Universidade Tecnolgica Federal do Paran

Campus Campo Mouro

Coordenao de Alimentos
Disciplina de Microbiologia
Profa. Mrcia R. F. G. Perdoncini

AULA PRTICA n

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

Introduo
Os meios de cultura destinam-se ao
cultivo artificial dos microrganismos e fornecem
os princpios indispensveis ao seu crescimento.
As exigncias nutritivas esto relacionadas a
uma fonte de carbono, de nitrognio, de energia
e de sais minerais. Alguns microrganismos
tambm necessitam de fatores de crescimento,
substncias que eles no podem sintetizar, tais
como vitaminas, aminocidos, entre outras. Alm
disso, alguns meios podem ser formados por
preparados de sangue, de carne, de leite e de
vrios outros produtos.
O gar, agente solidificante largamente
usado, formado por extrato de algas marinhas,
funde-se em torno do ponto de ebulio da gua,
formando uma soluo transparente que
permanece no estado lquido at em torno de
40C. Uma vez eu a maioria dos microrganismos
no morta a 45C, eles podem ser adicionados
a um meio com Agar ainda liquefeito em tubos de
ensaio ou placas de Petri. Depois que o meio
com Agar se resfria e se solidifica, ele
permanecer solidificado a temperaturas de
incubao e pode ser inoculado com
microrganismos. O Agar no serve como
nutriente para a maioria dos microrganismos e
no metabolizado durante o crescimento.
Existem
algumas
observaes
importantes no preparo de meios de cultura:
No se pode manter o meio de cultura
temperatura ambiente em uma soluo
no-esterilizada por mais de uma hora,
devido possibilidade de evaporao da
gua e de crescimento microbiano.
Frascos de meios de cultura desidratados
so altamente higroscpicos, portanto
mant-los em ambientes secos e o menor
tempo possvel abertos.
Seguir sempre as orientaes do
fabricante;
Utilizar sempre o frasco mais antigo do
estoque;
Proteger os frascos da luz;
Desprezar meios que apresentem sinais
de hidratao;
Observar data de validade;

Pesar precisamente os componentes do

meio e em equipamento adequado;
Utilizar somente gua destilada, ou
deionizada, ou tratada por osmose
reversa;
Afrouxar as tampas dos frascos e tubos
para autoclavao;
Respeitar o mximo de material a ser
esterilizado;
Verificar aps esterilizao (quando
necessrio) o valor de pH da preparao,
cor, estabilidade e consistncia.
Incubar amostra representativa do lote;
Incubao de controle branco a cada
inoculao;
Armazenamento aps preparo longe da
luz, em local limpo e evitar perda de
umidade;
Descartar se apresentar perda de
umidade, mudana de cor ou crescimento
microbiano;
Registrar SEMPRE a data de preparao.
Validades:
Distribudos em placas, armazenar de 4 a
12C por uma semana;
Suplementos/reagentes estreis- 3 meses
de validade sob refrigerao;
Meios completos e basais ainda no
suplementados3
meses
sob
refrigerao; 1 ms a temperatura
ambiente.

Fuso do gar
Banho-maria ou processo que seja
efetivo;
Aquecimento o tempo mnimo necessrio;
Armazenamento de 45-49C por no
mximo 4 horas;
No fundir novamente se solidificado.
Adio de suplementos
Meio resfriado a 45-49C;
Se retirados do refrigerador aguardar
atingir temperatura ambiente;
No reaquecer.
Distribuio em placas
Camadas de aproximadamente
2mm;
Superfcie fria e plana para solidificao.
MATERIAIS
Agar (tubos inclinados) e caldo nutriente;
Caldo EC;
Agar batata dextrose (PDA);
cido tartrico 10%;
gua destilada.

PROCEDIMENTO
Prtica
Preparo de meio lquido: caldo EC e caldo AN
Pesar o meio de cultura em papel
alumnio e, a seguir, transferi-lo para um
balo de fundo chato;
Verter sobre o papel de filtro uma
pequena quantidade de gua para
arrastar todo o meio;
Adicionar gua deionizada ou destilada ao
meio de cultura;
Colocar a boneca nos bales e a coifa de
papel com o nome do meio e a data;
Autoclavar a 121C por 15 minutos;
Distribuir em tubos esterilizados a
quantidade necessria para anlise.
OBS.: ACOMPANHAR O PROCESSO DE
ESTERILIZAO!!!!
Prtica
Preparo de meio slido (Agar nutriente e PDA)
Pesar o meio de cultura em papel
alumnio e, a seguir, transferi-lo para
um balo de fundo chato;
Verter sobre o papel de filtro uma
pequena quantidade de gua para
arrastar todo o meio;
Adicionar gua deionizada ou gua
destilada ao meio de cultura;
Levar o balo com o meio para um
banho-maria
a
60C
durante
20minutos. A cada 3 minutos,
homogeneizar para a dissoluo do
meio de cultura;
1. Para o PDA
Colocar a boneca nos bales e a coifa
de papel com o nome do meio e a
data;
Autoclavar a 121C por 15 minutos;
Aps a autoclavagem, levar o meio
para um banho-maria a 50C at o
momento do uso.
2. Para o Agar nutriente:
Distribuir em tubos e autoclavar a
121C por 15 minutos;
Aps a autoclavagem, inclinar tubos.
OBS.:Plaqueamento: Agar PDA
Destampar o balo na zona estril de
um bico de Bunsen, flambando a
boca para impedir a entrada de
eventuais microrganismos;
Resfriar at a 46-48C. Adicionar
cerca de 1,5 mL de soluco aquosa
de cido tartrico 10% para cada 100
mL, de forma a baixar o pH at 3,5.
Verter entre 18mL e 20mL do meio de
cultura em placas de Petri estreis

com tcnica assptica;

Deixar a placa em posio horizontal
at que o meio de cultura se
solidifique completamente;
Armazenar as placas em posio
invertida na geladeira.

EXERCCIOS DE FIXAO
1. Por que os microbiologistas utilizam meios
quimicamente definidos?
2. Por que o Agar o agente solidificante
ideal para uso em microbiologia?
3. Qual a constituio do Agar? Qual a
finalidade da sua incorporao nos meios
de cultura?
4. Quando um microbiologista utiliza um
meio de enriquecimento para o cultivo de
microrganismos?
5. Qual a composio dos meios EC, PDA e
Agar
nutriente?
Quais
as
suas
finalidades?
6. Por que tem que abaixar o pH do meio
PDA aps a esterilizao para sua
posterior utilizao?
REFERNCIAS
OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologiaroteiros de aulas prticas. So Paulo: Tecmedd,
2008.