ISSN 0103-9865

Maio, 2010

136

Metodologias para avaliao de

alimentos para ruminantes domsticos

ISSN 0103-9865
Maio, 2010
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Centro de Pesquisa Agroflorestal de Rondnia
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Documentos136

Metodologias para avaliao de

alimentos para ruminantes domsticos

Ana Karina Dias Salman

Angela Cristina Dias Ferreira
Joo Paulo Guimares Soares
Josilane Pinto de Souza

Porto Velho, RO
2010

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:

Embrapa Rondnia
BR 364 km 5,5, Caixa Postal 127, CEP 76815-800, Porto Velho, RO
Telefones: (69) 3901-2510, 3225-9387, Fax: (69) 3222-0409
www.cpafro.embrapa.br
Comit de Publicaes
Presidente: Clberson de Freitas Fernandes
Secretria: Marly de Souza Medeiros
Membros:
Abadio Hermes Vieira
Andr Rostand Ramalho
Luciana Gatto Brito
Michelliny de Matos Bentes-Gama
Vnia Beatriz Vasconcelos de Oliveira

Normalizao: Daniela Maciel

Editorao eletrnica: Marly de Souza Medeiros
Reviso gramatical: Wilma Ins de Frana Arajo

1 edio
1 impresso (2010): 100 exemplares

Todos os direitos reservados.

A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos
direitos autorais (Lei n 9.610).

CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao.
Embrapa Rondnia

Metodologia para avaliao de ruminantes / Ana Karina Dias

Salman ... [et al].-- Porto Velho, RO: Embrapa Rondnia,
2010.
21 p. (Documentos / Embrapa Rondnia, 0103-9865; 136)
1. Cincia e tecnologia de alimentos. 2. Alimentao animal.
3. Bovinos. I. Salman, Ana Karina Dias. II. Ferreira, ngela
Cristina Dias. III. Soares, Joo Paulo Guimares. IV. Souza,
Josilane Pinto de Souza. V. Ttulo. VI. Srie.
CDD (21.ed.) 636.213
Embrapa - 2010

Autores

Ana Karina Dias Salman

Zootecnista, D.Sc. em Zootecnia, pesquisadora da
Embrapa Rondnia, Porto Velho, RO
aksalman@cpafro.embrapa.br
Angela Cristina Dias Ferreira
Zootecnista, D.Sc. em Zootecnia, Professor Adjunto,
Universidade Federal de Sergipe, Aracaju, SE
acrisdias@ufs.br
Joo Paulo Guimares Soares
Zootecnista, D.Sc. em Zootecnia, Embrapa Cerrados, Planaltina, DF
jp.soares@cpac.embrapa.br
Josilane Pinto de Souza
Zootecnista, Mestranda no Programa de Ps-Graduao em
Zootecnia, Universidade Federal do Vale do Jequitinhonha e
Mucuri, Diamantina, MG
josilane@zootecnista.com.br

Sumrio

Introduo .......................................................................................................... 7
Mtodos qumicos ............................................................................................. 9
Mtodo de Weende ........................................................................................... 9
Sistema de nutrientes digestveis totais (NDT) ..................................................... 11
Mtodo de Van Soest ...................................................................................... 12
Determinao de minerais ................................................................................. 12

A tecnologia NIRS (Near Infra Red System) .................................................. 13

Mtodos biolgicos ......................................................................................... 13
Digestibilidade ................................................................................................ 13
Mtodos diretos ........................................................................................ 14
Mtodos indiretos com uso de indicadores ou marcadores ............................... 16
Mtodos indiretos in situ............................................................................. 19

Consideraes finais ....................................................................................... 19

Referncias ...................................................................................................... 20

Metodologias para avaliao de

alimentos para ruminantes
domsticos
Ana Karina Dias Salman
Angela Cristina Dias Ferreira
Joo Paulo Guimares Soares
Josilane Pinto de Souza

Introduo
A principal meta da produo animal produzir alimento para o homem em quantidade,
qualidade e ao menor custo. Porm, com os avanos mdicos-cientficos, as condies de
vida da populao humana melhoram consideravelmente, resultando em crescimento
populacional que superou a capacidade de produo de alimentos e incitou pesquisadores na
busca por solues prticas para aumentar a eficincia dos sistemas de produo animal, com
resultados que sejam simultaneamente favorveis do ponto de vista econmico, social e
ambiental.
Como a alimentao responsvel por uma parcela significativa do custo total de produo, a
procura por alimentos mais eficientes e econmicos para serem utilizados na alimentao
animal constante e, dentre os alimentos para animais domsticos, os proticos so os de
custo mais elevado uma vez que a maioria concorre com a alimentao humana.
O ruminante possui um sistema digestivo composto por cavidades pr-gstricas em que
microrganismos simbiticos permitem o aproveitamento dos nutrientes contidos em alimentos
fibrosos e grosseiros por meio de um processo fermentativo. Por esse motivo, so
considerados animais de grande eficincia digestiva e especializao para obter a energia
necessria para seus processos fisiolgicos e, consequentemente, para produo de produtos
de interesse econmico como carne, leite, couro e l. Diante disso, so imprescindveis os
estudos para avaliao de subprodutos e resduos lignocelulsicos como fontes alternativas a
serem utilizadas na alimentao de ruminantes.
Apesar de o desempenho animal ser dependente de fatores genticos e ambientais, sabe-se
que a eficincia alimentar um fator importante no desenvolvimento dos animais, sobretudo
quando se considera o uso de raes que possibilitam o mximo crescimento. Nesse caso,
deve-se levar em considerao no apenas um nico nutriente presente na rao, mas seu
conjunto, suas interaes, assim como, a ingesto mxima dos mesmos.
Dentre os fatores nutricionais que interferem no desempenho animal, a composio qumicobromatolgica dos ingredientes de uma dieta, o consumo voluntrio, as cinticas de
degradao e a digestibilidade dos nutrientes so os que normalmente so citados como mais
limitantes.
De acordo com os resultados das anlises qumico-bromatolgicas, os alimentos podem ser
classificados da seguinte maneira:

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

Fonte: Andrigueto et al. (1982)

Volumosos: apresentam baixo teor energtico por unidade de volume, ou seja, possuem teor
de fibra bruta (FB) superior a 18% na matria seca (MS) e podem ser divididos em secos e
midos. Os fenos e as palhas so classificados como volumosos secos (Inferiores 10%-12%
umidade), enquanto os capins verdes, as silagens e a cana-de-acar so considerados
volumosos midos (superiores a 10%-12% umidade).
Concentrados: possuem alto teor energtico por unidade de volume, ou seja, com menos de
18% de FB na MS e podem ser classificados como proticos quando apresentam mais de
20% de protena bruta (PB) na MS, como o caso dos farelos de algodo, de soja; ou
energticos quando apresentam menos de 20% de PB na MS como, por exemplo, o milho, o
sorgo, a raiz da mandioca, o farelo de arroz.
Vitaminas: so substncias orgnicas especiais, que atuam frequentemente como coenzimas,
ativando numerosas enzimas importantes para o metabolismo dos seres vivos. So
indispensveis ao bom funcionamento orgnico. Agem em quantidades mnimas e se
distinguem das demais substncias orgnicas porque no so fontes de energia e no
desempenham funo estrutural. Classificam-se da seguinte maneira:
Classificao

Hidrossolveis

Lipossolveis

Vitaminas
B1
B2
B6
PP
B12
H
P
C
A
D
E
K

Nomes
Tiamina
Riboflavina
Piridoxina
Nicotinamida
Cobalaminas
Biotina
Rutina
cido Ascrbico
Retinol
Calciferol
Tocoferol
Filoquinona

Fonte: Andrigueto et al. (1982).

Algumas vitaminas no precisam ser fornecidas via dieta porque so sintetizadas pelo
organismo do animal, como por exemplo, as do complexo B, a K e a C.
Minerais: so compostos inorgnicos com diferentes funes no organismo, considerados
nutrientes essenciais porque no so produzidos pelo organismo e, por isso, devem ser
obtidos por meio da alimentao.
Aditivos: substncia adicionada ao alimento para conservar, intensificar ou modificar suas
propriedades nutritivas sem prejudic-las, como por exemplo, antibiticos, conservantes,
antioxidantes (vitamina E), tampo, corante, flavorizante, ionforo.

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

Portanto, conhecer os alimentos e seu valor na nutrio animal imprescindvel e esta reviso
tem por objetivo reunir as principais metodologias de avaliao nutricional de alimentos para
ruminantes domsticos enfatizando seus princpios e suas limitaes, para que as mesmas
sejam utilizadas de maneira mais consciente por estudantes e tcnicos de laboratrio.

Mtodos qumicos
Mtodo de Weende
Tambm conhecido como mtodo de anlise centesimal ou proximal, foi proposto por Henneberg
em 1894, com base nos resultados de investigaes realizadas na Estao Experimental de
Weende, na Alemanha. Desde ento, esse mtodo vem sendo utilizado para se conhecer a
composio qumica aproximada dos alimentos. As tcnicas ainda so quase as mesmas, com
exceo do nitrognio, que determinado pelo mtodo Kjeldahl (HORWITZ, 2000). De acordo
com esse mtodo, os componentes dos alimentos so divididos em:
Alimento
Matria seca
Matria orgnica
Compostos no nitrogenados

gua
Matria inorgnica
(cinzas)

Compostos nitrogenados
(protenas)

Carboidratos
Extrato etreo
Fibra Extrato no nitrogenado
Fonte: Andrigueto el al. (1982)

Dessa forma, as anlises realizadas no laboratrio so:

Matria seca (MS): Todos os alimentos, qualquer que seja o mtodo de industrializao a que
tenham sido submetidos, contm gua em maior ou menor proporo. A MS toda frao do
alimento excluda a gua ou umidade natural. um dado de extrema importncia,
principalmente quando obtido de alimentos volumosos, que normalmente apresentam umidade
varivel. Assim, por exemplo, uma amostra de milho em gro que tenha 15% de umidade
natural apresenta, por diferena, 85% de MS. O teor de umidade entre alimentos muito
varivel (de 75% para gramneas frescas, por exemplo, at 10% para farelos e fenos). Na MS
que esto contidos os nutrientes (carboidratos, protenas, gorduras, minerais e vitaminas).
Os resultados da anlise qumica so apresentados com base na MS para permitir que
diferentes alimentos sejam comparados quanto as suas caractersticas nutricionais, custo de
nutrientes, etc., no levando em considerao a frao de gua. A composio dos alimentos
em tabelas, o clculo das necessidades dos animais e o consumo de alimentos so expressos
em porcentagem de MS (ANDRIGUETO et al., 1982).
A determinao da MS feita em laboratrio utilizando em torno de 1,0 g de amostra moda,
a qual deve ser seca em estufa de circulao forada de ar temperatura de 100 C-105 C
por 12 horas. No caso dos volumosos midos, a MS deve ser determinada em amostras prsecas em estufa de circulao forada a 55 C-60 C por 72 horas ou at que o peso da
amostra fique constante (ZENEBON et al., 2008).
Outra alternativa para secagem de amostras de tecido vegetal com o uso de forno de
microondas em potncia mdia, ou seja, utilizando-se o nvel cinco ou 50% da capacidade do
microondas e revolvendo amostra em intervalos regulares de 1 minuto, at o momento em
que no h alterao do peso da amostra, em geral, 5 minutos. A utilizao do microondas
reduz o tempo de secagem e a contaminao bacteriana, resultando em melhor aparncia e

10

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

qualidade do produto, sem influenciar na composio qumica do material seco (PASTORINI et

al., 2002). Por outro lado, um mtodo que no permite a secagem de grandes quantidades
de amostras, principalmente quando se trata de alimentos volumosos.
Matria mineral (MM) ou cinzas: A matria mineral (MM) ou cinzas o nome dado ao resduo
obtido por aquecimento da amostra seca em temperatura prxima a 550 C-570 C. Nem
sempre este resduo representa toda a substncia inorgnica presente na amostra, pois alguns
sais podem se perder por volatilizao. Logo, a mesma amostra utilizada para determinao da
MS pode ser levada ao forno mufla por no mnimo 3 horas. Pela diferena entre o valor da MS
e da MM, estima-se o teor de matria orgnica (MO) da amostra (CAMPOS et al., 2004). A
partir das cinzas podem-se determinar os teores de minerais como Clcio e Fsforo a partir da
calcinao e preparo de solues minerais para determinao dos elementos separadamente
por leitura no espectofotmetro de absoro atmica (SILVA; QUEIROZ, 2002).
Fibra bruta (FB): a frao composta por carboidratos estruturais e obtida aps a digesto
cida seguida de digesto bsica. Sua determinao realizada a partir de uma amostra seca
e desengordurada do alimento, aps anlise de extrato etreo, a qual deve ser submetida
digesto com uma soluo cida e depois com uma soluo bsica fraca, seguida de filtragem
em cadinho de Gooch, cujo resduo orgnico resultante queimado em mufla temperatura
de 550 C (CAMPOS et al., 2004). A sua principal limitao est relacionada com o fato de
no separar a celulose da hemicelulose e provocar a perda de parte da lignina (que no
considerada carboidrato) e da hemicelulose. Este mtodo fornece valores baixos devido
utilizao de digesto muito drstica, levando perda de alguns componentes, no sendo
mais adequado para a anlise de alimentos.
Extrato etreo (EE): A determinao do EE feita, na maioria dos casos, pela extrao com
solventes como, por exemplo, o ter em aparelho do tipo Soxhlet, seguida da remoo por
evaporao ou destilao do solvente empregado. O resduo obtido no constitudo
unicamente por lipdios, mas por todos os compostos que, nas condies da determinao,
possam ser extrados pelo solvente. Estes conjuntos incluem os cidos graxos livres, steres
de cidos graxos, as lecitinas, as ceras, os carotenides, a clorofila e outros pigmentos, alm
dos esteris, fosfatdios, vitaminam A e D, leos essenciais, etc. (ZENEBON et al., 2008).
Protena bruta (PB): determinada indiretamente a partir do valor de nitrognio total (N), o qual
determinado por um mtodo que se baseia em trs etapas: digesto, destilao e titulao. A
matria orgnica existente na amostra digerida com cido sulfrico e um catalizador para que o
nitrognio seja transformado em sal amoniacal (sulfato de amnio). A amostra digerida em cido
resfriada, diluda em gua destilada e alcalinizada com hidrxido de sdio em destilador do tipo
Kjeldahl que condensa a amnia desprendida da amostra. A amnia recuperada em uma soluo
de cido brico e titulada com cido clordrico padronizado. Aps determinar o N, o teor de PB
estimado multiplicando-se pelo fator de converso de 6,25, considerando-se que a proporo de N
nas protenas das plantas igual a 16% (CAMPOS et al., 2004)
A principal limitao dessa metodologia no considerar a variao no teor de N das diferentes
protenas e no permitir avaliar a qualidade da protena.
Extrativo no nitrogenado (ENN): Representa teoricamente os carboidratos no estruturais e
de mais fcil digesto, como os acares, o amido e a pectina. obtido subtraindo-se de 100
a soma de PB, FB, EE e MM (expressos em porcentagem de MS), ento: ENN = 100
(PB+FB+EE+MM).
A principal limitao dessa estimativa que ela incorpora todos os erros das anlises
anteriores, principalmente da FB (ANDRIGUETO et al., 1982).

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

As principais crticas ao mtodo de Weende esto relacionadas ao fato das fraes do

alimento no serem compostos quimicamente definidos e sim grupos de compostos qumicos.
Como, por exemplo, a PB que engloba vrios compostos nitrogenados, como a amnia, alm
dos aminocidos. Da mesma forma, o EE no inclui apenas triglicerdeos, mas tambm outros
compostos solveis em ter como ceras e pigmentos sem valor nutricional.
Mas, a principal crtica com relao FB que no separa a hemicelulose da celulose e
considera somente a lignina insolvel em lcali. Parte da lignina passa a fazer parte do ENN, o
que subestima o teor de FB. Por outro lado, no grupo dos ENN encontram-se fraes de
natureza diversa como, pectina, lignina solvel em lcali e os carboidratos solveis em gua
(amilose e frutosana). Nutricionalmente, a FB deveria representar todos os carboidratos de
degradao lenta e que ocupam espao no rmen. Por isto, a fibra excessiva limita a
concentrao energtica da dieta e pode deprimir o consumo de MS pelo animal.
Quimicamente, o ENN deveria representar o amido e os acares simples e, por isso, a
digestibilidade da FB deveria ser sempre inferior digestibilidade do ENN. No entanto, no
isso que se observa na prtica. Existem vrias evidncias experimentais (SILVA; QUEIROZ,
2006) mostrando maior digestibilidade da FB comparativamente ao ENN. Este fato inviabiliza o
uso deste nutriente como indicador de qualidade diettica. Isto decorre do fato da tcnica
laboratorial de FB no representar todos os carboidratos de degradao lenta presentes no
alimento (VAN SOEST, 1991). Logo, as anlises que compem o sistema de Weende no so
satisfatrias sob o ponto de vista nutricional.

Sistema de nutrientes digestveis totais (NDT)

Como o sistema de Weende apenas quantitativo e no considera as particularidades do
animal e sua capacidade de transformar os nutrientes do alimento, Henry e Morrison
desenvolveram em 1910, o sistema NDT para expressar o valor energtico dos alimentos e
pode ser calculado utilizando-se equaes para estimar a digestibilidade de cada um dos
nutrientes. Essas equaes se baseiam nas seguintes premissas (ANDRIGUETO et al., 1982):
O EE composto por lipdeos e gorduras, que apresentam valor energtico 2,25 vezes
maior que o dos carboidratos.
Todo o N da amostra de origem protica.
A FB representa a frao menos digestvel, ou seja, os componentes estruturais do
alimento.
O ENN representa os carboidratos altamente digestveis.
Dessa maneira, os NDT so obtidos pela soma dos teores de protenas digestveis (PD),
extratos no nitrogenados digestveis (ENND), fibra digestvel (FD) e extrato etreo digestvel
(EED). O EED multiplicado por uma constante de converso de gorduras em energia (2,25).
A frmula de clculo dos NDT a seguinte:
% NDT = %PD + (%EED x 2,25) + % FD + %ENND
Como h necessidade de estimar a digestibilidade dos nutrientes, a determinao do NDT, na
prtica, morosa e cara. Uma maneira mais prtica para se calcular os NDT a partir da
energia digestvel, tomando-se por base que um Kg de NDT produz cerca de 4.400 Kcal de
energia digestvel.
No entanto, a estimativa dos valores energticos dos alimentos correspondente a necessidade
dos animais domsticos e aferidas em NDT so restritas para ruminantes por apresentar as
seguintes falhas:

11

12

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

No mede a energia em unidade energtica e sim em porcentagem.

No considera o incremento calrico.
Em alguns alimentos o EE contm outros compostos alm de lipdeos.
O fator 2,25 para corrigir o valor energtico do EE baseado na relao entre a energia
bruta dos lquidos e a energia bruta dos carboidratos.
No se faz correo para o valor energtico da protena.

Mtodo de Van Soest

Proposto em 1965 por Van Soest, esse mtodo considera que os constituintes das plantas
podem ser divididos em contedo celular (lipdios, compostos nitrogenados, gorduras, amido e
outros compostos solveis em gua) e parede celular (protena insolvel, hemicelulose,
celulose e lignina). O principal diferencial em relao ao mtodo de Weende com relao
anlise de fibra (VAN SOEST, 1994), a qual subdividida em:
Fibra em detergente neutro (FDN): A clula vegetal revestida por uma parede celular rgida
composta basicamente por celulose, mas em clulas adultas esta parede sofre um
espessamento que pode formar uma segunda parede composta por lignina e hemicelulose. O
mtodo de Van Soest consiste, inicialmente, em separar o contedo celular da parede celular.
Isto feito aquecendo-se parte da amostra em soluo de detergente neutro. O contedo
celular solubiliza-se no detergente, enquanto a parede celular no, podendo ser separada por
filtragem. As fraes resultantes so denominadas de solveis em detergente neutro, e so
compostas por protena, nitrognio no protico (NNP), lipdeos, pigmentos, acares, cidos
orgnicos e pectina, e FDN (constituda basicamente por celulose), N ligado fibra,
hemicelulose e lignina.
Fibra em detergente cido (FDA): Quando se utiliza soluo de detergente cido a celulose e a
hemicelulose solubilizam-se e a lignina ligada celulose (lignocelulose) que separada por
filtragem. As duas fraes so denominadas, respectivamente, de solveis em detergente
cido e FDA. A poro solvel integralmente aproveitada por ruminantes ou outros
herbvoros e parcialmente por monogstricos no herbvoros. A FDA a poro menos
digestvel da parede celular das forrageiras pelos microrganismos do rmen, constituda quase
na sua totalidade por lignocelulose, ou seja, lignina e celulose. Logo, a proporo de
hemicelulose determinada pela diferena entre FDN e FDA. A celulose contida na frao
FDA, que parte solvel em detergente cido, quando levada a forno mufla, totalmente
queimada. Com isso, podemos, tambm por diferena entre os pesos, obter a frao de
celulose da amostra.

Determinao de minerais
A determinao de minerais em amostras de alimento pode ser quantificada por
espectrofotometria com relativa preciso. A anlise de macro e microminerais realizada por
digesto nitroperclrica seguida de leitura em espectrofotmetro de absoro atmica com base
em curvas-padro construdas para cada elemento. Os macrominerais (clcio-Ca, fsforo-P,
magnsio-Mg, potssio-K, cloro-Cl, sdio-Na e enxofre-S) so expressos em porcentagem (%) e
os microminerais (ferro-Fe, zinco-Zn, mangans-Mn, iodo-I, selnio-Se, cobre-Cu, cobalto-Co e
cromo-Cr) na base de miligrama por quilo de alimento (mg/Kg) ou em parte por milho (ppm).
As anlises mais comuns so para determinao de Ca e P, pois representam 70% do total de
minerais encontrados no corpo do animal, sendo que 90% destes esto presentes nos ossos e
dentes.

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

A tecnologia NIRS (Near Infra Red System)

O espectrmetro NIR ("Near Infrared Reflectance") um equipamento (Figura 1) de alta preciso
que efetua anlises de alimentos usando o princpio de emisso de radiao eletromagntica. A
energia radiante do infravermelho (IV) empregada para caracterizar substncias orgnicas. O
espectrmetro NIR se baseia na aplicao da matemtica qumica analtica (quimiometria).
Como o espectro sozinho no significa nada existe a necessidade de se criar um banco de
dados com diversas amostras de um mesmo tipo de ingrediente que tenham ampla variabilidade
de seus componentes, montando o que chamamos de curva de predio.

Figura 1. Espectrmetro de refletncia no infravermelho

prximo (NIRS).
Fonte: Foss Nirsystem, Inc. (2010).

So realizadas leituras espectrais em determinados comprimentos de ondas da amostra

estabelecendo-se posteriormente uma correlao entre os resultados das anlises tradicionais
e os espectros conseguidos. Assim por exemplo, consegue-se atravs de um espectro de uma
amostra de milho predizer a sua composio de protena e aminocidos por comparao com
um banco de dados. O mtodo NIRS permite analisar os componentes orgnicos de
ingredientes e produtos, desde que haja um banco de dados robusto o suficiente para
reconhecer as variaes do material analisado. Uma vez montada a curva de predio, a
anlise do espectro torna-se extremamente simples e rpida, sem a necessidade de reagentes
ou diluies. A tcnica permite aumentar significativamente o nmero de dados da
composio dos ingredientes, a um custo muito baixo e em tempo curto o suficiente para que
o dado seja utilizado na formulao das dietas.
Uma vez criada e validada a biblioteca de espectros, sua facilidade de uso e o baixo custo
tornam o mtodo superior s metodologias convencionais. No entanto, por ser uma
metodologia secundria, o NIRS no mais preciso que o mtodo de origem. Alm disso, por
se tratar de um mtodo indireto a calibrao deve ser feita com muito cuidado e com uma
seleo de amostras que tenha variabilidade suficiente para representar toda a faixa de
trabalho, alm das concentraes dos constituintes refletindo sempre nas mesmas frequncias
(CAMPESTRINI, 2005).

Mtodos biolgicos
Digestibilidade
A anlise qumico-bromatolgica o primeiro passo para a determinao do valor nutritivo do
alimento, porm no suficiente para avaliar a capacidade de utilizao destes alimentos pelo
animal. A informao da qualidade do alimento utilizada pelo animal dada por meio da

13

14

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

digestibilidade, que a relao entre a quantidade da frao ingerida do alimento e o que

excretado. Os coeficientes de digestibilidade podem ser estabelecidos para a MS ou energia
ou ento para cada um dos componentes da matria orgnica, tais como PB, EE, ENN, FB ou
FDA e FDN, seus valores so expressos em percentagem.
Nos ensaios de digestibilidade pode-se determinar a digestibilidade aparente e a digestibilidade
verdadeira, sendo que nessa ltima a frao metablica, representada por resduos de
bactrias oriundas do processo fermentativo e substncias endgenas do organismo animal
como enzimas digestivas, clulas de descamao do trato digestrio, sais biliares e sais de
Ca2+ e Mg2+ (sob a forma de sabo combinado com lipdeos), desconsiderado da frao
fecal. Como o resduo metablico mais ou menos constante, se expresso por unidade de
consumo, a diferena entre as digestibilidades aparente e verdadeira so representadas pela
proporo de material metablico fecal. Logo, o termo digestibilidade aparente no se aplica
para a celulose ou a lignina, uma vez que esses componentes no so encontrados na frao
metablica fecal e a digestibilidade aparente representa um valor subestimado, pois alm do
resduo indigestvel da dieta (principalmente parede celular lignificada) apresenta tambm
resduos de material metablico da frao fecal.
Mtodos diretos

Digestibilidade aparente in vitro - tcnica de dois estgios

Essa tcnica consiste em se deixar as amostras em contato com o contedo lquido do rmen
no interior de um tubo de ensaio, onde se tenta reproduzir as condies predominantes do
rmen (presena de microrganismos, anaerobiose, temperatura de 39 C, poder tampo e pH
6,9) durante 24 horas a 48 horas para sofrer o processo de fermentao. A adio de uma
segunda etapa de 48 horas ao mtodo convencional foi proposta por Tilley e Terry (1963) e
recomendvel principalmente para forrageiras de alta digestibilidade e ricas em protena. Neste
estgio se acrescenta soluo cida de pepsina com vistas a desdobrar as protenas.

Digestibilidade verdadeira in vitro

Algumas modificaes e alternativas foram propostas com o objetivo de diminuir o tempo de

anlise e simplificar o procedimento, uma vez que o longo tempo de anlise e o nmero de
etapas so as principais desvantagens do mtodo de dois estgios proposto por Tilley e Terry
(1963). Assim, Van Soest (1994) props a substituio da segunda etapa do processo (48h
com pepsina) in vitro pelo tratamento do resduo da fermentao do detergente neutro. Neste
caso, todo resduo metablico extrado, possibilitando a estimativa da digestibilidade
verdadeira. Com esta modificao, o mtodo mantm a preciso, alm de requerer metade do
tempo despendido no mtodo de Tilley e Terry (1963).

Digestibilidade in vitro e produo de gases

um mtodo indireto para avaliar o desaparecimento da MS de alimentos volumosos pelo resduo

remanescente da digesto microbiana. pela curva de produo de gs obtida pela digesto do
alimento que possvel estimar as taxas de degradaes das fraes solveis (acares solveis e
amido prontamente disponvel) e insolveis (celulose, hemicelulose). Nesse sistema, so obtidas
estimativas do tempo de colonizao, a taxa de degradao e a extenso da degradao mais
rapidamente que em outras tcnicas (CAMPOS et al., 2001). A tcnica utiliza lquido ruminal ou
enzimas digestivas, visando reproduzir as condies favorveis fermentao do rmen-retculo,
como o pH de aproximadamente 6,9, poder tampo, temperatura de 39 C, anaerobiose e
presena de microrganismos para estimar a digestibilidade da MS e fibra (CAMPOS et al., 2004).

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

Este mtodo tem sido bastante utilizado e aperfeioado visando maior preciso com relao
aos resultados in vivo, que por serem realizados no prprio animal vivo so considerados mais
confiveis, porm apresentam inconvenientes, como elevada quantidade de rao, grande
nmero de repeties e alto custo, aumentando a procura pelas tcnicas in vitro (BERCHIELLI
et al., 2006).
A obteno dos parmetros de produo de gases realizada por leituras em tempos prestabelecidos, por meio de um aparelho transdutor de presso, com os valores obtidos
convertidos em volume de gases produzidos. Esta tcnica possibilita a estimao da
digestibilidade do alimento por correlao entre a produo microbiana de gs e a matria
orgnica fermentada e quando se utiliza um sistema computadorizado para monitoramento
automtico da digesto, esse mtodo torna-se prtico e preciso (CAMPOS et al., 2001).
Considerando as vantagens apresentadas pela tcnica de digestibilidade in vitro e as questes
de bem-estar animal, se tem impulsionado a estimativa da produo de gases durante o
processo fermentativo in vitro para avaliao de alimentos para ruminantes, visando a
obteno de resultados acurados, gerando menor impacto ambiental e reduzindo a
necessidade de animais nos experimentos.

Digestibilidade aparente in vivo

Figura 2. Gaiola metablica.

Foto: ngela Cristina Dias Ferreira

Foto: ngela Cristina Dias Ferreira

Foto: ngela Cristina Dias Ferreira

Neste caso, os animais so mantidos em gaiolas metablicas (Figura 2) providas de

comedouros, saleiros, bebedouros e dispositivos para coleta de urina (Figura 3), no caso dos
estudos de balano nitrogenado. Nos ensaios de digestibilidade, os animais so alimentados
durante uma semana com quantidades conhecidas de alimento e a produo de fezes
medida pela coleta total de fezes com o auxlio de sacolas que so adaptadas aos animais,
que evitam a contaminao com a urina (Figura 4).

Figura 3. Coleta de urina.

Figura 3. Coleta total de fezes.

Na determinao da digestibilidade, consideram-se os nutrientes ingeridos e os recuperados

nas fezes, calculando-se o coeficiente de digestibilidade (CD) por diferena:
CD = (Nutriente ingerido Nutriente excretado nas fezes) x 100
Nutriente ingerido
Este mtodo apresenta como principais desvantagens, a necessidade de grande nmero de
animais (pelo menos quatro animais por tratamento) e a elevada demanda de forragem para
alimentao dos mesmos, por esse motivo, a maioria dos ensaios de digestibilidade com
ruminantes so executados com ovinos.

15

16

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

Mtodos indiretos com uso de indicadores ou marcadores

Esta tcnica foi desenvolvida considerando-se a impossibilidade de se fazer a coleta total de
fezes, especialmente no caso de animais mantidos em sistemas de pastejo. O uso de
indicadores em experimentos importante para se estimar o consumo e a excreo fecal, e
com base nesses parmetros determinar a digestibilidade.
A principal caracterstica de um bom marcador que o mesmo seja completamente
recuperado nas fezes. Se no houver uma boa recuperao do marcador, o desaparecimento
do alimento ser a soma da passagem mais a aparente digesto. Neste caso, a aparente
digesto surge do erro resultante da deficincia na recuperao do marcador.
As demais caractersticas desejveis nos marcadores so:
Devem ser substncias indigestveis e no assimilveis pelo organismo.
No apresentar nenhuma ao farmacolgica sobre o trato digestivo.
Deve misturar-se uniformemente com o alimento a ser testado.
Deve ser de fcil quantificao analtica.
De preferncia, ser um componente natural do alimento a ser testado.
O indicador externo mais utilizado o oxido crmico (Cr2O3). Apesar de ser o indicador mais
utilizado, apresenta como desvantagem no se misturar bem dieta.
Os indicadores internos mais utilizados so: lignina, slica e cinza insolvel em detergente
cido (CIA), apresentam as vantagens de ocorrncia natural nos alimentos e no sofrem
variaes acentuadas na excreo fecal, como no caso de indicadores externos.
A estimativa da digestibilidade (D), nesse caso, realizada da seguinte maneira:
D = 100 concentrao do indicador no alimento x nutriente nas fezes x 100
concentrao do indicador nas fezes x nutriente no alimento

Marcadores internos

Os marcadores internos so componentes qumicos que ocorrem naturalmente na dieta do

animal. Devem ser indigestveis e quantitativamente recuperveis nas fezes.
Este mtodo se baseia no fato de que, a medida que o alimento passa pelo trato digestivo, a
concentrao do indicador aumenta progressivamente pela remoo de outros constituintes
por digesto e absoro. O aumento da concentrao proporcional digestibilidade (D) e,
portanto, esta ltima pode ser calculada a partir das concentraes do marcador no alimento e
nas fezes, por meio da seguinte equao:
D = 1 - concentrao do marcador no alimento
concentrao do marcador no alimento
Como marcadores internos tm sido utilizados os seguintes componentes:
Lignina: A lignina um polmero de unidades de fenilpropanides que ocorre na parede celular das
plantas forrageiras. Teoricamente a digestibilidade da lignina igual a zero (lignina verdadeira).
Entretanto, em gramneas jovens e em outras espcies com baixo contedo de lignina, pode-se
encontrar uma aparente digestibilidade para lignina, o que resulta em erros na estimativa da

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

digestibilidade da forrageira. A deficincia da recuperao da lignina nas fezes, decorrente de

alguns fatores, tais como: em gramneas jovens a lignina possui menor grau de polimerizao e os
fragmentos de baixo peso molecular so absorvidos e excretados via urina; a lignina bruta pode
sofrer contaminao de outros componentes do alimento (reao de Mailard); pode ocorrer
formao de material fenlico solvel, alm de que, fraes muito pequenas so perdidas durante
o processo de filtragem.
Na prtica, o uso da lignina bruta com indicador apresenta algumas restries, pelos motivos
citados acima, o que pode ocasionar erros nas determinaes e comprometer a estimativa dos
valores de digestibilidade e consumo.
Alcanas: Alcanas so hidrocarbonetos de cadeia longa (21-37 C) que fazem parte da cutcula
das forrageiras. So razoavelmente indigestveis e recuperveis nas fezes. A simplicidade
relativa da anlise destes compostos por cromatografia de gs e sua relativa inrcia, foram as
razes principais para considerar sua utilizao como marcadores, inicialmente com o
propsito de determinar a digestibilidade da dieta e, posteriormente, para determinao do
consumo de forragem.
Como as alcanas com nmero par de carbonos representam menos de 6% de todas as alcanas
presentes nas plantas, Mayes et al. (1986), propuseram um mtodo para estimao direta do
consumo baseado na combinao do uso de uma alcana como marcador interno e uma alcana
como marcador externo, com tamanho de cadeia similar. O princpio se baseia no uso das alcanas
mpares como marcadores internos e dosificao de alcanas pares como marcadores externos.
Os resultados de Mayes et al (1986), sugeriram que uma estimativa acurada do consumo de
forragem foi possvel com o uso simultneo de alcanas C32, como marcador externo, e C33
como marcador interno (presente no alimento). Evidenciou-se, tambm, que a recuperao do
marcador nas fezes foi proporcional ao tamanho da cadeia de carbonos da alcana.
Para que o consumo de forragem seja estimado com acurcia, tem sido recomendado que a
concentrao de alcanas na forragem deva exceder 50 mg/Kg de MS (LAREDO et al., 1991).
Entretanto, algumas forrageiras tropicais contm quantidades insuficientes de alcanas C33,
nestas espcies, alcanas de cadeia curta podem ser usadas, ocasionando, contudo, reduo
na acurcia da estimativa (LAREDO et al., 1991).
Portanto, apesar de recente, esta tcnica parece promissora, levando-se em conta a boa
preciso de suas estimativas, como demonstrado na literatura (LAREDO et al., 1991).
Entretanto, necessrio maior conhecimento da concentrao de alcanas de cadeia C33 nas
diferentes espcies de gramneas forrageiras, para que uma reduo de acurcia da
determinao da digestibilidade e do consumo, no comprometa a utilizao desta tcnica.
Celulose potencialmente indigestvel e cinza insolvel em cido: Minerais insolveis na dieta animal
aparecem de duas formas: na frao mineral biognica da forragem e da contaminao do solo.
Animais que ingerem solo durante o pastejo tendem a reter partculas minerais no rmen, que
podem posteriormente mascarar a estimativa de cinzas nas fezes. Portanto essa uma importante
fonte de erros quando se utiliza a cinza insolvel em cido para determinao da digestibilidade.
Penning e Johnson (1983) relataram diferenas nas predies da digestibilidade da alfafa
(Medicago sativa) e do azevm (Lolium multiflorum), estimada por meio da cinza insolvel em
cido, quando comparadas com a digestibilidade in vivo. Em alfafa as predies foram
inconsistentes, enquanto que para o azevm foram obtidas melhores estimativas da
digestibilidade. Em decorrncia da alta variabilidade encontrada na estimativa da
digestibilidade para animais recebendo alfafa, os autores concluram pela no recomendao
da cinza insolvel em cido como marcador interno.

17

18

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

A celulose potencialmente indigestvel um marcador interno que permite boa predio da

digestibilidade (PENNING; JOHNSON, 1983). O uso deste marcador apresenta como principais
desvantagens o requerimento de animais fistulados no rumem e o longo tempo necessrio
para que ocorra a digesto das amostras (10 dias). Por isso, esta tcnica parece impraticvel
somente quando a determinao da celulose potencialmente indigestvel requer um grande
nmero de amostras.
Fibra digestvel em detergente cido: Este marcador tem mostrado boa performance na
determinao da digestibilidade de forrageiras.
A obteno da fibra insolvel em detergente cido consiste em incubar a fibra, isolada com
detergente cido, em soluo de celulase. O resduo usado como marcador interno.
Segundo Penning e Johnson (1983) o uso deste marcador, alm de apresentar elevada
preciso na determinao de digestibilidade de forrageiras, relativamente simples, apesar de
necessitar de animais fistulados no rmen.
Van Soest (1994), prope um mtodo simples, no qual apenas a analise fecal necessria
para se determinar a digestibilidade da dieta animal. Na MS fecal, alm do resduo indigestvel
oriundo do alimento, encontrada uma quantidade residual de origem metablica, varivel
com a espcie e condies fisiolgicas do animal e com o consumo, e se fixada espcie, o
valor metablico residual se torna mais ou menos constante. Pesquisas obtidas por Van Soest
(1994), tm mostrado que o valor da constante metablica (Mi) varia de 11,9 a 12,9. A
seguinte relao utilizada para clculo da indigestibilidade (Ra):
Ra = constante metablica (11,9 12,9)
frao metablica das fezes
A frao metablica obtida pelo tratamento da MS fecal com detergente neutro. Neste caso,
o resduo do tratamento representa o material indigestvel do alimento (resduo de origem
alimentar) e a quantidade solubilizada representa a frao metablica oriunda de substncias
endgenas e de bactrias do processo fermentativo.
Obtendo-se a indigestibilidade do alimento, pode-se chegar digestibilidade aparente
subtraindo-se de 100 o valor da digestibilidade. A digestibilidade verdadeira obtida
adicionando-se o valor da digestibilidade aparente constante metablica, ou seja, o valor de
11,9 ou 12,9. Esta uma metodologia simples e rpida, e serve, principalmente para
comparar diferentes tratamentos experimentais.

Marcadores externos

Uma substncia adicionada dieta como marcador conhecida como marcador externo. Pode
ser usado para estudo da digestibilidade, quando adicionado em nvel constante; ou para
estudo sobre taxas de passagem e fluxo da digesta, quando adicionado em doses variadas.
O marcador externo deve ser recuperado completamente nas fezes (logo, deve ser
indigestvel) e no poder ser absorvido pelas paredes do trato digestivo. Alm disso, no deve
afetar o animal ou a digestibilidade do alimento, e deve estar ausente do alimento e do solo.
Vrios marcadores indigestveis tm sido usados em estudos de digesto, entretanto o
material mais comumente utilizado oxido crmico (Cr2O3). A concentrao do oxido crmico
nas fezes alcana o equilbrio seis a sete dias aps a administrao das doses iniciadas e sua
taxa de recuperao pode ser considerada de 100%. O modo de fornecimento pode ser uma
ou duas vezes ao dia em cpsulas de 1 g a 10 g de xido crmico.

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

Como relatado anteriormente, para marcadores internos, possvel estimar consumo de

animais em pastejo pelo mtodo da relao produo fecal/indigestibilidade. Neste caso, a
produo fecal estimada a partir da ingesto diria de cromo e do teor de cromo na matria
orgnica (ou MS) fecal.
Mtodos indiretos in situ
Na tcnica de incubao no rmen de amostras de alimento contidas em bolsas de nilon,
tambm conhecida como tcnica da degradao in situ, o substrato (amostra de alimento)
colocado dentro do rmen de um animal fistulado em sacos de nilon que so firmemente
amarrados em uma corrente contendo um peso (0,5-1,0 kg) na extremidade para evitar que as
bolsas fiquem flutuando sobre o contedo ruminal. Essas bolsas so removidas aps
diferentes perodos de incubao (0, 6, 12, 24, 48 e 72 horas) para se determinar o
desaparecimento da amostra (LUCCI, 1997).
Coloca-se de 3 g a 5 g de alimento modo nas bolsas de nilon de tamanho 6 cm x 15 cm ou
7 cm x 12 cm com porosidade de 50 m. Aps a retirada as bolsas do rmen, estas so
lavadas em gua corrente at a gua sair limpa. Em seguida, so secas em estufa a 55 C por
24 horas. Analisa-se o contedo do nutriente (Ex: MS, FDN, FDA, etc) na amostra e no
resduo remanescente nas bolsas aps a incubao no rmen (CAMPOS et al., 2004).
Os dados de desaparecimento so ajustados por regresso no-linear, que prediz a degradabilidade
potencial (DP) dos alimentos por meio do modelo proposto por Mehrez e rskov (1977):
DP = a + b(1 e-ct)
Onde: a a frao solvel; b, a frao potencialmente degradvel; c, a taxa de degradao da
frao b; e t, o tempo de incubao.
A degradabilidade efetiva (DE) calculada segundo o modelo matemtico proposto por rskov
e McDonald (1979):
DE = a + ((b*c)/(c + k))
Onde: k a taxa estimada de passagem de slidos no rmen (2, 5 ou 8%/h).
Os parmetros no-lineares a, b e c so estimados pelo procedimento algortmico de Gaus
Newton.

Consideraes finais
O conhecimento da composio qumica e da digestibilidade dos alimentos se faz necessrio
para que as dietas sejam formuladas de acordo com os requerimentos nutricionais dos animais
(que varia em funo da categoria) e de acordo com a disponibilidade dos nutrientes presentes
nos alimentos utilizados, a fim de diminuir excrees desnecessrias de nutrientes ou gases
no meio ambiente, o que pode contribuir para elevar impactos ambientais e prejuzos para o
produtor, pois quando se usa alimentos alm do necessrio h uma gasto intil com raes,
pois o excesso no ser utilizado pelo animal e sim desviado para rota de excreo.
Atualmente os comits de tica no uso de animais (CEUAs) dos centros de pesquisas e
universidades atuam cada vez mais, estimulando a diminuio do uso de animais em
experimento por questes relacionadas a m manipulao e uso de nmero excessivo de

19

20

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

animais. Isso torna cada vez mais vivel a busca por tcnicas de avaliao de alimentos in
vitro, o que implica em desenvolvimento de tcnicas mais elaboradas para tais anlises, pois
revistas cientficas de alto padro j exigem que os trabalhos submetidos, apresentem na
metodologia o protocolo de envio a CEUA e liberao para execuo do experimento.

Referncias
ANDRIGUETTO, J. M.; PERLY, L.; MINARDI, I.; GEMAEL, A.; FLEMMING, J. S.; SOUZA, G. A. de; BONA FILHO, A.
Nutrio animal: as bases e os fundamentos da nutrio animal - os Alimentos, Vol. I, So Paulo:Nobel, 1982. 395 p.
BERCHIELLI, T. T.; PIRES, A. V.; OLIVEIRA, S. G. de. Nutrio de ruminantes. Jaboticabal: Funep, 2006. 583 p.
BRUM, A. A. S. Mtodos de extrao e qualidade da frao lipdica. 2004. 66 f. Dissertao (Mestrado em Cincia e
Tecnologia de Alimentos) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/USP, Piracicaba.
CAMPESTRINI, E. Utilizao de equipamento NIRS (Near Infrared Reflectance Spectroscopy) nos estudos de valores nutricionais
(composio qumica e digestibilidade) de alimentos para no ruminantes. Revista Eletrnica Nutritime, v. 2, n. 5, p. 240-251,
2005. Disponvel em: <http://www.nutritime.com.br/arquivos_internos/artigos/042V4N2P395_404_MAR2007.pdf>.
Acesso em: 12 mar. 2010.
CAMPOS, F. P.; SAMPAIO, A. A. M.; VIEIRA, P. F.; BOSE, M. L. V. Digestibilidade in vitro/gs de volumosos exclusivos ou
combinados avaliados pelo resduo remanescente da digesto da matria seca e produo de gs. Revista Brasileira de
Zootecnia, Viosa-MG, v. 30, n. 5, p. 1579-1589, 2001. Disponvel em: <http://www.scielo.br/pdf/rbz/v30n5/6699.pdf>.
Acesso em: 18 mar. 2010.
CAMPOS, F. P. de; NUSSIO, C. M. B.; NUSSIO, L. G. Mtodos de anlise de alimentos. Piracicaba: FEALQ, [2004].
135 p.
FOSS NIRSTYSTEM, INC. Pgina institucional. Disponvel em: <http://www.foss-nirsystems.com/nutraceuticals.html>.
Acesso em: 10 mar. 2010.
HORWITZ, W. (Ed.). Official methods of analysis of AOAC International. 17th ed. Gaithersburg, MD: AOAC
International, 2000. 2v.
LAREDO, M. A.; SIMPSON, G. D.; MINSON, D. J. The potential for using n-alkanes in tropical forages as a marker for
the determination of dry matter by grazing ruminants. Journal of Agricultural Science, Tokio, v. 117, p. 355-361,
1991.
LUCCI, C. de S. Nutrio e manejo de bovinos leiteiros. So Paulo: Manole, 1997. 169p.
MAYES, R. W.; LAMB, C. S.; COLGROVE, P. M. The use of dosed and herbage n-alkanes as markers for the
determination of herbage intake. Journal of Agricultural Science, Tokyo, v. 107, p. 161-170, 1986.
MEHREZ, A. Z.; RSKOV, E. R. A study of the artificial fiber bag tecnique for determining the digestibility of feeds in
the rumen. Journal of Agricultural Science, Tokio, v.88, n.3, p.645-650, 1977.
RSKOV, E. R.; McDONALD, I. The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements
weighted according to rate of passage. Journal of Agricultural Science, Cambridge, v.92, n.2, p.499, 1979.
PASTORINI, L. H.; BACARIN, M. A.; ABREU, C. M. Secagem de material vegetal em forno de microondas para
determinao de matria seca e anlises qumicas. Cincia Agrotcnica, Lavras, MG, v. 26, n. 6, p. 1252-1258,
2002. Disponvel em: <http://www.editora.ufla.br/site/_adm/upload/revista/26-6-2002_18.pdf>. Acesso em: 18
mar. 2010.
PENNING, P. D.; JOHNSON, R. H. The use of internal markers to estimate herbage digestibility and intake. 1. Potentially
indigestible cellulose and acid insoluble ash. Journal of Agricultural Science, Tokio, v. 100, p. 127-31, 1983.
SILVA, D. J.; QUEIROZ, A. C. de. Anlise de alimentos: mtodos qumicos e biolgicos 3. ed. Viosa, MG: UFV,
2006. 235 p.
TILLEY, J. M. A.; TERRY, R. A. A twostage technique for the in vitro digestion of forage crops. Journal British
Grassland Society, Oxford, v. 18, n. 2, p. 104-111, 1963.
VAN SOEST, P.J. Nutritional ecology of the ruminant. 2.ed. New York: Cornell University Press, 1994. 476p.

Metodologias para avaliao de alimentos para ruminantes domsticos

VAN SOEST, P. J.; ROBERTSON, J. D.; LEWIS, B. A. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, nonstarch
polysaccharides in relation to animal nutrition. Journal of Dairy Science, Chanpaign, v. 74, p. 3583- 3597, 1991.
ZENEBON, O.; PASCUET, N. S.; TIGLEA, P. (Coord.). Mtodos fsico-qumicos para anlise de alimentos. 4. ed.; verso
digital. Braslia, DF: Ministrio da Sade, 2008. 1020 p. Disponvel em: <http://www.ial.sp.gov.br/index.php?option=
com_remository&Itemid=0&func=startdown&id=1>. Acesso em: 20 abr. 2010.

21

Rondnia