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REVISIN DE TEMA
Resumen
La histoplasmosis, micosis sistmica y endmica
en una amplia zona de las Amricas, es causada
por el hongo dimrfico Histoplasma capsulatum.
Tradicionalmente, el diagnstico de esta entidad
se realiza por mtodos microbiolgicos directos y
biopsias que emplean una variedad de coloraciones especiales tales como Wright, Giemsa y plata
metenamina, entre otras, as como por cultivo;
este ltimo representa el estndar de oro. Se emplean, igualmente, mtodos indirectos que incluyen la deteccin de anticuerpos y antgenos. Los
valores de sensibilidad y especificidad en ambos
mtodos son variables, y los resultados dependen,
a su vez, de la forma clnica de la enfermedad que
presente el paciente y de su estado inmune.
Recientemente, la biologa molecular ha permitido introducir nuevas herramientas que han
sido utilizadas para la deteccin e identificacin
de H.capsulatum, una de ellas es la PCR anidada
que se caracteriza por sus altos niveles de sensibilidad y especificidad. De igual forma, estas
1 Grupo de Micologa Mdica y Experimental, Corporacin para
Investigaciones Biolgicas (CIB), Escuela de Microbiologa,
Universidad de Antioquia, y Escuela de la Salud, Universidad
Pontificia Bolivariana (UPB), Medelln, Colombia.
tcnicas moleculares han permitido realizar anlisis evolutivos, estudios de diversidad gentica
y un sinnmero de estudios de epidemiologa
molecular, a partir de los cuales se ha logrado
recopilar informacin valiosa sobre la variabilidad gentica de este microorganismo.
En esta revisin se describen los mtodos de
laboratorio convencionales y las tcnicas moleculares ms empleadas para el diagnstico de
la histoplasmosis; as como tambin algunas de
sus aplicaciones en la epidemiologa y biologa
molecular de este hongo.
Palabras claves: Histoplasma capsulatum,
Histoplasmosis, Diagnstico, Tcnicas convencionales, Diagnstico molecular.
Abstract
Histoplasma capsulatum is the causative agent of
histoplasmosis, a systemic and endemic mycosis
Correspondencia:
Angel Gonzlez, Grupo de Micologa Mdica y Experimental,
Corporacin para Investigaciones Biolgicas (CIB), Carrera
72A # 78 B 141, Medelln, Colombia. Tel.: 057-4-441 08
55 ext 206; Fax: 057-4- 441 55 14. Direccin electrnica:
agonzalezm@cib.org.co
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Introduccin
La histoplasmosis, una micosis sistmica y endmica en una amplia zona de las Amricas, es causada
por la inhalacin de las partculas infectantes del
hongo dimrfico trmico Histoplasma capsulatum. En la naturaleza, este hongo crece en forma
filamentosa, pero una vez ingresa a los tejidos del
hospedero, se convierte en levadura (1-5). El dimorfismo, considerado un factor de virulencia, es de
particular inters puesto que es necesario tanto
para su adaptacin a los tejidos como para el de-
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Deteccin e identificacin de Histoplasma capsulatum por el laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas moleculares
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Deteccin e identificacin de Histoplasma capsulatum por el laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas moleculares
A.2. Cultivos para el aislamiento de H. capsulatum: para realizar este tipo de pruebas, el laboratorio clnico debe estar equipado con cmaras
de bioseguridad nivel II-III y personal de laboratorio capacitado en la manipulacin del hongo,
debido a que los cultivos de H.capsulatum, en su
fase miceliar, permiten la generacin de microconidias (partculas naturalmente infectantes).
Los medios de cultivo usualmente utilizados en
los laboratorios de micologa para aislar este
hongo son: el agar de infusin de cerebro y
corazn (BHI del ingls brain heart infusin)
con una fuente de sangre (generalmente de
carnero) ms antibiticos y ciclohexamida, y el
Sabouraud dextrosa agar ms cicloheximida y
cloramfenicol (Mycosel, BBL). En estos medios,
la cicloheximida inhibe el crecimiento de hongos
saprofticos contaminantes mientras que los antibiticos frenan el desarrollo de bacterias.
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Los cultivos presentan tambin valores de sensibilidad variable que dependen de la forma clnica de
la micosis y pueden alcanzar hasta un 85% de sensibilidad en los casos de histoplasmosis pulmonar
crnica y diseminada (tabla 1) (3,10,16,17,25,44-46). Estos
cultivos tienen varias limitaciones entre las que se
cuentan resultados falsos negativos en el 20% de
los casos de histoplasmosis diseminada y hasta del 50% en los de histoplasmosis pulmonar
crnica (3,29); la sensibilidad es ms baja en pacientes con formas agudas y leves de la micosis.
Adems, este microorganismo es de crecimiento
lento, pues requiriere entre tres y seis semanas
para su aislamiento en los medios de cultivo antes descritos (3,10,17,25,44-48).
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Pruebas de laboratorio
HPA
HPC
HPD
Coloraciones especiales*
10
17-40
43
Cultivos
15
50-85
50-85
Serologa**
95
90-100
70-80
25-75
15-22
92
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Sensibilidad
(%)
Especificidad
(%)
94,3
72,8
70-80
70-80
76
23
95
95
Fijacin de complemento
- Antgeno fase levadura
- Antgeno fase micelio
Inmunodifusin:
- Banda M
- Banda H
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Serologa
ID
FC
Deteccin de Ag
Antigenuria
Antigenemia
Sida
Otra*
71-100
85-97
58-60
60-70
57-77
60-79
80
67
95
86
82
60
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Tabla 4. Genes blanco y secuencias de los oligonucletidos utilizados para el diagnstico molecular de la histoplasmosis
Tamao del
producto (bp)
Sen/Esp (%)
Referencia
429
89/77
67
391
69-100/90-100
67,69,70,79
3. 100kDa /
PCR-EIA
99
7/100
76
4. Antgeno M /
PCR
111
100/100
71
5. Antgeno M /
PCR
279
100/100
71
6. Antgeno H /
PCR semi-anidada
330
No reportada
72
7. ITS-rRNA /
PCR anidada*
308
100
74
8. ITS1-rDNA /
RT-PCR**
182
78-100/100
75,78
Gen/Tipo de PCR
1. 18S rRNA /
PCR anidada
2. Protena 100-kDa/
PCR anidada
231
210
*Combinado con: A (5-CAC GCC GTG GGG GGC TGG GAG CCT-3 y 5-CGG TGT CCC CGG CGG ACA CGG GCC C-3), B (5-GGG CCC GTG TCC GGG GAC
ACC GG-3 y 5-CCC GGA ATA TCC AGG GGG CGC AA-3), y C (5-TGA TTG GCG TCTGAGCAT G-3 y 5-ATG GTG GGC RGGAGCCGGCC-3).
**Combinado con las sondas FRET: HC1-Fluos 5- GTC GGT GAA CGA TTG GCG T-3 y HC1-Red 5- LCRED640-GAG CAT GAG AGC GAT AAT AAT CCA GT-3.
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Deteccin e identificacin de Histoplasma capsulatum por el laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas moleculares
Conclusiones
Debido a la alta tasa de morbi-mortalidad que
presenta la histoplasmosis y al difcil manejo teraputico, se hace necesario desarrollar nuevas
herramientas que permitan hacer un diagnstico ms rpido y oportuno. Estas nuevas metodologas moleculares para el diagnstico de la
micosis han sido bien descritos y las pruebas son
razonablemente sensibles y especficas; y estn
implementadas en varios laboratorios del mundo. En Colombia, el Laboratorio de Micologa
Mdica y Experimental de la Corporacin para
Investigaciones Biolgicas (CIB) de Medelln,
ha venido implementando estas metodologas
en los ltimos aos (70) y ofrece dentro de su
portafolio de servicios pruebas moleculares
para el diagnstico de sta y otras micosis.
Adicionalmente, y en conjunto con la Red Iberoamericana de Diagnstico Molecular de las
Micosis Endmicas, Oportunistas y Emergentes
(Red Micomol), se viene realizando una serie de
talleres cuyo objetivo es tratar de hacer la transferencia tecnolgica de estas metodologas a
otros laboratorios de la ciudad y del pas (http:/
/www.micomol-cyted.org). Por lo tanto, creemos
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Posible forma
clnica de
histoplasmosis
Hospedero ANORMAL
Inmunocompetente
Defecto
estructural
Defecto
inmune
Pulmonar
aguda
Pulmonar
crnica
Pulmonar
diseminada
FC 95%
FC 100%
PCR 100%
ID 95%
ID 100%
Antigenuria 95%
PCR 100%
Cultivo 50-85%
Cultivo 50-85%
FC 60-70%
Pruebas de
laboratorio (y
su sensibilidad)
para confirmar el
diagnstico de
acuerdo al tipo de
paciente y forma
Tinciones 17-40%
ID 58-60%
Antigenuria 15-22%
Tinciones 43%
clnica de la micosis
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