que en pacientes MB la presencia de IL-4 durante la estimulacin de
antgeno podra regular a la baja la produccin y / o el efecto de TNF- o IFN-,
por lo tanto gravar el desarrollo de una respuesta adecuada de CTL, lo que podra
resultar en un aumento de la carga bacteriana.

Nuestra observacin sobre el papel del TNF- en la generacin de CTL

especficos sera una de las primeras descripciones con M. leprae antgenos. Por
lo tanto, el requisito de IFN- y TNF- podra ser una caracterstica general en
respuesta a infecciones por micobacterias, como ya se ha demostrado para M.
tuberculosis y M. bovis BCG [ 37 , 45 ], lo que sugiere una interaccin entre las
clulas T y los monocitos-macrfagos en lugar de subconjuntos de clulas T. Una
alteracin del equilibrio en la produccin de citoquinas tendra como resultado en
el fracaso de la activacin de monocitos, incluyendo la secrecin de monocinas, la

presentacin del antgeno y la activacin de linfocitos. El efecto regulador de IFN-

la modulacin de la produccin o la actividad de otras citoquinas tales como IL-12
o IL-10 como se ve en la lepra [ 35 ] puede conducir a ya sea la perpetuacin de la
enfermedad, como en el caso de MB, o mejorado celular mediada por la
inmunidad, como se observa en los pacientes PB. Por lo tanto, la activacin de
monocitos, junto con la lisis de clulas husped que alberga M. leprae sera
beneficioso, pero al mismo tiempo puede conducir a daos en los nervios, como
se ve en los pacientes de PB y 1 de tipo reacciones leprosas. Son necesarios ms
estudios para delinear los mecanismos de activacin de hsp65 CTL en individuos
sanos con el fin de comprender las vas de activacin en pacientes con lepra.

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AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por becas del Programa Especial PNUD / Banco Mundial
/ OMS de Investigaciones y Enseanzas sobre Enfermedades Tropicales (TDR),
del CONICET y la Fundacin Alberto J. Roemmers. Agradecemos Dr Javier Anaya
para la clasificacin histopatolgica y el Dr. Mara Marta de E. de Bracco, y el Dr.
Martin Istriz til para el debate y la revisin del manuscrito.

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